برش کروماتین با فراصوت‌دهی
برش کروماتین مرحله‌ای حیاتی در بسیاری از روندهای کاری اپی‌ژنتیک و زیست‌شناسی مولکولی، به‌ویژه رسوب‌دهی ایمنی کروماتین (ChIP)، ChIP-seq و آزمون‌های مرتبط است. هدف، قطعه‌قطعه کردن کروماتین به کمپلکس‌های DNA–پروتئین به‌صورت تکرارپذیر، همراه با حفظ یکپارچگی اپی‌توپ و به حداقل رساندن اتلاف نمونه است. در میان روش‌های موجود، قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی کروماتین به روشی پرکاربرد تبدیل شده است، زیرا قطعه‌قطعه‌سازی قابل‌اعتماد و بدون معرف را با تکرارپذیری عالی فراهم می‌کند.
هنگام برش کروماتین چه نکاتی را باید در نظر بگیرم؟
برش کارآمد کروماتین مستلزم کنترل دقیق پارامترهای آزمایش است. قطعه‌قطعه‌سازی نامناسب ممکن است با تولید قطعات بیش‌ازحد بزرگ، بیش‌ازحد تخریب‌شده یا ناهمسان بین نمونه‌ها، آزمایش‌های ChIP در مراحل بعدی را مختل کند.
یکی از مهم‌ترین عوامل، توزیع اندازه مطلوب قطعات است. برای بیشتر کاربردهای ChIP و ChIP-seq، قطعات کروماتین بین 100 و 600 جفت‌باز بهینه هستند. این محدوده اندازه، رسوب‌دهی ایمنی کارآمد را ممکن می‌کند و در عین حال قدرت تفکیک کافی برای نقشه‌برداری ژنومی فراهم می‌سازد.
عامل کلیدی دیگر، کارایی ایجاد پیوندهای عرضی پیش از فراصوت‌دهی است. بیشتر روندهای کاری ChIP شامل تثبیت با فرمالدهید برای پایدارسازی برهم‌کنش‌های پروتئین–DNA هستند. بااین‌حال، ایجاد بیش‌ازحد پیوندهای عرضی می‌تواند کروماتین را در برابر قطعه‌قطعه‌سازی مقاوم‌تر کند، به زمان فراصوت‌دهی طولانی‌تری نیاز داشته باشد و احتمالاً مواجهه با گرما را افزایش دهد.
کنترل دما نیز بسیار مهم است. فراصوت‌دهی انرژی موضعی ایجاد می‌کند که می‌تواند دمای نمونه را افزایش دهد. دمای بالا ممکن است به DNA آسیب برساند یا پروتئین‌ها را دناتوره کند و بر شناسایی توسط آنتی‌بادی در طول ChIP اثر بگذارد. ازاین‌رو، بسیاری از پژوهشگران برای حفظ پایداری نمونه، چرخه‌های فراصوت‌دهی پالسی را همراه با فواصل خنک‌سازی به کار می‌برند.
غلظت و حجم نمونه نیز بر کارایی قطعه‌قطعه‌سازی تأثیر دارند. سوسپانسیون‌های بسیار غلیظ کروماتین ممکن است به زمان فراصوت‌دهی طولانی‌تری نیاز داشته باشند، درحالی‌که حجم‌های کم نمونه به انتقال دقیق انرژی نیاز دارند تا از پردازش بیش‌ازحد جلوگیری شود.
در نهایت، انتخاب دستگاه فراصوت‌دهی تأثیر زیادی بر تکرارپذیری آزمایش دارد. دستگاه‌هایی که برای برش کروماتین طراحی شده‌اند، معمولاً انرژی فراصوتی کنترل‌شده و کار با نمونه به شیوه‌ای استاندارد را فراهم می‌کنند و امکان قطعه‌قطعه‌سازی یکنواخت چندین نمونه را می‌دهند.
برش فراصوتی DNA در طول ChIP – رسوب‌دهی ایمنی کروماتین
برای برش کروماتین کدام سونیکاتور را انتخاب کنم؟
روندهای کاری مختلف آزمایشگاهی به پیکربندی‌های متفاوت فراصوت‌دهی نیاز دارند. سامانه بهینه تا حد زیادی به ظرفیت پردازش نمونه‌ها، حجم و قالب آزمایش بستگی دارد.
سونیکاتور پروبی
سونیکاتور پروبی انرژی فراصوتی را از طریق یک پروب تیتانیومی مستقیماً به درون نمونه منتقل می‌کند. این پیکربندی چگالی انرژی بسیار بالایی فراهم می‌کند و بنابراین برای گسیختن مؤثر کروماتین در نمونه‌های منفرد مناسب است.
سونیکاتورهای پروبی به‌ویژه برای موارد زیر مفید هستند:
- تعداد کم تا متوسط نمونه‌ها
- کروماتینی که به‌سختی قطعه‌قطعه می‌شود
- پروتکل‌های آزمایشی انعطاف‌پذیر
سونیکاتور چندلوله‌ای – VialTweeter
برای آزمایشگاه‌هایی که چندین نمونه را هم‌زمان پردازش می‌کنند، سونیکاتور چندلوله‌ای VialTweeter راهکاری با تکرارپذیری بسیار بالا فراهم می‌کند. این سامانه انرژی فراصوتی را به‌طور غیرمستقیم از طریق نگهدارنده ویال منتقل می‌کند و امکان قطعه‌قطعه‌سازی محتویات چندین لوله دربسته را در شرایط یکسان می‌دهد.
این پیکربندی مزایای مهمی دارد:
- برش موازی کروماتین در چندین نمونه
- حذف آلودگی پروب
- تکرارپذیری بالا بین لوله‌ها
- روند کاری ساده‌تر برای آماده‌سازی نمونه ChIP
چنین سامانه‌های چندلوله‌ای برای آزمایش‌های معمول ChIP و مطالعات با ظرفیت پردازش متوسط بسیار مناسب هستند.
سونیکاتور میکروپلیت – UIP400MTP
مطالعات اپی‌ژنتیک با ظرفیت پردازش بالا به‌طور فزاینده‌ای به پردازش نمونه در میکروپلیت متکی هستند. سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP برای قطعه‌قطعه کردن کروماتین مستقیماً در میکروپلیت‌های استاندارد، بدون انتقال نمونه‌ها، طراحی شده است.
این رویکرد موارد زیر را امکان‌پذیر می‌کند:
- پردازش هم‌زمان ده‌ها یا صدها نمونه
- روندهای کاری سازگار با خودکارسازی
- توزیع یکنواخت انرژی فراصوتی بین چاهک‌ها
- کاهش چشمگیر مراحل کار با نمونه
برای پروژه‌های بزرگ غربالگری ChIP-seq یا مطالعات اپی‌ژنتیک با ظرفیت پردازش بالا، فراصوت‌دهی میکروپلیت مقیاس‌پذیری و کارایی استثنایی فراهم می‌کند. سونیکاتور پلیت چندچاهکی UIP400MTP بسیار مناسب است برای ادغام در سامانه‌های جابه‌جایی مایعات و روندهای کاری خودکار آزمایشگاهی.
چرا فراصوت‌دهی را به سایر روش‌های برش کروماتین ترجیح دهیم؟
در مقایسه با رویکردهای آنزیمی، فراصوت‌دهی برای ChIP قطعه‌قطعه‌سازی بدون سوگیری فراهم می‌کند، زیرا این فرایند به فعالیت آنزیمی اختصاصی توالی وابسته نیست. این موضوع به‌ویژه برای مطالعات اپی‌ژنتیک در سراسر ژنوم که پوشش یکنواخت در آن‌ها ضروری است، اهمیت دارد.
مزیت عمده دیگر، مقیاس‌پذیری است. سامانه‌های فراصوتی می‌توانند نمونه‌های منفرد، چندین لوله یا میکروپلیت‌های کامل را پردازش کنند و به آزمایشگاه‌ها امکان دهند مناسب‌ترین پیکربندی را برای ظرفیت پردازش آزمایش‌های خود انتخاب کنند.
در نهایت، فراصوت‌دهی کنترل بسیار خوبی بر پارامترهای قطعه‌قطعه‌سازی فراهم می‌کند. پژوهشگران با تنظیم چرخه‌های پالس، مدت‌زمان و سطوح توان می‌توانند به‌طور قابل‌اعتماد به توزیع اندازه مطلوب قطعات دست یابند.
قطعه‌قطعه‌سازی کروماتین با فراصوت‌دهی بهینه‌شده نمونه‌های ChIP.
(a) بدون برش (قطعات بلند در ژل)؛
(b) نمایه بهینه قطعه‌قطعه‌سازی (غنی‌سازی قطعات با اندازه 200–600 bp)؛
(c) قطعه‌قطعه‌سازی بیش‌ازحد DNA (فراوانی بیش‌ازحد قطعات کوتاه‌تر از 200 bp)
© Jarillo et al., 2018
مقایسه روش‌های برش کروماتین
| روش برش کروماتین | اصل عملکرد | مزایا | محدودیت‌ها |
| فراصوت‌دهی | انرژی آکوستیکی با فرکانس بالا، کروماتین را به‌صورت مکانیکی قطعه‌قطعه می‌کند. | قطعه‌قطعه‌سازی بدون معرف، نتایج با تکرارپذیری بسیار بالا، توزیع اندازه قابل‌تنظیم قطعات، سازگاری با کروماتین دارای پیوندهای عرضی، مقیاس‌پذیری از لوله‌های منفرد تا قالب‌های چندنمونه‌ای و میکروپلیت. | به تجهیزات فراصوت‌دهی و بهینه‌سازی پارامترهای فراصوت‌دهی نیاز دارد. |
| هضم آنزیمی (MNase) | نوکلئاز میکروکوکی، DNA بین نوکلئوزوم‌ها را هضم می‌کند. | قطعه‌قطعه‌سازی ملایم و مفید برای تحلیل کروماتین در حالت طبیعی. | سوگیری آنزیمی، ترجیح توالی، دشواری کنترل هضم، احتمال تغییرپذیری بین آزمایش‌ها. |
| برش مکانیکی (سوزن / سرنگ) | کروماتین از طریق اعمال مکرر نیروی فیزیکی گسیخته می‌شود. | روشی ساده که به حداقل تجهیزات نیاز دارد. | تکرارپذیری ضعیف، کنترل محدود بر اندازه قطعات، نیاز به کار دستی زیاد برای چندین نمونه. |
| نبولیزاسیون | هوای فشرده DNA را با فشار از روزنه‌های کوچک عبور می‌دهد و باعث قطعه‌قطعه شدن آن می‌شود. | فرایند سریع قطعه‌قطعه‌سازی. | احتمال اتلاف نمونه، مقیاس‌پذیری محدود، نیاز به تجهیزات تخصصی. |
چگونه مقدار و کیفیت کروماتین حاصل از قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی را ارزیابی کنم؟
پس از فراصوت‌دهی برای ChIP، پژوهشگران باید هم مقدار و هم کیفیت کروماتین قطعه‌قطعه‌شده را ارزیابی کنند. این مرحله بررسی تضمین می‌کند که قطعه‌قطعه‌سازی کروماتین الزامات کاربردهای مراحل بعدی، مانند ChIP-qPCR یا ChIP-seq، را برآورده می‌کند.
ارزیابی کمی معمولاً با اندازه‌گیری غلظت DNA آغاز می‌شود. روش‌های اسپکتروفتومتری مانند تحلیل Nanodrop یا آزمون‌های فلورومتری مانند سنجش کمی DNA با Qubit، پس از باز کردن پیوندهای عرضی و خالص‌سازی، برآوردهای قابل‌اعتمادی از مقدار کروماتین حاصل ارائه می‌دهند.
بااین‌حال، غلظت DNA به‌تنهایی نشان نمی‌دهد که قطعه‌قطعه‌سازی موفق بوده است یا خیر. بنابراین پژوهشگران توزیع اندازه قطعات را با استفاده از روش‌های الکتروفورزی ارزیابی می‌کنند. الکتروفورز ژل آگارز همچنان روشی رایج برای مشاهده قطعات DNA و تأیید قرار گرفتن بیشتر آن‌ها در محدوده اندازه هدف است.
آزمایشگاه‌های پیشرفته‌تر اغلب از سامانه‌های الکتروفورز موئینه، مانند Agilent Bioanalyzer یا TapeStation، استفاده می‌کنند. این سامانه‌ها نمایه‌های دقیقی از توزیع اندازه ارائه می‌دهند و به پژوهشگران امکان می‌دهند قطعه‌قطعه‌سازی بیش‌ازحد یا برش ناقص را تشخیص دهند.
پژوهشگران هنگام ارزیابی کیفیت کروماتین پس از قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی، معمولاً موارد زیر را تأیید می‌کنند:
- بیشتر قطعات DNA در محدوده 100–600 bp قرار دارند
- توزیع قطعات در نمونه‌های تکرار آزمایش یکسان است
- تخریب DNA حداقل است
- مقدار کل کروماتین حاصل برای آزمون ChIP برنامه‌ریزی‌شده کافی است
کنترل کیفیت مناسب تضمین می‌کند که مرحله برش فراصوتی کروماتین نتایجی تکرارپذیر و از نظر زیستی معنادار تولید کند.
نتیجه‌گیری: برش فراصوتی کروماتین برای پژوهش قابل‌اعتماد
برش قابل‌اعتماد کروماتین برای موفقیت پژوهش‌های ChIP و اپی‌ژنتیک ضروری است. قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی راهکاری قدرتمند ارائه می‌دهد، زیرا گسیختن دقیق، تکرارپذیر و بدون معرف کروماتین را در طیف گسترده‌ای از قالب‌های آزمایشی امکان‌پذیر می‌کند.
پژوهشگران با بهینه‌سازی دقیق پارامترهای فراصوت‌دهی، بررسی توزیع اندازه قطعات و انتخاب سامانه فراصوت‌دهی مناسب – چه سونیکاتور پروبی، چه VialTweeter چندلوله‌ای یا سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP با ظرفیت پردازش بالا – می‌توانند به قطعه‌قطعه‌سازی یکنواخت کروماتین دست یابند که به دستیابی به نتایج باکیفیت ChIP و ChIP-seq کمک می‌کند.
با گسترش پژوهش‌های اپی‌ژنتیک به‌سوی ظرفیت پردازش بالاتر و تکرارپذیری بیشتر آزمایش‌ها، برش فراصوتی کروماتین همچنان یکی از انعطاف‌پذیرترین و قابل‌اعتمادترین روش‌های موجود برای آزمایشگاه‌های مدرن زیست‌شناسی مولکولی است.
طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان
دستگاه‌های فراصوت Hielscher به بالاترین استانداردهای کیفیت و طراحی خود شهرت دارند. استحکام و کاربری آسان، ادغام روان دستگاه‌های فراصوت ما را در تأسیسات صنعتی امکان‌پذیر می‌کند. دستگاه‌های فراصوت Hielscher به‌راحتی از عهده شرایط سخت و محیط‌های دشوار برمی‌آیند.
Hielscher Ultrasonics شرکتی دارای گواهینامه ISO است و بر دستگاه‌های فراصوت با عملکرد بالا که از فناوری روز و کاربری آسان برخوردارند، تأکید ویژه‌ای دارد. البته دستگاه‌های فراصوت Hielscher با CE انطباق دارند و الزامات UL، CSA و RoHs را برآورده می‌کنند.
رک لوله تحت فراصوت‌دهی در UIP400MTP برای برش کروماتین
منابع علمی / مراجع
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
پرسش‌های متداول
کروماتین چیست؟
کروماتین کمپلکس ساختاری DNA و پروتئین‌های مرتبط با آن است که ماده ژنتیکی را در هسته سلول‌های یوکاریوتی سازمان‌دهی می‌کند. پروتئین‌های اصلی کروماتین، هیستون‌ها هستند که DNA به دور آن‌ها می‌پیچد و نوکلئوزوم‌ها را تشکیل می‌دهد. این سازمان‌دهی DNA را فشرده می‌کند و هم‌زمان دسترسی به اطلاعات ژنتیکی را برای فرایندهایی مانند رونویسی، همانندسازی و ترمیم DNA تنظیم می‌کند.
انواع کروماتین کدام‌اند؟
کروماتین به‌طور کلی به دو شکل اصلی تقسیم می‌شود: یوکروماتین و هتروکروماتین. یوکروماتین ساختاری کم‌تراکم دارد و از نظر رونویسی فعال است و به دستگاه رونویسی امکان می‌دهد به‌آسانی به ژن‌ها دسترسی داشته باشد. هتروکروماتین متراکم‌تر است و از نظر رونویسی غیرفعال است و معمولاً حاوی توالی‌های تکراری DNA یا ژن‌های خاموش‌شده است. هتروکروماتین را می‌توان به هتروکروماتین دائمی، که همواره متراکم باقی می‌ماند، و هتروکروماتین اختیاری، که بسته به شرایط سلولی می‌تواند بین حالت‌های فعال و غیرفعال جابه‌جا شود، تقسیم کرد.
ایجاد پیوند عرضی چیست؟
ایجاد پیوند عرضی فرایندی بیوشیمیایی است که برای پایدارسازی برهم‌کنش‌های میان زیست‌مولکول‌ها از طریق تشکیل پیوندهای کووالانسی بین آن‌ها استفاده می‌شود. در پژوهش کروماتین، ایجاد پیوند عرضی معمولاً برای حفظ برهم‌کنش‌های پروتئین–DNA درون کروماتین پیش از تحلیل به کار می‌رود. مواد شیمیایی مانند فرمالدهید معمولاً برای ایجاد پیوندهای کووالانسی برگشت‌پذیر بین DNA و پروتئین‌های مرتبط با آن استفاده می‌شوند و عملاً برهم‌کنش‌های مولکولی را در یک لحظه مشخص از زمان «ثابت» می‌کنند. این پایدارسازی امکان قطعه‌قطعه‌سازی و پردازش کمپلکس‌های کروماتین را بدون از دست رفتن ارتباطات طبیعی بین DNA و پروتئین‌های تنظیمی فراهم می‌کند؛ امری که برای روش‌هایی مانند رسوب‌دهی ایمنی کروماتین (ChIP) ضروری است.
ChIP چیست؟
رسوب‌دهی ایمنی کروماتین (ChIP) روشی در زیست‌شناسی مولکولی است که برای بررسی برهم‌کنش‌های بین پروتئین‌ها و DNA درون کروماتین استفاده می‌شود. در این روش، کمپلکس‌های DNA–پروتئین ابتدا، معمولاً با ایجاد پیوندهای عرضی، پایدار می‌شوند و سپس کروماتین قطعه‌قطعه می‌شود. از آنتی‌بادی‌های اختصاصی یک پروتئین هدف برای رسوب‌دهی ایمنی کمپلکس‌های پروتئین–DNA استفاده می‌شود که امکان جداسازی و تحلیل توالی‌های DNA مرتبط را فراهم می‌کند.
ChIP چه کاربردی دارد؟
ChIP برای شناسایی نواحی ژنومی متصل به پروتئین‌های مشخصِ مرتبط با DNA، مانند فاکتورهای رونویسی، تغییرات هیستونی یا پروتئین‌های تنظیمی مرتبط با کروماتین، استفاده می‌شود. این روش کاربرد گسترده‌ای در مطالعه تنظیم ژن، تغییرات اپی‌ژنتیکی، جایگاه‌های اتصال فاکتورهای رونویسی و ساختار کروماتین دارد. هنگامی که با روش‌های تحلیلی مراحل بعدی، مانند PCR کمی (ChIP-qPCR) یا توالی‌یابی با ظرفیت پردازش بالا (ChIP-seq)، ترکیب می‌شود، امکان نقشه‌برداری برهم‌کنش‌های پروتئین–DNA در سراسر ژنوم را فراهم می‌کند.
انواع ChIP کدام‌اند؟
بسته به طراحی آزمایش و تحلیل مراحل بعدی، گونه‌های مختلفی از رسوب‌دهی ایمنی کروماتین وجود دارد. رایج‌ترین رویکردها شامل ChIP-qPCR است که غنی‌شدگی نواحی مشخص ژنومی را به‌صورت کمی می‌سنجد؛ ChIP-seq که از توالی‌یابی نسل جدید برای نقشه‌برداری برهم‌کنش‌های پروتئین–DNA در سراسر ژنوم استفاده می‌کند؛ و ChIP-chip که ChIP را با تحلیل ریزآرایه DNA ترکیب می‌کند. گونه‌های دیگری مانند ChIP در حالت طبیعی (N-ChIP)، که کروماتین فاقد پیوندهای عرضی را تحلیل می‌کند، و ChIP با پیوندهای عرضی (X-ChIP)، که از ایجاد پیوندهای عرضی شیمیایی برای پایدارسازی برهم‌کنش‌های پروتئین–DNA استفاده می‌کند، نیز بسته به پرسش زیستی مورد بررسی به‌طور گسترده به کار می‌روند.
برش کروماتین با ظرفیت پردازش بالا با سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را در مقیاس‌های مختلف، از آزمایشگاهی تا صنعتی، تولید می‌کند.