Ultraschallgestützte Peptidsynthese mit der TAGGING-Technik
Die Peptidsynthese ist ein Grundpfeiler der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung. Herkömmliche Methoden – die Festphasenpeptidsynthese (SPPS) und die klassische Kopplung in Lösung – bleiben jedoch arbeitsintensiv, verbrauchen unnötig viele Reagenzien und lassen sich nur schwer auf größere Maßstäbe übertragen. Eine effizientere Alternative bietet die Kombination zweier orthogonaler Strategien: der TAGGING-Technik mit einer temporären Ankergruppe für den Peptidaufbau in Lösung und der Ultraschallbehandlung (sonochemischen Verarbeitung) zur Beschleunigung von Kopplungs-, Entschützungs- und Aufarbeitungsschritten. Gemeinsam ermöglichen sie die Herstellung therapeutischer Peptide – wie des antibiotisch und gegen Krebs wirksamen Lipopeptids Lipobactin – vom Grammmaßstab bis zur Großproduktion mit hoher Reinheit, geringerem Reinigungsaufwand und deutlich weniger manuellen Arbeitsschritten.
Welche Vorteile bietet die ultraschallgestützte Peptidsynthese?
- Wirtschaftlichkeit der Synthese in Lösung: Die Reaktionen laufen in Lösung ab und verbrauchen deutlich weniger Aminosäuren als die Festphasenpeptidsynthese
- Reinigung durch Filtration: Das TAG-gebundene Peptid fällt in polaren Lösungsmitteln aus, sodass Zwischenprodukte durch einfache Filtration isoliert werden – eine Säulenchromatographie oder Charakterisierung nach jedem Schritt ist nicht erforderlich.
- Erhebliche Arbeitsersparnis: Der Wegfall von Zwischenreinigung und spektroskopischen Kontrollen spart über eine vollständige Synthesekampagne hinweg zahlreiche Arbeitsstunden.
- Sonochemische Beschleunigung: Die Beschallung verkürzt jeden entscheidenden Schritt – Fmoc-Entschützung, Seitenkettenkopplung, Cyclisierung und globale Entschützung – ohne die Selektivität zu beeinträchtigen.
- Hohe Ausbeuten, hohe Reinheit: Jede Fragmentkopplung und der abschließende Aufbau von Lipobactin verlaufen mit hoher Ausbeute; die globale Entschützung liefert das Zielprodukt mit einer Ausbeute von ~83 %.
- Eignung für die Großproduktion: Die TAGGING-Technik wird ausdrücklich als Verfahren beschrieben, das die Herstellung von Peptiden im Großmaßstab mit höchster Reinheit ermöglicht. Damit bietet sie einen praktikablen Weg zu Gramm- und Kilogrammmengen therapeutisch wichtiger Lipopeptide.
- Vollständige Methodenkompatibilität: Der Ansatz ist vollständig mit der herkömmlichen SPPS und der Chemie in Lösung kompatibel, sodass bestehende Schutzgruppenstrategien (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) und Kopplungsreagenzien (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) unverändert übernommen werden können.
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Was ist die TAGGING-Technik?
Beim TAG-Ansatz wird ein Peptidfragment kovalent an eine abspaltbare, harzähnliche Ankergruppe (TAG) gebunden, die in Lösung bleibt. Dadurch lässt sich die wachsende Kette wie ein Festphasenpeptid handhaben, jedoch in der Flüssigphase:
- Nach jeder Kopplung oder Entschützung wird das TAG-gebundene Peptid durch einfache Filtration oder Fällung in polaren Medien oder Antisolventien als Feststoff zurückgewonnen, während lösliche Verunreinigungen und Nebenprodukte ausgewaschen werden.
- Da das Peptid an den Linker gebunden bleibt, entfallen die Säulenchromatographie und die vollständige Charakterisierung jedes Zwischenprodukts weitgehend. Dies spart erheblich Zeit und Arbeitsaufwand.
- Die Reaktionen können in Lösung durchgeführt werden und benötigen dabei deutlich weniger Aminosäuren als die SPPS. Das Endprodukt wird gegen Ende der Synthese durch Abspaltung der TAG-Gruppe freigesetzt.
Für Lipobactin wurden bei der Retrosynthese drei Fragmente verwendet – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH und das Lipidfragment C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH –, die mittels einer Fragmentkondensationsstrategie gekoppelt wurden, um das lange Peptid mit sehr hohen Ausbeuten zu erhalten. (vgl. Ramya et al., 2025)
Die TAG-gestützte vollständige Synthese des Peptids Lipobactin wird durch Beschallung beschleunigt.
(Studie: Ramya et al., 2025)
Wie die Beschallung die Peptidsynthese in Lösung verbessert
Die Ultraschallbehandlung wird eingesetzt, um die wichtigsten Schritte in Lösung zu intensivieren und zu verkürzen. Bei der von Ramya et al. (2025) beschriebenen Lipobactin-Synthese wird die Beschallung für folgende Schritte eingesetzt:
Da die TAG-Chemie Zwischenprodukte bereits als filtrierbare Feststoffe liefert, ergänzen sich Ultraschallbehandlung und TAGGING: Ultraschall beschleunigt den Stofftransport, die Durchmischung und die Reaktionskinetik, während der Anker das Peptid als rückgewinnbaren Feststoff hält und so einen sauberen Arbeitsablauf mit geringem Chromatographieaufwand ermöglicht.
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Einfache Maßstabsvergrößerung bei der Herstellung hochreiner Peptide durch Beschallung
Eine häufige Herausforderung bei der Übertragung von Prozessen zur Herstellung von Peptiden und Peptidarzneimitteln aus dem Labor in die Produktion besteht darin, den sonochemischen Effekt bei größeren Volumina und im kontinuierlichen Durchfluss aufrechtzuerhalten. Hielscher begegnet dieser Herausforderung mit einer lückenlosen Palette von Ultraschallprozessoren vom Labor- bis zum industriellen Produktionsmaßstab, die validierte, reproduzierbare Leistung und dokumentierte Prozesskontrolle bieten.
Industrielles Ultraschallgerät UIP4000hdT (4000W, 20kHz) für die ultraschallgestützte Peptidsynthese
Häufig gestellte Fragen zur ultraschallgestützten TAG-Peptidsynthese
Was ist die Flüssigphasenpeptidsynthese (LPPS)?
Die Flüssigphasenpeptidsynthese (LPPS) ist eine Methode zum schrittweisen Aufbau von Peptiden in Lösung mit klassischen Verfahren der organischen Chemie. Sie ist eine der vier Hauptmethoden zur Herstellung von Peptiden und dafür bekannt, kosteneffizient, skalierbar und die umweltfreundlichste unter den Peptidsynthesemethoden zu sein. Sie eignet sich besonders gut für kürzere Peptide. Bei längeren Sequenzen können jedoch Schwierigkeiten auftreten, da es anspruchsvoll ist, gleichmäßige Reaktionsabläufe und die Löslichkeit aufrechtzuerhalten sowie unerwünschte Nebenprodukte zu entfernen.
Wie verbessert Ultraschall die Flüssigphasenpeptidsynthese?
Ultraschall (Beschallung) verbessert die LPPS, indem er sowohl Kopplungs- als auch Entschützungsschritte beschleunigt. Die Ultraschallwellen verbessern den Stofftransport und die Reaktionskinetik, was zu folgenden Vorteilen führt:
- Kürzere Reaktionszeiten: Kopplungs- und Entschützungszyklen lassen sich deutlich verkürzen
- Höhere Ausbeuten: vollständigere Umsetzung bei jedem Schritt
- Verbesserte Reinheit des Rohprodukts: weniger Nebenprodukte aus unvollständigen Kopplungen
- Geringerer Reagenzienverbrauch: durch schnellere, effizientere Reaktionen werden weniger Äquivalente an Kopplungsreagenzien und Aminosäuren benötigt
Was ist die TAG-gestützte Peptidsynthese (TAPS)?
Die TAG-gestützte Peptidsynthese (TAPS) ist ein Sonderfall der Flüssigphasenpeptidsynthese, bei dem Peptide schrittweise in Lösung mithilfe löslicher organischer Tags anstelle eines festen Trägers aufgebaut werden. Diese Tags, die den festen Trägern der SPPS entsprechen, vereinfachen die Isolierung nach jedem Syntheseschritt, indem sie eine Abtrennung durch Fällung, Filtration oder Extraktion ermöglichen. Die Tags müssen sich in organischen Lösungsmitteln lösen und dabei von anderen Materialien unterscheidbar bleiben.
Wie verbessert Ultraschall den TAGGING-Prozess?
Die Kombination von Ultraschallbehandlung und TAG-gestützter Synthese bietet folgende Vorteile:
- Schnellere Kopplungs- und Entschützungszyklen – Ultraschall beschleunigt die Reaktionen in Lösung und verkürzt dadurch die Zeit pro Schritt
- Verbesserte Löslichkeit und verbesserter Stofftransport – Ultraschallkavitation trägt dazu bei, die Homogenität des mit einem Tag versehenen Peptids in Lösung aufrechtzuerhalten. Dies ist entscheidend, da die Löslichkeit ein wesentlicher Vorteil der TAPS gegenüber der SPPS ist
- Geringerer Reagenzieneinsatz – eine höhere Reaktionseffizienz bedeutet, dass weniger Äquivalente an Aminosäuren und Kopplungsreagenzien benötigt werden
- Vollständigere Reaktionen – weniger Nebenprodukte aus unvollständigen Kopplungen führen zu höherer Rohproduktreinheit und vereinfachter anschließender Reinigung
Ein bemerkenswertes Beispiel ist die TAG-gestützte und ultraschallvermittelte Totalsynthese von Lipobactin. Sie zeigte, dass die TAGGING-Technik vollständig mit Verfahren in Lösung kompatibel ist und die Ultraschallbehandlung bei jedem Schritt hohe Ausbeuten ermöglicht. (vgl. Ramya et al., 2025)
Welche Peptidlängen lassen sich mit ultraschallgestützter TAPS herstellen?
Kurze bis mittellange Peptide (~5–20 Aminosäurereste) bilden den optimalen Anwendungsbereich, in dem TAPS hohe Reinheit und zuverlässige Ergebnisse liefert.
Längere Peptide lassen sich über eine Fragmentkondensationsstrategie herstellen: Kleinere Fragmente (6–10-Mere) werden am Tag synthetisiert und anschließend miteinander gekoppelt, um das Zielpeptid in voller Länge aufzubauen.
Für sehr lange oder komplexe Zielpeptide kann ein kombinierter SPPS/TAPS-Ansatz eingesetzt werden.
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Lässt sich die ultraschallgestützte Flüssigphasenpeptidsynthese auf die industrielle Produktion übertragen?
Ja, industrielle Ultraschallgeräte – wie die Hielscher-Modelle UIP2000hdT oder UIP4000hdT – lassen sich in Chargenreaktoren und Durchflusszellen integrieren und ermöglichen so die Peptidproduktion im Großmaßstab. Durch die Nachrüstung bestehender Reaktoren lassen sich etablierte Peptidsyntheseprozesse verbessern.
Was sind die wichtigsten Vorteile der ultraschallgestützten LPPS gegenüber der herkömmlichen LPPS?
- Geschwindigkeit: die Reaktionszeiten werden bei jedem Kopplungs- und Entschützungsschritt erheblich verkürzt.
- Effizienz: höhere Ausbeuten pro Schritt führen bei Peptiden mit mehreren Aminosäureresten zu einer höheren Gesamtausbeute.
- Nachhaltigkeit: weniger Reagenzienäquivalente und möglicherweise weniger Lösungsmittel durch schnellere Reaktionen.
- Zugänglichkeit: erfordert lediglich ein herkömmliches Ultraschallbad und keine spezialisierte Geräteausstattung.
- Kompatibilität: funktioniert mit gängigen Kopplungsreagenzien (DIC, HATU, TBTU, Oxyma usw.) und Schutzgruppenstrategien (Boc, Fmoc).
Literatur / Quellen
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
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