برش کروماتین با سونیکیشن
برش کروماتین گامی حیاتی در بسیاری از جریان های کاری اپی ژنتیک و زیست شناسی مولکولی است، به ویژه در ایمونوپرسیپیتاسیون کروماتین (ChIP)، ChIP-seq و آزمایش های مرتبط. هدف این است که کروماتین به کمپلکس های پروتئینی DNA قابل تکرارشونده تقسیم شود و در عین حال یکپارچگی اپی توپ حفظ شده و از دست رفتن نمونه به حداقل برسد. در میان روش های موجود، تکه تکه شدن کروماتین اولتراسونیک به رویکردی پرکاربرد تبدیل شده است، زیرا تکه تکه شدن قابل اعتماد و بدون معرف با قابلیت بازتولید عالی را فراهم می کند.
هنگام برش کروماتین باید چه نکاتی را در نظر بگیرم؟
برش کروماتین کارآمد نیازمند کنترل دقیق پارامترهای آزمایشی است. تکه تکه شدن نادرست می تواند آزمایش های پایین دستی ChIP را با تولید قطعاتی که یا بیش از حد بزرگ، بیش از حد تجزیه شده یا ناسازگار بین نمونه ها هستند، به خطر بیندازد.
یکی از مهم ترین عوامل، توزیع اندازه قطعه مورد نظر است. برای بیشتر کاربردهای ChIP و ChIP-seq، قطعات کروماتین بین 100 تا 600 جفت باز بهینه هستند. این بازه اندازه امکان ایمونوپرسیپیتاسیون کارآمد را فراهم می کند و در عین حال وضوح کافی برای نقشه برداری ژنومی فراهم می آورد.
عامل کلیدی دیگر، کارایی اتصال متقاطع قبل از سونیکاسیون است. بیشتر جریان های کاری ChIP شامل تثبیت فرمالدهید برای تثبیت تعاملات پروتئین-DNA هستند. با این حال، اتصال عرضی بیش از حد می تواند کروماتین را در برابر تکه تکه شدن مقاوم تر کند و نیازمند زمان های سونیک طولانی تر و احتمالا افزایش قرار گرفتن در معرض حرارت باشد.
کنترل دما نیز بسیار مهم است. سونیک انرژی موضعی تولید می کند که می تواند دمای نمونه را افزایش دهد. دمای بالا ممکن است به DNA آسیب برساند یا پروتئین ها را دناتوره کند و در تشخیص آنتی بادی ها در ChIP تأثیر بگذارد. بنابراین بسیاری از پژوهشگران چرخه های صوتی پالسی را همراه با فواصل خنک سازی برای حفظ پایداری نمونه انجام می دهند.
غلظت و حجم نمونه نیز بر کارایی تکه تکه شدن تأثیر می گذارد. تعلیق های کروماتین با غلظت بالا ممکن است به زمان سونیک طولانی تری نیاز داشته باشند، در حالی که حجم های کوچک نمونه ها نیازمند انتقال انرژی دقیق برای جلوگیری از پردازش بیش از حد هستند.
در نهایت، انتخاب دستگاه صوتی تأثیر زیادی بر قابلیت تکرارپذیری تجربی دارد. دستگاه هایی که برای برش کروماتین طراحی شده اند معمولا انرژی اولتراسونیک کنترل شده و مدیریت نمونه های استاندارد را فراهم می کنند که امکان تکه تکه شدن یکنواخت در چندین نمونه را فراهم می کند.
برش DNA اولتراسونیک در طول ChIP – رسوب ایمنی کروماتین
کدام سونیکاتور را برای برش کروماتین باید انتخاب کنم؟
جریان های کاری مختلف آزمایشگاهی نیازمند پیکربندی های صوتی متفاوتی هستند. سیستم بهینه تا حد زیادی به توان عملیاتی نمونه، حجم و قالب آزمایشی بستگی دارد.
سونیکاتور نوع پروب
یک سونیکاتور نوع پروب انرژی اولتراسونیک را مستقیما از طریق پروب تیتانیومی به نمونه منتقل می کند. این پیکربندی چگالی انرژی بسیار بالایی فراهم می کند و بنابراین برای اختلالات مقاوم کروماتین در نمونه های منفرد مناسب است.
سونیکاتورهای پروب به ویژه برای موارد زیر مفید هستند:
- نمونه های کوچک تا متوسط
- کروماتین که به سختی تجزیه می شود
- پروتکل های آزمایشی انعطاف پذیر
سونیکاتور چندلامپی – VialTweeter
برای آزمایشگاه هایی که همزمان چندین نمونه را پردازش می کنند، سونیکاتور چندلامپی VialTweeter راه حلی بسیار قابل تکرار ارائه می دهد. این سیستم انرژی اولتراسونیک را به طور غیرمستقیم از طریق نگهدارنده ویال منتقل می کند و اجازه می دهد چندین لوله مهر و موم شده تحت شرایط یکسان تکه تکه شوند.
این پیکربندی مزایای مهمی دارد:
- برش کروماتین موازی چندین نمونه
- حذف آلودگی پروب
- تکرارپذیری بالا بین لامپ ها
- جریان کاری ساده شده برای آماده سازی نمونه ChIP
چنین سیستم های چندلامپی برای آزمایش های روتین ChIP و مطالعات با توان متوسط بسیار مناسب هستند.
میکروپلیت سونیکاتور – UIP400MTP
مطالعات اپی ژنتیک با توان بالا به طور فزاینده ای به پردازش نمونه مبتنی بر میکروپلیت متکی هستند. سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP برای خرد کردن مستقیم کروماتین در میکروپلیت های استاندارد بدون انتقال نمونه ها طراحی شده است.
این رویکرد امکان موارد زیر را فراهم می کند:
- پردازش همزمان ده ها یا صدها نمونه
- جریان های کاری سازگار با اتوماسیون
- توزیع یکنواخت انرژی فراصوت در سراسر چاه ها
- کاهش قابل توجه در مراحل جابجایی نمونه
برای پروژه های بزرگ غربالگری ChIP-seq یا مطالعات اپی ژنتیکی با توان بالا، سونیکاسیون میکروپلیت مقیاس پذیری و کارایی استثنایی را فراهم می کند. UIP400MTP سونیکاتور صفحه ای چندچاهکی برای ادغام در سیستم های مدیریت مایع و جریان های کاری خودکار آزمایشگاهی.
چرا سونیکاسیون را به جای سایر تکنیک های برش کروماتین انتخاب کردید؟
در مقایسه با رویکردهای آنزیمی، سونیکاسیون برای ChIP تکه تکه شدن بدون سوگیری را فراهم می کند، زیرا این فرآیند به فعالیت آنزیمی خاص توالی وابسته نیست. این موضوع به ویژه برای مطالعات اپی ژنتیکی در سراسر ژنوم اهمیت دارد، جایی که پوشش یکنواخت ضروری است.
یکی دیگر از مزایای مهم، مقیاس پذیری است. سیستم های اولتراسونیک می توانند نمونه های منفرد، چندین لوله یا کل میکروپلیت را در خود جای دهند و به آزمایشگاه ها اجازه می دهند مناسب ترین پیکربندی را برای توان عملیاتی آزمایشی خود انتخاب کنند.
در نهایت، سونیکاسیون کنترل عالی بر پارامترهای تکه تکه شدن را فراهم می کند. با تنظیم چرخه های پالس، مدت زمان و سطح توان، پژوهشگران می توانند به طور قابل اعتماد توزیع اندازه قطعات مورد نظر را به دست آورند.
تکه تکه شدن کروماتین با سونیک بهینه شده نمونه های ChIP.
(الف) بدون برش (قطعات بلند در ژل)؛
(ب) پروفایل تکه تکه شدن بهینه (غنی سازی قطعات با ۲۰۰–۶۰۰ جفت باز)؛
(ج) تکه تکه شدن بیش از حد DNA (نمایش بیش از قطعات کوتاه تر از ۲۰۰ جفت باز)
© جاریو و همکاران، ۲۰۱۸
مقایسه تکنیک های برش کروماتین
| روش برش کروماتین | اصل | مزایای | محدودیت ها |
| فراصوت | انرژی صوتی فرکانس بالا به صورت مکانیکی کروماتین را تجزیه می کند. | تکه تکه شدن بدون معرف، نتایج بسیار قابل بازتولید، توزیع اندازه قطعات قابل تنظیم، سازگار با کروماتین متقاطع، مقیاس پذیر از لامپ های منفرد به فرمت های چند نمونه و میکروپلیت. | نیازمند تجهیزات سونیک و بهینه سازی پارامترهای سونیکیشن است. |
| هضم آنزیمی (MNase) | نوکلئاز میکروکوکی DNA بین نوکلئوزوم ها را هضم می کند. | تکه تکه شدن ملایم و مفید برای تحلیل کروماتین های بومی. | سوگیری آنزیم، ترجیح توالی، دشواری کنترل هضم، تغییرات احتمالی بین آزمایش ها. |
| برش مکانیکی (سوزن / سرنگ) | کروماتین توسط نیروی فیزیکی مکرر مختل می شود. | روشی ساده که به تجهیزات حداقلی نیاز دارد. | تکرارپذیری ضعیف، کنترل محدود بر اندازه قطعات، و نیاز به نیروی کار برای نمونه های متعدد. |
| نبولیزاسیون | هوای فشرده DNA را از طریق منافذ کوچک عبور می دهد و باعث تکه تکه شدن می شود. | فرآیند تکه تکه شدن سریع. | احتمال از دست رفتن نمونه، مقیاس پذیری محدود، نیازمند تجهیزات تخصصی است. |
چگونه می توانم بازده کروماتین را پس از تکه تکه شدن اولتراسونیک کمی و تعیین کنم؟
پس از سونیکاسیون برای ChIP، پژوهشگران باید هم کمیت و هم کیفیت کروماتین تکه تکه شده را ارزیابی کنند. این مرحله تأیید اطمینان می دهد که تکه تکه شدن کروماتین نیازهای برنامه های پایین دستی مانند ChIP-qPCR یا ChIP-seq را برآورده می کند.
کمی سازی معمولا با اندازه گیری غلظت DNA آغاز می شود. روش های طیف سنجی مانند آنالیز نانودراپ یا آزمایش های فلورومتری مانند کمی سازی DNA کیوبیتی برآوردهای قابل اعتمادی از بازده کروماتین پس از دکراس لینک و تصفیه ارائه می دهند.
با این حال، غلظت DNA به تنهایی نشان نمی دهد که آیا تکه تکه شدن موفقیت آمیز بوده است یا خیر. بنابراین پژوهشگران توزیع اندازه قطعات را با استفاده از تکنیک های الکتروفورتیک ارزیابی می کنند. الکتروفورز ژل آگروز همچنان روشی رایج برای مشاهده قطعات DNA و تأیید اینکه اکثریت آن ها در محدوده اندازه هدف قرار دارند، استفاده می شود.
آزمایشگاه های پیشرفته تر اغلب از سیستم های الکتروفورز مویرگی مانند Agilent Bioanalyser یا TapeStation استفاده می کنند. این پلتفرم ها پروفایل های توزیع اندازه دقیقی ارائه می دهند و به پژوهشگران امکان می دهند تا تکه تکه شدن بیش از حد یا برش ناقص را تشخیص دهند.
هنگام ارزیابی کیفیت کروماتین پس از تکه تکه شدن فراصوت، پژوهشگران معمولا تأیید می کنند:
- اکثر قطعات DNA در بازه ۱۰۰ تا ۶۰۰ جفت باز قرار دارند
- توزیع قطعات در نمونه های تکرارشونده یکسان است
- تخریب DNA حداقلی است
- بازده کل کروماتین برای آزمایش برنامه ریزی شده ChIP کافی است
کنترل کیفیت صحیح تضمین می کند که مرحله برش کروماتین اولتراسونیک نتایجی قابل تکرار و از نظر زیستی معنادار تولید کند.
نتیجه گیری: برش کروماتین اولتراسونیک برای تحقیقات قابل اعتماد
برش قابل اعتماد کروماتین برای موفقیت در تحقیقات ChIP و اپی ژنتیک اساسی است. تکه تکه شدن اولتراسونیک راه حلی قدرتمند ارائه می دهد زیرا امکان اختلال دقیق، قابل تکثیر و بدون معرف در کروماتین را در طیف وسیعی از فرمت های آزمایشی فراهم می کند.
با بهینه سازی دقیق پارامترهای صوتی، تأیید توزیع اندازه قطعات و انتخاب سیستم صوتی مناسب – چه یک سونیکاتور نوع پروب باشد، چه ویال توییتر چندلوله ای، یا سونیکاتور میکروپلیت با توان بالا UIP400MTP – پژوهشگران می توانند به تکه تکه شدن کروماتین های یکنواخت دست یابند که از نتایج باکیفیت ChIP و ChIP-seq پشتیبانی می کند.
با گسترش تحقیقات اپی ژنتیک به سمت افزایش توان عملیاتی و قابلیت بازتولید تجربی بیشتر، برش کروماتین اولتراسونیک همچنان یکی از چندمنظوره ترین و قابل اعتمادترین روش های موجود برای آزمایشگاه های زیست شناسی مولکولی مدرن است.
طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان
مافوق صوت Hielscher به خوبی برای بالاترین کیفیت و استانداردهای طراحی خود را شناخته شده. استحکام و بهره برداری آسان اجازه می دهد تا ادغام صاف از ultrasonicators ما به امکانات صنعتی. شرایط خشن و محیط های خواستار به راحتی توسط مافوق صوت Hielscher رسیده.
Hielscher اولتراسونیک یک شرکت دارای گواهینامه ISO است و تاکید ویژه ای بر مافوق صوت با کارایی بالا با ویژگی های دولت از هنر فن آوری و کاربر پسند قرار داده است. البته، مافوق صوت Hielscher مطابق با CE و دیدار با الزامات UL، CSA و RoHs.
رک لوله ای که در UIP400MTP برای برش کروماتین سونفاید شده است
ادبیات / منابع
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
پرسش و پاسخهای متداول
کروماتین چیست؟
کروماتین مجموعه ساختاری DNA و پروتئین های مرتبط است که مواد ژنتیکی درون هسته سلول های یوکاریوتی را سازماندهی می کند. پروتئین های اصلی کروماتین هیستون ها هستند که DNA به دور آن ها پیچیده شده و نوکلئوزوم ها را تشکیل می دهد. این سازمان DNA را فشرده می کند و همزمان دسترسی به اطلاعات ژنتیکی را برای فرآیندهایی مانند رونوشت، تکثیر و ترمیم DNA تنظیم می کند.
انواع کروماتین ها چیستند؟
کروماتین معمولا به دو شکل اصلی تقسیم می شود: یوکروماتین و هتروکروماتین. یوکروماتین به طور آزاد بسته بندی شده و فعال رونویسی است و امکان دسترسی آسان به ژن ها توسط ماشین آلات رونویسی را فراهم می کند. هتروکروماتین متراکم تر و از نظر رونویسی غیرفعال است و معمولا شامل توالی های DNA تکراری یا ژن هایی است که خاموش می شوند. هتروکروماتین را می توان به دو دسته تقسیم کرد: هتروکروماتین سازنده که به طور دائمی متراکم باقی می ماند و هتروکروماتین اختیاری که بسته به شرایط سلولی می تواند بین حالت فعال و غیرفعال جابجا شود.
Crosslinking چیست؟
پیوندهای عرضی یک فرآیند بیوشیمیایی است که برای تثبیت تعاملات بین بیومولکول ها از طریق ایجاد پیوندهای کووالانسی بین آن ها استفاده می شود. در پژوهش های کروماتین، پیونددهی متقاطع معمولا برای حفظ تعاملات پروتئین-DNA درون کروماتین پیش از آنالیز استفاده می شود. عوامل شیمیایی مانند فرمالدهید معمولا برای ایجاد پیوندهای کووالانسی برگشت پذیر بین DNA و پروتئین های مرتبط به کار می روند، به طور مؤثری “انجماد” تعاملات مولکولی در یک لحظه خاص از زمان. این تثبیت اجازه می دهد کمپلکس های کروماتین بدون از دست دادن ارتباطات ذاتی بین DNA و پروتئین های تنظیمی، که برای تکنیک هایی مانند ایمونوپرسیپیتاسیون کروماتین (ChIP) ضروری است، تکه تکه و پردازش شوند.
چیپ چیست؟
ایمونوپرسیپیتاسیون کروماتین (ChIP) یک تکنیک زیست شناسی مولکولی است که برای بررسی تعاملات بین پروتئین ها و DNA درون کروماتین استفاده می شود. در این روش، کمپلکس های پروتئین DNA ابتدا تثبیت می شوند، معمولا با پیوند عرضی، و سپس کروماتین تکه تکه می شود. آنتی بادی های اختصاصی یک پروتئین هدف برای ایمونوپرسیپیتاسیون کمپلکس های پروتئین-DNA استفاده می شوند و امکان جداسازی و تحلیل توالی های DNA مرتبط را فراهم می کنند.
ChIP برای چه استفاده می شود؟
ChIP برای شناسایی نواحی ژنومی متصل به پروتئین های خاص مرتبط با DNA مانند فاکتورهای رونوشت، تغییرات هیستونی یا پروتئین های تنظیمی مرتبط با کروماتین استفاده می شود. این تکنیک به طور گسترده ای برای مطالعه تنظیم ژن، تغییرات اپی ژنتیکی، محل های اتصال فاکتورهای رونویسی و ساختار کروماتین به کار می رود. وقتی با روش های تحلیلی پایین دستی مانند PCR کمی (ChIP-qPCR) یا توالی یابی با توان بالا (ChIP-seq) ترکیب شود، امکان نقشه برداری سراسری ژنوم تعاملات پروتئین-DNA را فراهم می کند.
انواع ChIP چیستند؟
چندین نوع از ایمونوپرسیپیتاسیون کروماتین بسته به طراحی آزمایشی و تحلیل های پایین دستی وجود دارد. رایج ترین رویکردها شامل ChIP-qPCR است که غنی سازی نواحی ژنومی خاص را کمی سازی می کند؛ ChIP-seq که از توالی یابی نسل بعدی برای نقشه برداری تعاملات پروتئین-DNA در سراسر ژنوم استفاده می کند؛ و ChiIP-chip که ChIP را با تحلیل ریزآرایه DNA ترکیب می کند. گونه های اضافی مانند ChIP بومی (N-ChIP) که کروماتین غیرمتقاطع را تحلیل می کند و ChIP متقاطع (X-ChIP) که از پیوند شیمیایی برای تثبیت تعاملات پروتئین-DNA استفاده می کند، نیز بسته به سوال زیستی مورد بررسی، به طور گسترده استفاده می شوند.
برش کروماتین با توان بالا با سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.