Skalierung der Peptidsynthese: Ultraschallstrategien für Chargen- und Durchflussverfahren
Die ultraschallunterstützte Peptidsynthese kombiniert bewährte Peptidchemie mit hochfrequenter mechanischer Energie, um Reaktions- und Transportprozesse zu beschleunigen. Akustische Kavitation – die Bildung und das Kollabieren von mikroskopischen Blasen – führt zu intensiver lokaler Durchmischung, Mikrostrahlen und Scherkräften. Bei der Peptidsynthese verbessern diese Effekte den Reagenztransport, die Harzbenetzung, die Auflösung und die Aufbrechung von Aggregaten. Niederfrequenter Ultraschall dient daher in erster Linie als Mittel zur Prozessintensivierung: Er ersetzt die Kopplungschemie nicht, kann jedoch die Kopplung, Entschützung, das Waschen, die Spaltung und die Nachbehandlung erheblich beschleunigen und effizienter gestalten.
Die Herausforderung der Skalierung der Peptidproduktion
Die Skalierung der Peptidproduktion vom Labor auf die industrielle Fertigung ist eine Herausforderung, da sich kleine Ineffizienzen über viele Kupplungs- und Entschützungszyklen hinweg summieren, was die Ausbeute verringert und zu schwer zu entfernenden Verunreinigungen führt. Größere Reaktoren bringen zudem Einschränkungen hinsichtlich Durchmischung, Wärmeübertragung, Harzquellung und Reagenztransport mit sich, während der Lösungsmittelverbrauch, der Reinigungsaufwand und die Produktionskosten stark ansteigen. Ein erfolgreiches Scale-up muss daher die Reaktionsgleichmäßigkeit und Produktqualität gewährleisten und gleichzeitig einen reproduzierbaren Durchsatz, eine effiziente Ressourcennutzung sowie eine präzise Steuerung aller kritischen Prozessparameter ermöglichen.
Pharma-Charge mit dem Ultraschallgerät UIP2000hdT zur Verbesserung der Peptidsynthese
Strategien zur ultraschallunterstützten Peptidsynthese
Ultraschallgestützte Peptidsynthese in fester Phase
Die Fmoc-Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) ist die am intensivsten untersuchte Ultraschallstrategie. Die Beschallung verbessert das Eindringen von Entschützungs- und Kupplungsreagenzien in gequollene Polymerkügelchen und reduziert gleichzeitig die stagnierenden Grenzschichten um das Harz herum. Außerdem kann sie die Aggregation auf dem Harz aufbrechen, eine wichtige Ursache für unvollständige Umwandlung bei hydrophoben und anderen „schwierig“ Sequenzen.
Experimentelle Studien haben gezeigt, dass sich biologisch aktive Peptide mit bis zu 44 Aminosäureresten ultraschallunterstützt synthetisieren lassen, und zwar bei geringerem Materialverbrauch und kürzeren Reaktionszeiten, ohne dass unter den beschriebenen Bedingungen eine Zunahme der wichtigsten Nebenreaktionen zu beobachten war. (vgl. Merlino et al., 2019)
Eine weitere Studie berichtete von einer vier- bis vierzehnfachen Verkürzung der Assemblierungszeit für ausgewählte Peptide; ein 25-Mer mit hohem Anteil an hydrophoben Resten wurde in 347 Minuten assembliert. (vgl. Silva et al., 2021)
Ultraschall kann bei folgenden Anlässen eingesetzt werden:
- Quellung des Harzes und Austausch der Reagenzien
- Fmoc- oder Boc-Entschutzung
- Aminosäureaktivierung und -kopplung
- Zwischenwäsche
- Zyklisierung auf dem Harz
- Abspaltung des fertigen Peptids vom Träger
Flüssigphasen- und markergestützte Synthese
Ultraschall kann zudem die herkömmliche Peptidsynthese in flüssiger Phase intensivieren, indem er die Auflösung, die Dispersion von Reagenzien und den Stoffaustausch in heterogenen oder viskosen Gemischen beschleunigt. Der Nutzen ist in der Regel am größten, wenn der Prozess durch das Mischen oder den Transport begrenzt ist; bei einer vollständig homogenen Reaktion, die ausschließlich durch die intrinsische chemische Kinetik gesteuert wird, kann die Verbesserung geringer ausfallen.
Bei der tag-gestützten Peptidsynthese wird das wachsende Peptid an einen löslichen oder ausfällbaren organischen Anker gebunden. Die Reaktionen finden in Lösung statt; anschließend wird das markierte Zwischenprodukt durch Ausfällung oder Filtration gewonnen. Durch Ultraschallbehandlung lassen sich Kupplung, Entschützung, Cyclisierung und Tag-Spaltung beschleunigen, während schwer lösliche Zwischenprodukte in einem dispergierten Zustand gehalten werden.
| Technik | Wie die Ultraschallbehandlung dies fördert | Bedeutung und Grenzen |
|---|---|---|
| Fmoc-Festphasen-Peptidsynthese | Die Ultraschallbehandlung beschleunigt das Eindringen von Piperidin und die Entfernung von Fmoc-Produkten; verbessert den Transport aktivierter Aminosäuren in das gequollene Harz; verhindert die Aggregation auf dem Harz | Stärkste Evidenz und in der Regel der größte Nutzen |
| Boc-Festphasensynthese | Die Ultraschallbehandlung verbessert das Eindringen der Säure, den Reagenzaustausch, die Kopplung und das Waschen in ähnlicher Weise wie bei der Fmoc-Chemie | Beim Umgang mit Säuren und beim Erhitzen ist Vorsicht geboten |
| Lösungs-/Flüssigphasensynthese | Die Ultraschallbehandlung verbessert die Auflösung geschützter Aminosäuren, zersetzt Ausfällungen und erhöht den Kontakt bei zweiphasigen Reaktionen oder Reaktionen in Suspension. | Der Nutzen ist geringer, wenn die Reaktion bereits homogen und chemisch geschwindigkeitsbegrenzt ist. |
| Synthese auf Basis von Soluble-Tag oder Präzipitation | Durch Ultraschallbehandlung bleiben markierte Zwischenprodukte während der Kopplung dispergiert, was die Auflösung vor der Filtration oder Ausfällung verbessern kann. | Nützlich für schwer lösliche oder großvolumige Zubereitungen; Ultraschall unterstützt vor allem die Handhabung und den Stoffaustausch |
| Fließ- oder kontinuierliche Synthese | Die Ultraschallbehandlung trägt dazu bei, den Kontakt zwischen Harz und Flüssigkeit aufrechtzuerhalten und lokale Stauzonen oder Aggregationen zu verhindern. | Skalierung mit Durchflusszellenkonstruktion für eine gleichmäßige Ultraschallbestrahlung |
| Fragmentligation und Zyklisierung | Durch Ultraschallbehandlung lassen sich hydrophobe Fragmente löslich machen, Aggregate aufbrechen und der intermolekulare Kontakt verbessern. | Es beschleunigt nicht grundsätzlich jede endogene chemische Ligation oder Makrozyklisierung; eine übermäßige Verdünnung oder intermolekulare Aggregation kann weiterhin vorherrschend sein. |
| Enzymatische Peptidsynthese | Bei geeigneter Intensität kann die Ultraschallbehandlung die Enzymdynamik verändern und den Substrattransfer verbessern, insbesondere bei immobilisierten Enzymen oder zweiphasigen Medien. | Stark enzymabhängig; eine zu hohe Leistung führt zur Entfaltung oder Inaktivierung |
| Ribosomale/rekombinante Synthese | Keine direkten Auswirkungen auf die Übersetzung | Die Ultraschallbehandlung wird hauptsächlich zur Zellaufschluss nach der Expression eingesetzt. |
Ultraschall-Skalierung: Chargen-, Umwälz- und Durchflussverfahren
Hielscher-Ultraschallgeräte lassen sich nahtlos in Ihre spezifische Produktionsanlage zur Peptidsynthese integrieren.
Für die Skalierung kommen drei Reaktorkonfigurationen in Frage:
- Die Chargenbeschallung ist einfach und flexibel, doch mit zunehmendem Behältervolumen wird es schwieriger, eine optimale, homogene Beschallung zu erzielen.
- Bei der Umwälzverarbeitung wird der Reaktorinhalt wiederholt durch eine Ultraschall-Durchflusszelle gepumpt, was eine gleichmäßigere Behandlung gewährleistet und gleichzeitig die Flexibilität bei der Chargenverarbeitung bewahrt.
- Beim kontinuierlichen Durchfluss wird der Reaktionsstrom durch eine oder mehrere geregelte Ultraschallzonen geleitet. Verweilzeit, Durchflussrate und Energiezufuhr lassen sich präzise festlegen, wodurch sich dieses Verfahren als bevorzugte Architektur für eine reproduzierbare Produktion mit hohem Durchsatz erweist.
Bei Verfahren auf Harzbasis müssen der Durchflussweg, die Pumpe und die Ventile auf die Perlengröße ausgelegt sein, damit es nicht zu Abrieb oder Verstopfungen kommt. Eine Alternative besteht darin, das Harz in einem Rührreaktor zu halten und nur die flüssige Phase durch die Ultraschallzelle zirkulieren zu lassen.
2x industrielle Ultraschallgeräte, Modell UIP4000hdT angeschlossen an einen Durchflusszellenreaktor aus Edelstahl zur Peptidherstellung.
Häufig gestellte Fragen zur Skalierung der Ultraschall-Peptidsynthese
Was ist die Ultraschall-Peptidsynthese?
Bei der Ultraschall-Peptidsynthese werden hochintensive Schallwellen eingesetzt, um die Durchmischung, den Stoffaustausch und die Reaktionskinetik während des Peptidaufbaus zu verbessern. Akustische Kavitation unterstützt das Eindringen der Reagenzien in das gequollene Harz, löst Aggregate auf und beschleunigt die Schritte der Kopplung, Entschützung, Waschung und Spaltung.
Inwiefern verbessert Ultraschall die Festphasen-Peptidsynthese?
Bei der ultraschallunterstützten Festphasen-Peptidsynthese (US-SPPS) verbessert die Ultraschallbehandlung den Kontakt zwischen dem an das Harz gebundenen Peptid und den gelösten Reagenzien. Dies kann die Reaktionszyklen verkürzen, eine vollständigere Kopplung fördern und Sequenzdeletionen reduzieren, insbesondere bei der Synthese von hydrophoben, zur Aggregation neigenden oder anderweitig schwer zu synthetisierenden Peptiden.
Kann die Ultraschallbehandlung die Peptidausbeute und -reinheit erhöhen?
Die Ultraschallbehandlung kann die Umwandlung, die Rohausbeute und die Reinheit verbessern, indem sie eine gleichmäßige Verteilung der Reagenzien fördert und unvollständige Kopplungen verringert. Das Ergebnis hängt von der Peptidsequenz, dem Harz, dem Lösungsmittel, der Kopplungschemie und den Ultraschallparametern ab, daher sollte jeder Prozess optimiert und analytisch validiert werden.
Welche Schritte der Peptidsynthese können mit Ultraschall behandelt werden?
Ultraschall kann die Quellung von Harz, die Entfernung von Fmoc- oder Boc-Schutzgruppen, die Kopplung von Aminosäuren, das Waschen, die Fragmentkondensation, die Cyclisierung und die Abspaltung vom festen Träger unterstützen. Außerdem kann er die Auflösung und den Stoffaustausch bei der Flüssigphasen- und der tag-gestützten Peptidsynthese verbessern.
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Eignet sich die Ultraschall-Peptidsynthese für schwierige Sequenzen?
Ja. Ultraschall ist besonders nützlich für hydrophobe und aggregationsanfällige Sequenzen, da Kavitation und Mikroströmung dazu beitragen, Aggregationen auf dem Harz aufzubrechen und den Zugang der Reagenzien zu den reaktiven Stellen zu verbessern. Bei schwierigen Kopplungen können dennoch optimierte Reagenzien, eine wiederholte Kopplung oder angepasste Reaktionsbedingungen erforderlich sein.
Lässt sich die Ultraschall-Peptidsynthese in größerem Maßstab durchführen?
Die Ultraschall-Peptidsynthese lässt sich von Laborversuchen auf die Chargen-, Rezirkulations- oder Durchflussproduktion übertragen. Die Skalierung wird erreicht, indem kritische Parameter wie Amplitude, spezifische Energie, Temperatur und Verweilzeit beibehalten werden, während gleichzeitig die Ultraschallleistung, die Sonotrodenfläche oder die Anzahl der Verarbeitungsmodule erhöht wird.
Was bedeutet lineare Skalierbarkeit in der Ultraschalltechnik?
Lineare Skalierbarkeit bedeutet, dass sich der Durchsatz in etwa proportional zur installierten Ultraschallleistung erhöhen lässt, wenn die erforderliche Energie pro Volumen und andere Prozessbedingungen konstant bleiben. So kann beispielsweise eine Verdopplung der effektiven Ultraschallleistung zu einer etwaigen Verdopplung der Durchflussrate führen, vorausgesetzt, die Reaktorgeometrie, die Temperatur und die Zielvorgaben für die Produktqualität bleiben unverändert.
Warum eignen sich Hielscher-Ultraschallgeräte für die Skalierung der Peptidproduktion?
Die Ultraschallgeräte von Hielscher decken Leistungsbereiche für Labor, Pilotanlagen und den industriellen Einsatz ab und zeichnen sich durch gleichbleibende, regelbare Betriebsparameter aus. Ihre einstellbare Amplitude, die automatische Datenerfassung, die Temperatur- und Drucküberwachung, die Kompatibilität mit Durchflusszellen sowie ihre modulare Konfiguration gewährleisten eine reproduzierbare Prozessübertragung und eine zuverlässige Produktion.
Können Hielscher-Ultraschallgeräte in der kontinuierlichen Peptidproduktion eingesetzt werden?
Ja. Die industriellen Ultraschallgeräte von Hielscher lassen sich in Umwälzkreisläufe und kontinuierliche Inline-Durchflussreaktoren integrieren. Diese Konfigurationen ermöglichen eine kontrollierte Verweilzeit und Energiezufuhr und reduzieren gleichzeitig Schwankungen zwischen den einzelnen Chargen. Die industriellen Anlagen sind für den kontinuierlichen 24/7-Betrieb unter anspruchsvollen Produktionsbedingungen ausgelegt.
Sind Ultraschallbäder oder Sonden-Ultraschallgeräte für die Peptidsynthese besser geeignet?
Ultraschallbäder können für die Erstuntersuchung und gleichzeitige Behandlung kleiner, geschlossener Gefäße praktisch sein. Sonden-Ultraschallgeräte leiten den Ultraschall direkt in das Medium ein und bieten dadurch eine höhere Intensität, eine bessere Parametersteuerung und eine größere Skalierbarkeit. Daher werden Sonden und Durchflusszellen in der Regel für die Pilot- und Industrieproduktion bevorzugt.
Wie wird die Temperatur bei der Ultraschall-Peptidsynthese geregelt?
Da durch die Ultraschallbehandlung Energie in das Reaktionsgemisch eingebracht wird, ist eine effektive Kühlung unerlässlich. Hielscher-Ultraschallgeräte sind mit doppelwandigen Behältern, externen Wärmetauschern, temperaturgesteuerter Rezirkulation und gepulster Ultraschallbehandlung erhältlich, sodass eine Überhitzung wirksam verhindert wird. Steckbare Temperatursensoren und programmierbare Temperaturgrenzwerte ermöglichen eine zuverlässige Temperaturüberwachung und -aufzeichnung während der gesamten Entwicklungs- und Produktionsphase.
Wie wähle ich einen Hielscher-Ultraschallapparat für die Peptidsynthese aus?
Die Auswahl hängt vom Chargenvolumen, der gewünschten Durchflussrate, dem Lösungsmittel, der Viskosität, dem Feststoff- oder Harzgehalt, dem erforderlichen spezifischen Energiebedarf und dem Produktionsplan ab. Durch Laborversuche wird der effektive Prozessbereich ermittelt, woraufhin eine Konfiguration aus Hielscher-Ultraschallgerät, Sonotrode und Durchflusszelle für den beabsichtigten Durchsatz dimensioniert werden kann.
Literatur / Literaturhinweise
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
Hielscher Ultrasonics fertigt Hochleistungs-Ultraschall-Homogenisatoren vom Labor bis zum voll-kommerziellen Industriemaßstab.