آماده‌سازی نمونه‌های FFPE با ظرفیت پردازش بالا: استخراج پروتئین و برش اسیدهای نوکلئیک
شرکت Hielscher Ultrasonics با سونیکاتور دارای ظرفیت پردازش بالای UIP400MTP، چالش‌های آماده‌سازی بافت تثبیت‌شده با فرمالین و قالب‌گیری‌شده در پارافین (FFPE) را برطرف می‌کند. بیاموزید که چگونه فراصوت‌دهی، تعداد زیادی از نمونه‌های FFPE را برای پارافین‌زدایی، لیز بافت، همگن‌سازی، استخراج پروتئین و برش DNA/RNA پردازش می‌کند! از آماده‌سازی فراصوتی بافت FFPE بهره‌مند شوید – پردازش تعداد زیادی نمونه در پلیت‌های چندچاهکی! نمونه‌هایی با کیفیت بالا و تعداد زیاد برای دستیابی به نتایج پژوهشی قابل‌اعتماد به دست آورید! و در نهایت، در زمان و هزینه نیز صرفه‌جویی کنید!
تسهیل آماده‌سازی نمونه‌های FFPE با فراصوت‌دهی دارای ظرفیت پردازش بالا
تثبیت با فرمالین و قالب‌گیری در پارافین (FFPE)، رایج‌ترین روش نگهداری و بایگانی بافت‌های جامد است. استخراج زیست‌مولکول‌ها از نمونه‌های بافت FFPE، به‌دلیل کیفیت نمونه‌های نگهداری‌شده، اغلب با چالش‌های قابل‌توجهی همراه است. این نمونه‌ها که منابعی ارزشمند در زیست‌شناسی مولکولی و پژوهش‌های بالینی هستند، منبعی غنی از اطلاعات زیستی برای مطالعات گذشته‌نگر و اعتبارسنجی نشانگرهای زیستی تشخیصی فراهم می‌کنند. بااین‌حال، فرایند تثبیت با فرمالین و قالب‌گیری در پارافین، ضمن حفظ معماری و ریخت‌شناسی بافت، استخراج اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌های باکیفیت را دشوار می‌کند. فرمالین موجب ایجاد پیوندهای عرضی در اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌ها می‌شود که به قطعه‌قطعه‌شدن مولکول‌ها و تغییرات شیمیایی می‌انجامد. بیاموزید که سونیکاتور دارای ظرفیت پردازش بالای UIP400MTP چگونه بر چالش‌های آماده‌سازی نمونه‌های FFPE غلبه می‌کند!
سونیکاتور برای آماده‌سازی کارآمد نمونه‌های FFPE
- گردش کار آسان: فرایندهای ساده‌شده و کاربرپسند.
- پارافین‌زدایی، استخراج پروتئین، برش DNA / RNA
- پردازش سریع با ظرفیت بالا: پردازش کارآمد پلیت‌های چندچاهکی.
- پارافین‌زدایی مؤثر: بهبود محلول‌سازی پروتئین‌ها.
- حلال‌های غیرسمی: بی‌نیازی از استفاده از حلال‌های آلی زیان‌آور مانند زایلن.
سونیکاتور دارای ظرفیت پردازش بالای UIP400MTP برای پردازش نمونه‌های FFPE با ظرفیت بالا در پلیت‌های چندچاهکی
پیشرفت‌ها در روش‌های استخراج پروتئین از بافت FFPE
شرکت Hielscher Ultrasonics چالش‌های آماده‌سازی نمونه‌های FFPE با ظرفیت پردازش بالا را برطرف می‌کند. فراصوت‌دهی با استفاده از امواج فراصوت، ارتعاشات مکانیکی و کاویتاسیون متمرکز ایجاد می‌کند و بدین‌ترتیب ساختارهای سلولی را به‌طور مؤثر تخریب کرده و محلول‌سازی زیست‌مولکول‌ها را بهبود می‌بخشد. این روش به‌دلیل توانایی افزایش کارایی و بازده استخراج اسیدهای نوکلئیک و پروتئین از بافت‌های FFPE و همچنین برش DNA و RNA برای آماده‌سازی کتابخانه، رواج یافته است. تأکید بر این نکته بسیار مهم است که فراصوت‌دهی با سونیکاتور پلیت چندچاهکی UIP400MTP، یکپارچگی این زیست‌مولکول‌ها را برای کاربردهای پایین‌دستی حفظ می‌کند.
برش اسیدهای نوکلئیک با فراصوت‌دهی دارای ظرفیت پردازش بالا
سونیکاتور چندچاهکی UIP400MTP برای استفاده در محیط‌های دارای ظرفیت پردازش بالا، آماده‌سازی نمونه‌های FFPE را به سطح تازه‌ای می‌رساند. این روش فراصوت‌دهی پلیت چندچاهکی، راهکاری کارآمد و قابل‌اعتماد برای پردازش هم‌زمان چندین نمونه ارائه می‌دهد. این روش استخراج سریع و تکرارپذیر DNA، RNA و پروتئین‌ها را تسهیل می‌کند؛ موادی که برای روش‌های تحلیلی مختلف، از جمله توالی‌یابی نسل جدید (NGS)، PCR کمی و تحلیل‌های پروتئومیک، حیاتی هستند. بهینه‌سازی پارامترهای فراصوت‌دهی، مانند دامنه، مدت‌زمان و دما، کیفیت و کمیت زیست‌مولکول‌های استخراج‌شده را بیش‌ازپیش بهبود می‌بخشد.
سونیکاتور UIP400MTP برای پلیت‌های چندچاهکی، مزایای قابل‌توجهی برای قطعه‌قطعه‌سازی و برش DNA و RNA از بافت FFPE ارائه می‌دهد. یکی از ویژگی‌های برجسته این سامانه، توانایی دستیابی به قطعات DNA و RNA با توزیع اندازه باریک است؛ شدت فراصوت‌دهی را می‌توان با دقت تنظیم کرد تا قطعات کوتاه 150-200 جفت‌باز (bp) یا قطعات بلندتر 15-20 کیلو جفت‌باز (kbp) به دست آید. این انعطاف‌پذیری، UIP400MTP را هم برای توالی‌یابی با خوانش کوتاه و هم برای توالی‌یابی با خوانش بلند به ابزاری ضروری تبدیل می‌کند و نتایج باکیفیت را برای توالی‌یابی نسل جدید (NGS) و توالی‌یابی کل ژنوم (WGS) تضمین می‌کند. کنترل دقیق اندازه قطعات برای پژوهشگران تمامی حوزه‌های ژنومیک حیاتی است، زیرا امکان آماده‌سازی نمونه‌ها مطابق با مشخصات موردنیاز را فراهم می‌کند.
برای راهکارهای پیشرفته در زمینه بافت FFPE با ما تماس بگیرید
با سونیکاتور پلیت چندچاهکی UIP400MTP آشنا شوید؛ ابزاری برای بازیابی کارآمد زیست‌مولکول‌ها از نمونه‌های FFPE، همراه با حفظ یکپارچگی اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌های استخراج‌شده و تضمین تکرارپذیری نتایج. این فناوری به‌راحتی با سایر گردش‌های کار آماده‌سازی و تحلیل ادغام می‌شود و بررسی‌های مولکولی با استفاده از آرشیوهای بافت FFPE را ساده‌تر و مؤثرتر می‌کند.
تثبیت‌کننده‌ها و اثرات آن‌ها
تثبیت، مرحله‌ای حیاتی در آماده‌سازی نمونه است که ساختارهای سلولی را حفظ می‌کند، واکنش‌های بیوشیمیایی را متوقف می‌سازد و از تخریب جلوگیری می‌کند. بسته به نیازهای ویژه هر آزمایش، تثبیت‌کننده‌های مختلفی به کار می‌روند. دو تثبیت‌کننده رایج‌تر، فرمالدهید و پارافرمالدهید هستند که با ایجاد پیوندهای عرضی در پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک، ریخت‌شناسی و خاصیت آنتی‌ژنی سلول‌ها و بافت‌ها را حفظ می‌کنند. سایر تثبیت‌کننده‌ها، مانند اتانول، متانول و گلوتارآلدهید، برای کاربردهای خاص استفاده می‌شوند.
تثبیت‌کننده‌های فرمالدهید و پارافرمالدهید بین گروه‌های آمینی پل‌های متیلنی ایجاد می‌کنند که به تشکیل پیوندهای عرضی در پروتئین‌ها می‌انجامد. این فرایند اجزای سلولی را به‌طور مؤثر بی‌حرکت می‌کند و یکپارچگی آن‌ها را در مراحل بعدی تحلیل حفظ می‌کند. اثرات این تثبیت‌کننده‌ها می‌تواند تحت‌تأثیر عواملی مانند غلظت، pH و دما قرار گیرد و بهینه‌سازی این پارامترها برای تضمین حفظ بهینه ساختارهای سلولی حیاتی است.
مزایای آماده‌سازی فراصوتی FFPE
فراصوت‌دهی روشی قدرتمند برای تخریب سلول‌ها و بافت‌های تثبیت‌شده است که از روش‌های متداول برتر است. این روش در مقایسه با روش‌های سنتی لیز، چندین مزیت قابل‌توجه دارد:
- سرعت و کارایی: لیز فراصوتی، تخریب سریع سلول‌ها و بافت‌ها را فراهم می‌کند و در مقایسه با روش‌های مکانیکی یا شیمیایی لیز، زمان پردازش را به‌طور چشمگیری کاهش می‌دهد. امواج صوتی پربسامد تولیدشده توسط پروب فراصوتی، نیروهای برشی مکانیکی ایجاد می‌کنند که موجب تخریب ساختارهای سلولی تثبیت‌شده می‌شوند. این تخریب سریع و کارآمد به پژوهشگران امکان می‌دهد حجم زیادی از نمونه‌ها را در زمانی کوتاه پردازش کنند.
- ملایم و قابل‌تنظیم: لیز فراصوتی سازوکاری ملایم برای تخریب فراهم می‌کند که آسیب به زیست‌مولکول‌های حساس مانند پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک و آنزیم‌ها را به حداقل می‌رساند. برخلاف روش‌های مکانیکی که گرما یا نیروهای برشی بیش‌ازحد ایجاد می‌کنند، لیز فراصوتی از کاویتاسیون کنترل‌شده برای تخریب سلول‌ها استفاده می‌کند و درعین‌حال یکپارچگی و عملکرد اجزای درون‌سلولی را حفظ می‌کند.
- انعطاف‌پذیری کاربرد: لیز فراصوتی را می‌توان برای نمونه‌های تثبیت‌شده با تثبیت‌کننده‌های مختلف به کار برد و به پژوهشگران امکان داد با طیف گسترده‌ای از نمونه‌های تثبیت‌شده کار کنند. چه از فرمالدهید و پارافرمالدهید استفاده شود و چه از تثبیت‌کننده‌های جایگزین، لیز فراصوتی همواره تخریب کارآمدی فراهم می‌کند و بازیابی بهینه اجزای سلولی را تضمین می‌کند.
- بازده و کیفیت بالا: لیز فراصوتی به‌دلیل توانایی تخریب یکنواخت سلول‌ها و بافت‌های تثبیت‌شده، دستیابی به بازده بالای اجزای سلولی سالم را تسهیل می‌کند. این ویژگی موجب می‌شود کاربردهای پایین‌دستی، مانند تحلیل پروتئین، استخراج اسیدهای نوکلئیک و سنجش‌های آنزیمی، نتایجی قابل‌اعتماد و تکرارپذیر ارائه دهند.
- سازگاری با خودکارسازی: لیز فراصوتی را می‌توان به‌آسانی در سامانه‌های خودکار ادغام کرد و پردازش نمونه‌ها با ظرفیت بالا را امکان‌پذیر ساخت. این سازگاری به پژوهشگران اجازه می‌دهد گردش کار خود را ساده‌تر کنند و بهره‌وری را، به‌ویژه در مطالعات بزرگ‌مقیاس، افزایش دهند.
سونیکاتور پلیت 96 چاهکی UIP400MTP برای فراصوت‌دهی پلیت‌های میکروتیتر و چندچاهکی
لیز فراصوتی با ارائه مزایای متعدد نسبت به روش‌های سنتی لیز، تخریب سلول‌ها و بافت‌های تثبیت‌شده را متحول کرده است. سرعت، کارایی، گزینش‌پذیری، انعطاف‌پذیری کاربرد، بازده بالا و سازگاری آن با خودکارسازی، این روش را به ابزاری ضروری در پژوهش‌های زیست‌شناسی مولکولی و زیست‌فناوری تبدیل کرده است. شرکت Hielscher Ultrasonics با ارائه سونیکاتورهای غیرتماسی و همچنین سونیکاتورهای پروبی، مناسب‌ترین هموژنایزر فراصوتی را برای کاربرد شما در علوم زیستی عرضه می‌کند. چه بخواهید نمونه‌های تکی، چندین نمونه یا تعداد بسیار زیادی از نمونه‌ها را به‌طور هم‌زمان پردازش کنید، بهترین سونیکاتور متناسب با نیازهای پژوهشی و تشخیصی شما را ارائه خواهیم داد.
درباره سونیکاتورهای غیرتماسی Hielscher برای آماده‌سازی چندین نمونه و آماده‌سازی نمونه‌ها با ظرفیت پردازش بالا بیشتر بخوانید!
- سرمایه‌گذاری یک‌باره
- از اقلام مصرفی خود استفاده کنید
- بدون هزینه‌های تکرارشونده برای لوازم جانبی و اقلام مصرفی اختصاصی
- ظرفیت پردازش بالا
- کنترل دقیق
- فناوری روز
- قابلیت اطمینان و استحکام
- کنترل دقیق و قابل‌تنظیم فرایند
- رده صنعتی: قابلیت کارکرد پیوسته به‌صورت 24/7
- کاربری آسان و ایمن
- نیاز اندک به نگهداری
سونیکاتور پلیت UIP400MTP برای هر نوع پلیت 96 چاهکی، پلیت میکروتیتر و پلیت چندچاهکی.
طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان
سونیکاتورهای Hielscher به بالاترین استانداردهای کیفیت و طراحی شهرت دارند. استحکام و کاربری آسان، ادغام بی‌دردسر سونیکاتورهای ما در تأسیسات صنعتی را امکان‌پذیر می‌کند. سونیکاتورهای Hielscher به‌آسانی از عهده شرایط سخت و محیط‌های پرتقاضا برمی‌آیند.
شرکت Hielscher Ultrasonics دارای گواهینامه ISO است و بر سونیکاتورهای پربازده مجهز به فناوری روز و دارای کاربری آسان تأکید ویژه‌ای دارد. البته سونیکاتورهای Hielscher با CE انطباق دارند و الزامات UL، CSA و RoHs را برآورده می‌کنند.
با ما تماس بگیرید! / از ما بپرسید!
سونیکاتور UIP400MTP: آماده‌سازی نمونه‌های FFPE با ظرفیت پردازش بالا در پلیت چندچاهکی
پرسش‌های متداول
در ادامه به پرسش‌های متداول درباره آماده‌سازی بافت FFPE و فراصوت‌دهی نمونه‌های FFPE پاسخ می‌دهیم.
بافت FFPE چگونه آماده می‌شود؟
مراحل آماده‌سازی بافت FFPE: جابه‌جایی و پردازش دقیق بافت تازه برای تولید نمونه‌های FFPE باکیفیت حیاتی است. اطمینان از حفظ معماری سلولی، اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌ها برای تحلیل دقیق پایین‌دستی ضروری است. هر مرحله – از جمع‌آوری تا قالب‌گیری – به دقت نیاز دارد تا یکپارچگی نمونه برای تحلیل‌های مختلف، از جمله بررسی بافت‌شناختی، ایمونوهیستوشیمی و مطالعات مولکولی، حفظ شود. اجرای صحیح این فرایند تثبیت و قالب‌گیری تضمین می‌کند که بافت نگهداری‌شده، وضعیت درون‌تنی را به‌دقت بازتاب دهد و نتایج تشخیصی و پژوهشی قابل‌اعتمادی فراهم کند.
در ادامه، شما را با 6 مرحله اصلی فرایند قالب‌گیری نمونه‌های بافت FFPE آشنا می‌کنیم.
- جمع‌آوری بافت
نمونه‌های بیوپسی از پستانداران زنده و کشت‌های بافتی، هر دو منابع مناسبی برای تهیه بافت تازه جهت آماده‌سازی نمونه‌های FFPE هستند.
استفاده از روش آسپتیک مهم است: برای جلوگیری از آلودگی، از ابزار و دستکش استریل استفاده کنید. در حالت ایدئال، بافت‌ها را در محیطی استریل، مانند اتاق عمل یا هود جریان لامینار، جمع‌آوری کنید.
ازآنجاکه نمونه بسیار آسیب‌پذیر است، کار با آن باید با ملایمت انجام شود: تأخیر در پردازش را به حداقل برسانید و بلافاصله پس از برداشت بافت، مراحل بعدی پردازش را آغاز کنید. این کار برای جلوگیری از اتولیز و تخریب حیاتی است. بافت را در دمای اتاق نگه دارید؛ از انجماد آن خودداری کنید، زیرا ممکن است موجب تشکیل بلورهای یخ و آسیب بافتی شود. - تثبیت بافت
ابتدا بافت با محلول تثبیت‌کننده تیمار می‌شود: از فرمالین بافرشده خنثی 10% (NBF) استفاده کنید که معادل فرمالدهید 4% در آب است و pH آن با بافر در محدوده خنثی تنظیم شده است.
بافت را کاملاً در فرمالین غوطه‌ور کنید. اطمینان حاصل کنید که نسبت حجم تثبیت‌کننده به بافت حداقل 10:1 باشد. زمان تثبیت معمولاً بسته به نوع و اندازه بافت، از 6 تا 24 ساعت متغیر است. نفوذ کامل تثبیت‌کننده به بافت اهمیت دارد. بااین‌حال، تثبیت بیش‌ازحد می‌تواند به ایجاد پیوندهای عرضی منجر شود که بازیابی آنتی‌ژن را دشوار می‌کنند، درحالی‌که تثبیت ناکافی می‌تواند به حفظ نامناسب بافت بینجامد. - برش اولیه بافت
در مرحله دوم، بافت را به ضخامت حدود 3-5 mm برش دهید تا نفوذ کافی تثبیت‌کننده امکان‌پذیر شود. از جهت‌گیری صحیح بافت برای دربرگرفتن ساختارهای بافت‌شناختی موردنظر اطمینان حاصل کنید. این کار هنگام استفاده بعدی از بافت برای تحلیل، فرایند استخراج را تسهیل می‌کند. - پردازش نمونه تثبیت‌شده
اکنون بافت تثبیت‌شده باید آب‌گیری شود: پس از تثبیت، بافت به آب‌گیری نیاز دارد تا نفوذ کامل موم پارافین تضمین شود. برای حذف آب، بافت را از مجموعه‌ای از محلول‌های اتانول با غلظت افزایشی (70%، 80%، 90% و 100%) عبور دهید.
شفاف‌سازی با زایلن: موم پارافین در آب نامحلول است، اما در زایلن حل می‌شود. بنابراین، آب موجود در بافت باید با زایلن جایگزین شود. بااین‌حال، خود زایلن در آب نامحلول است، اما در الکل حل می‌شود؛ در نتیجه، یک مرحله میانی لازم است که طی آن ابتدا آب با الکل جایگزین شود. بافت را در زایلن یا جایگزین زایلن غوطه‌ور کنید تا اتانول حذف و بافت برای نفوذ پارافین آماده شود.
نفوذدهی با پارافین: بافت را در موم پارافین مذاب قرار دهید و از نفوذ کامل آن اطمینان حاصل کنید. این مرحله معمولاً شامل چندین بار تعویض پارافین است تا آغشته‌سازی کامل تضمین شود. - قالب‌گیری بافت
در این مرحله، بافت به‌صورت یک بلوک بافتی قالب‌گیری می‌شود: بافت را با جهت‌گیری دلخواه در قالب قرار دهید و پارافین مذاب را روی آن بریزید. اجازه دهید پارافین با سردشدن در دمای اتاق یا روی صفحه سرد جامد شود. - تهیه برش و نصب روی لام
میکروتومی: برای برش‌دادن بافت قالب‌گیری‌شده، از میکروتوم استفاده کنید و برش‌های نازک (معمولاً 4-5 میکرومتر) از بلوک پارافینی تهیه کنید. سپس نمونه نصب می‌شود؛ برش‌ها برای رنگ‌آمیزی و تحلیل میکروسکوپی بعدی روی لام‌های شیشه‌ای قرار می‌گیرند.
در نهایت، کیفیت بافت‌شناسی را بررسی کنید: برش‌های نخست را زیر میکروسکوپ ارزیابی کنید تا از تثبیت و پردازش صحیح اطمینان حاصل شود. در صورت نیاز، پروتکل‌ها را بر اساس نوع بافت و کیفیت مشاهده‌شده تنظیم کنید.
بافت‌های FFPE را می‌توان برای بازیابی RNA، DNA و پروتئین‌ها و همچنین شناسایی نشانه‌های سرطان یا بیماری‌های دیگر به کار برد. این بافت‌ها را می‌توان سال‌ها نگهداری کرد و بخش ضروری استفاده پژوهشگران و پزشکان از نمونه‌های بافتی برای تشخیص و پژوهش به شمار می‌روند.
مشکلات و چالش‌های رایج بافت FFPE چیست؟
نمونه‌های بافت تثبیت‌شده با فرمالین و قالب‌گیری‌شده در پارافین (FFPE) به‌طور گسترده در پژوهش و تشخیص استفاده می‌شوند، اما با چندین چالش و مشکل رایج همراه هستند:
- تخریب زیست‌مولکول‌ها: تثبیت طولانی‌مدت می‌تواند به تخریب DNA، RNA و پروتئین‌ها منجر شود و استخراج اسیدهای نوکلئیک یا پروتئین‌های باکیفیت برای کاربردهای پایین‌دستی را دشوار کند. تثبیت صحیح (پرهیز از تثبیت ناکافی و بیش‌ازحد) برای حفظ بافت ضروری است.
- پوشیده‌شدن آنتی‌ژن: فرایند تثبیت می‌تواند جایگاه‌های آنتی‌ژنی را بپوشاند و اثربخشی اتصال آنتی‌بادی را در ایمونوهیستوشیمی و سایر سنجش‌های ایمنی‌شناختی کاهش دهد. این وضعیت اغلب به بازیابی آنتی‌ژن نیاز دارد؛ فرایندی که طی آن پوشیدگی اپی‌توپ برطرف و اتصال اپی‌توپ به آنتی‌بادی برقرار می‌شود. بااین‌حال، ممکن است خاصیت آنتی‌ژنی همیشه به‌طور کامل بازیابی نشود.
- کیفیت متغیر تثبیت: تفاوت در زمان و شرایط تثبیت می‌تواند به ناهماهنگی کیفیت نمونه‌ها منجر شود و تکرارپذیری و قابلیت مقایسه نتایج را تحت‌تأثیر قرار دهد. از پروتکل‌های تثبیت قابل‌اعتماد استفاده کنید و از تثبیت ناکافی و بیش‌ازحد بپرهیزید.
- آسیب و قطعه‌قطعه‌شدن DNA: تثبیت نمونه‌های FFPE با فرمالین می‌تواند انواع مختلفی از آسیب DNA را ایجاد کند، از جمله دآمیناسیون سیتوزین (جهش‌های C به T)، آسیب اکسیداتیو (برای مثال، 8-oxo-guanine که به جهش‌های G به T منجر می‌شود) و همچنین آسیب‌های فیزیکی مانند شکست‌های تک‌رشته‌ای، شکاف‌ها و جایگاه‌های فاقد باز که فعالیت DNA پلیمراز را مختل می‌کنند. فرایند تثبیت با فرمالین می‌تواند موجب قطعه‌قطعه‌شدن DNA شود و تحلیل‌های ژنتیکی و ژنومی مانند PCR و توالی‌یابی را دشوار کند.
- کیفیت RNA: RNA استخراج‌شده از بافت‌های FFPE اغلب قطعه‌قطعه شده و دچار تغییرات شیمیایی است که انجام تحلیل‌های ترانسکریپتومیک باکیفیت را دشوار می‌کند.
- تغییرات پروتئینی: فرمالین می‌تواند تغییرات شیمیایی در پروتئین‌ها ایجاد کند و ساختار و عملکرد آن‌ها را تحت‌تأثیر قرار دهد؛ این امر می‌تواند در تحلیل‌های پروتئومیک اختلال ایجاد کند.
- آرتیفکت‌های ناشی از پردازش نمونه: در فرایند قالب‌گیری و تهیه برش، تنش مکانیکی و گرما می‌توانند آرتیفکت ایجاد کنند و آسیب بیشتری به بافت وارد سازند.
- تغییرپذیری بین دسته‌ها: تفاوت پروتکل‌های تثبیت و قالب‌گیری بین دسته‌های مختلف می‌تواند به تغییرپذیری قابل‌توجه نتایج منجر شود و مقایسه بین مطالعات را دشوار کند.
- مشکلات نگهداری: نگهداری طولانی‌مدت بلوک‌های FFPE می‌تواند با گذشت زمان به تخریب بیشتر و از دست رفتن یکپارچگی اسیدهای نوکلئیک منجر شود و قابلیت استفاده از نمونه‌های آرشیوی در مطالعات گذشته‌نگر را تحت‌تأثیر قرار دهد.
ایجاد پیوندهای عرضی: تثبیت با فرمالین موجب ایجاد پیوندهای عرضی در پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک می‌شود که می‌تواند مانع تحلیل مولکولی شود و بر دقت ایمونوهیستوشیمی و سایر سنجش‌ها تأثیر بگذارد.
استفاده از پروتکل‌های بهینه‌شده، جابه‌جایی دقیق نمونه‌ها و به‌کارگیری روش‌های پیشرفته به بهبود کیفیت و قابلیت اطمینان داده‌های به‌دست‌آمده از بافت‌های FFPE کمک می‌کند.
تفاوت بافت FFPE و بافت منجمد چیست؟
بافت FFPE (تثبیت‌شده با فرمالین و قالب‌گیری‌شده در پارافین) با استفاده از فرمالین تثبیت و سپس در موم پارافین قالب‌گیری می‌شود؛ این روش ضمن حفظ ریخت‌شناسی بافت، نگهداری طولانی‌مدت در دمای اتاق را امکان‌پذیر می‌کند. در مقابل، بافت منجمد با انجماد به‌سرعت حفظ می‌شود؛ روشی که یکپارچگی اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌ها را بهتر نگه می‌دارد، اما به نگهداری در دماهای بسیار پایین نیاز دارد.
برای قالب‌گیری FFPE از چه مواد شیمیایی استفاده می‌شود؟
مواد شیمیایی مورد استفاده برای قالب‌گیری FFPE معمولاً شامل فرمالین برای تثبیت و موم پارافین برای قالب‌گیری هستند. برای قالب‌گیری FFPE، بافت‌ها معمولاً با فرمالین بافرشده خنثی 10% (v/v) با نام اختصاری FA یا محلول تازه‌تهیه‌شده فرمالدهید 4% (w/v) با نام اختصاری PFA که از پودر پارافرمالدهید ساخته شده است، تثبیت می‌شوند. فرمالین که محلول فرمالدهید در آب است، برای حفظ ریخت‌شناسی بافت و جلوگیری از تشکیل بیش‌ازحد پیوندهای عرضی، با بافر به pH خنثی رسانده می‌شود. محلول مبتنی بر پارافرمالدهید نیز با ایجاد پیوندهای عرضی در پروتئین‌ها، تثبیت مؤثری فراهم می‌کند و بدین‌ترتیب ساختار بافت را برای قالب‌گیری بعدی در موم پارافین پایدار می‌سازد. این مواد شیمیایی برای حفظ یکپارچگی و ریخت‌شناسی بافت در فرایند تثبیت و قالب‌گیری ضروری هستند.
پارافین چگونه از نمونه‌های FFPE حذف می‌شود؟
برای حذف پارافین از نمونه‌های FFPE، برش‌های بافت معمولاً چندین بار با زایلن شسته می‌شوند و سپس با عبور از مجموعه‌ای از الکل‌ها با غلظت تدریجی و در نهایت آب، بازآب‌رسانی می‌شوند. ازآنجاکه زایلن بسیار سمی است و خطراتی برای سلامت، از جمله مشکلات تنفسی، تحریک پوست و اثرات احتمالی بلندمدت ناشی از مواجهه مکرر، به همراه دارد، حذف فراصوتی پارافین در بسیاری از آزمایشگاه‌ها به‌عنوان جایگزینی نویدبخش مطرح شده است. این روش با استفاده از امواج فراصوت شدید، پارافین را به‌طور کارآمد و ایمن و بدون نیاز به حلال‌های سمی مانند زایلن حذف می‌کند؛ در نتیجه، خطر برای کارکنان آزمایشگاه را کاهش می‌دهد و محیط کاری ایمن‌تری ایجاد می‌کند.
برای دستیابی به نمونه FFPE باکیفیت، بافت‌ها را چه مدت باید تثبیت کنم؟
توصیه‌های عمومی درباره مدت تثبیت، معمولاً تثبیت نمونه‌های بافت در فرمالین به‌مدت 24 تا 48 ساعت را پیشنهاد می‌کنند. این مدت معمولاً برای حفظ ریخت‌شناسی بافت و ساختارهای سلولی کافی است و درعین‌حال تثبیت بیش‌ازحد را که می‌تواند موجب تشکیل بیش‌ازحد پیوندهای عرضی و تخریب اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌ها شود، به حداقل می‌رساند. بااین‌حال، زمان بهینه تثبیت می‌تواند بسته به اندازه و نوع بافت متفاوت باشد و نمونه‌های کوچک‌تر یا ظریف‌تر به زمان تثبیت کوتاه‌تری نیاز دارند. ایجاد تعادل میان تثبیت کافی برای جلوگیری از اتولیز و تخریب بافت و پرهیز از تثبیت طولانی‌مدتی که ممکن است تحلیل‌های مولکولی پایین‌دستی را دشوار کند، حیاتی است.