Ultraschallgestützte Liposomenherstellung

Mittels Ultraschall hergestellte Liposomen weisen eine sehr hohe Einschlusseffizienz, eine hohe Beladungskapazität und eine gleichmäßig geringe Größe bei kugelförmiger Gestalt auf. Dadurch bieten ultraschallgestützt hergestellte Liposomen eine hervorragende Bioverfügbarkeit. Hielscher Ultrasonics bietet Ultraschallgeräte für die zuverlässige Herstellung von Liposomen in pharmazeutischer Qualität im Chargenbetrieb und im kontinuierlichen Betrieb.

Vorteile der ultraschallgestützten Liposomenherstellung

Die ultraschallgestützte liposomale Verkapselung ist ein Verfahren, bei dem Arzneistoffe oder andere therapeutische Wirkstoffe mithilfe von Ultraschallenergie in Liposomen eingeschlossen werden. Im Vergleich zu anderen Verfahren der liposomalen Verkapselung bietet die Ultraschallverkapselung mehrere Vorteile, die sie zum überlegenen Herstellungsverfahren machen.

• Hohe Beladung, hohe Einschlusseffizienz: Die ultraschallgestützte Liposomenherstellung ist dafür bekannt, Liposomen mit einer hohen Beladung an Wirkstoffen wie Vitamin C, Arzneistoffmolekülen usw. zu erzeugen. Gleichzeitig weist das Beschallungsverfahren eine hohe Einschlusseffizienz auf. Das bedeutet, dass ein hoher Anteil des Wirkstoffs durch die Ultraschallbehandlung verkapselt wird. Dadurch ist die Ultraschallbehandlung ein hocheffizientes Verfahren zur Liposomenherstellung.
• Gleichmäßig kleine Liposomen: Ein Vorteil der ultraschallgestützten liposomalen Verkapselung ist ihre Fähigkeit, sehr gleichmäßige Liposomen mit einer engen Größenverteilung herzustellen. Mit Ultraschallenergie lassen sich größere Liposomen oder Lipidaggregate in kleinere, gleichmäßigere Liposomen aufbrechen. Dadurch werden Größe und Form der Liposomen einheitlicher. Dies kann für Anwendungen zur Wirkstoffabgabe wichtig sein, bei denen die Partikelgröße die Pharmakokinetik und Wirksamkeit beeinflussen kann.
• Für beliebige Moleküle anwendbar: Ein weiterer Vorteil der ultraschallgestützten liposomalen Verkapselung ist ihre Fähigkeit, eine breite Palette von Arzneistoffen und anderen therapeutischen Wirkstoffen zu verkapseln. Das Verfahren kann sowohl hydrophile als auch hydrophobe Arzneistoffe verkapseln, was mit anderen Methoden schwierig sein kann. Darüber hinaus lassen sich mithilfe von Ultraschallenergie Makromoleküle und Nanopartikel verkapseln, die für andere Verkapselungsverfahren möglicherweise zu groß sind.
• Schnell und zuverlässig: Die ultraschallgestützte liposomale Verkapselung ist außerdem ein relativ einfaches und schnelles Verfahren. Sie erfordert weder aggressive Chemikalien noch hohe Temperaturen, die den zu verkapselnden therapeutischen Wirkstoffen schaden können.
• Scale-up: Darüber hinaus lässt sich das Verfahren problemlos auf die Produktion im großen Maßstab übertragen, wodurch es eine kosteneffiziente Option für Anwendungen zur Wirkstoffabgabe darstellt.

Zusammenfassend ist die ultraschallgestützte liposomale Verkapselung ein überlegenes Verfahren, da sie gleichmäßige Liposomen mit einer engen Größenverteilung erzeugen und eine breite Palette therapeutischer Wirkstoffe verkapseln kann sowie einfach und skalierbar ist.

Nach der Bildung eines Lipidfilms und der anschließenden Rehydratisierung wird die Beschallung eingesetzt, um den Einschluss von Wirkstoffen in das Liposom zu fördern. Darüber hinaus wird durch die Beschallung die gewünschte Liposomengröße erreicht.

Ultraschallgestützte Liposomenherstellung für Pharmazeutika und Kosmetika

Liposomen (lipidbasierte Vesikel), Transfersomen (ultradeformierbare Liposomen), Ethosomen (ultradeformierbare Vesikel mit hohem Alkoholgehalt) und Niosomen (synthetische Vesikel) sind mikroskopisch kleine Vesikel, die künstlich als kugelförmige Träger hergestellt werden können, in die sich aktive Moleküle verkapseln lassen. Diese Vesikel mit Durchmessern zwischen 25 und 5000 nm werden in der pharmazeutischen und kosmetischen Industrie häufig als Wirkstoffträger eingesetzt, beispielsweise zur oralen oder topischen Wirkstoffabgabe, in der Gentherapie und zur Immunisierung. Die Ultraschallbehandlung ist ein wissenschaftlich erprobtes Verfahren zur hocheffizienten Liposomenherstellung. Ultraschallgeräte von Hielscher erzeugen Liposomen mit hoher Wirkstoffbeladung und hervorragender Bioverfügbarkeit.

Liposomen und liposomale Formulierungen

Liposomen sind unilamellare, oligolamellare oder multilamellare vesikuläre Systeme und bestehen aus demselben Material wie eine Zellmembran (Lipiddoppelschicht). Hinsichtlich ihrer Zusammensetzung und Größe werden Liposomen wie folgt unterschieden:

• multilamellare Vesikel (MLV, 0,1–10μm)
• kleine unilamellare Vesikel (SUV, unter 100 nm)
• große unilamellare Vesikel (LUV, 100–500 nm)
• riesige unilamellare Vesikel (GUV, ≥1 μm)

Die Grundstruktur von Liposomen besteht aus Phospholipiden. Phospholipide besitzen eine hydrophile Kopfgruppe und eine hydrophobe Schwanzgruppe, die aus einer langen Kohlenwasserstoffkette besteht.
Die Liposomenmembran hat eine sehr ähnliche Zusammensetzung wie die Hautbarriere, sodass sich Liposomen leicht in die menschliche Haut integrieren lassen. Wenn die Liposomen mit der Haut verschmelzen, können sie die eingeschlossenen Wirkstoffe direkt am Zielort freisetzen, wo diese ihre Funktionen erfüllen können. Somit verbessern Liposomen die Penetrierbarkeit beziehungsweise Permeabilität der Haut für die eingeschlossenen pharmazeutischen und kosmetischen Wirkstoffe. Auch Liposomen ohne verkapselte Wirkstoffe, also leere Vesikel, sind wirksame Substanzen für die Haut, da Phosphatidylcholin zwei essenzielle Bestandteile enthält, die der menschliche Organismus nicht selbst herstellen kann: Linolsäure und Cholin.
Liposomen werden für pharmazeutische, kosmetische und biochemische Zwecke als biokompatible Träger von Arzneistoffen, Peptiden, Proteinen, Plasmid-DNA, Antisense-Oligonukleotiden oder Ribozymen eingesetzt. Die enorme Vielfalt hinsichtlich der Partikelgröße und der physikalischen Parameter der Lipide bietet ein attraktives Potenzial zur Entwicklung maßgeschneiderter Träger für ein breites Anwendungsspektrum. (Ulrich 2002)

Ultraschallgestützte Liposomenbildung

Liposomen können mithilfe von Ultraschall gebildet werden. Das Ausgangsmaterial für die Liposomenherstellung sind amphiphile Moleküle, die von biologischen Membranlipiden abgeleitet sind oder auf diesen basieren. Zur Bildung kleiner unilamellarer Vesikel (SUV) wird die Lipiddispersion in einem Eisbad schonend beschallt – beispielsweise mit dem handgeführten Ultraschallgerät UP50H (50W, 30kHz), dem VialTweeter oder dem Ultraschallreaktor CupHorn. Eine solche Ultraschallbehandlung dauert etwa 5 – 15 Minuten. Eine weitere Methode zur Herstellung kleiner unilamellarer Vesikel ist die Beschallung multilamellarer Liposomenvesikel.
Dinu-Pirvu et al. (2010) berichten über die Herstellung von Transfersomen durch Beschallung von MLV bei Raumtemperatur.
Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Ultraschallgeräte, Sonotroden und Zubehör und kann damit die am besten geeignete Ultraschallausrüstung für eine hocheffiziente liposomale Verkapselung in jedem Maßstab bereitstellen.

Ultraschallgestützte Verkapselung von Wirkstoffen in Liposomen

Liposomen dienen als Träger für Wirkstoffe wie Vitamine, therapeutische Moleküle, Peptide usw. Ultraschall ist ein wirksames Werkzeug zur Herstellung und Bildung von Liposomen für den Einschluss von Wirkstoffen. Gleichzeitig unterstützt die Beschallung den Verkapselungs- und Einschlussprozess, sodass Liposomen mit hoher Wirkstoffbeladung entstehen. Vor der Verkapselung neigen die Liposomen aufgrund der Wechselwirkungen zwischen den Oberflächenladungen der polaren Phospholipidköpfe zur Clusterbildung (vgl. Míckova et al. 2008); außerdem müssen sie geöffnet werden. Beispielsweise beschreiben Zhu et al. (2003) die Verkapselung von Biotinpulver in Liposomen mittels Ultraschallbehandlung. Nach der Zugabe des Biotinpulvers zur Vesikelsuspension wurde diese beschallt. Nach dieser Behandlung war das Biotin in den Liposomen eingeschlossen.
Erfahren Sie mehr über die ultraschallgestützte Verkapselung von GLP-1-Peptiden (z. B. Semaglutid) in Liposomen!

Liposomale Emulsionen mittels Ultraschallbehandlung

Um die pflegende Wirkung von Feuchtigkeits- oder Anti-Aging-Cremes, Lotionen, Gelen und anderen kosmezeutischen Formulierungen zu verstärken, werden den liposomalen Dispersionen Emulgatoren zugesetzt, um größere Lipidmengen zu stabilisieren. Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass die Aufnahmekapazität von Liposomen grundsätzlich begrenzt ist. Bei der Zugabe von Emulgatoren tritt dieser Effekt früher auf, und die zusätzlichen Emulgatoren schwächen die Affinität von Phosphatidylcholin zur Hautbarriere. Nanopartikel – bestehend aus Phosphatidylcholin und Lipiden – sind die Lösung für dieses Problem. Diese Nanopartikel bestehen aus einem Öltröpfchen, das von einer Monoschicht aus Phosphatidylcholin umgeben ist. Die Verwendung von Nanopartikeln ermöglicht Formulierungen, die mehr Lipide aufnehmen können und stabil bleiben, sodass keine zusätzlichen Emulgatoren erforderlich sind.
Die Ultraschallbehandlung ist ein bewährtes Verfahren zur Herstellung von Nanoemulsionen und Nanodispersionen. Ultraschall hoher Intensität liefert die erforderliche Leistung, um eine flüssige Phase (disperse Phase) in Form kleiner Tröpfchen in einer zweiten Phase (kontinuierliche Phase) zu dispergieren. In der Dispergierzone erzeugen implodierende Kavitationsblasen intensive Stoßwellen in der umgebenden Flüssigkeit und führen zur Bildung von Flüssigkeitsstrahlen mit hoher Strömungsgeschwindigkeit. Um die neu gebildeten Tröpfchen der dispersen Phase gegen Koaleszenz zu stabilisieren, werden der Emulsion Emulgatoren (oberflächenaktive Substanzen, Tenside) und Stabilisatoren zugesetzt. Da die Koaleszenz der Tröpfchen nach ihrer Zerkleinerung die endgültige Tröpfchengrößenverteilung beeinflusst, werden effizient stabilisierende Emulgatoren eingesetzt, um die endgültige Tröpfchengrößenverteilung auf dem Niveau der Verteilung unmittelbar nach der Tröpfchenzerkleinerung in der Ultraschalldispergierzone zu halten.

Liposomale Dispersionen mittels Ultraschallbehandlung

Liposomale Dispersionen auf Basis von ungesättigtem Phosphatidylcholin weisen eine geringe Oxidationsstabilität auf. Die Dispersion kann durch Antioxidantien stabilisiert werden, beispielsweise durch einen Komplex aus den Vitaminen C und E.
 

Liposomenbildung durch Umkehrphasenverdampfung mittels Beschallung

 
Ortan et al. (2002) erzielten in ihrer Studie zur ultraschallgestützten Formulierung von ätherischem Öl aus Anethum graveolens in Liposomen gute Ergebnisse. Nach der Beschallung lag die Größe der Liposomen zwischen 70–150 nm und die der MLV zwischen 230–475 nm; diese Werte blieben auch nach 2 Monaten annähernd konstant, stiegen jedoch nach 12 Monaten an, insbesondere in der SUV-Dispersion (siehe Histogramme unten). Die Stabilitätsmessung hinsichtlich des Verlusts an ätherischem Öl und der Größenverteilung zeigte ebenfalls, dass die liposomalen Dispersionen den Gehalt an flüchtigem Öl beibehielten. Dies deutet darauf hin, dass der Einschluss des ätherischen Öls in Liposomen dessen Stabilität erhöhte.

Ortan et al. (2009): Stabilität von MLV- und SUV-Dispersionen nach 1 Jahr. Die liposomalen Formulierungen wurden bei 4±1 ºC gelagert.

Ultraschallprozessoren von Hielscher sind die idealen Geräte für Anwendungen in der kosmetischen und pharmazeutischen Industrie. Systeme aus mehreren Ultraschallprozessoren mit jeweils bis zu 16.000 Watt bieten die erforderliche Kapazität, um diese Laboranwendung in ein effizientes Produktionsverfahren zur Herstellung fein dispergierter Emulsionen im kontinuierlichen Durchfluss oder im Chargenbetrieb zu übertragen – mit Ergebnissen, die mit denen der heute besten verfügbaren Hochdruckhomogenisatoren, beispielsweise mit Blendenventilen, vergleichbar sind. Neben dieser hohen Effizienz bei der kontinuierlichen Emulgierung sind Ultraschallgeräte von Hielscher sehr wartungsarm sowie einfach zu bedienen und zu reinigen. Der Ultraschall unterstützt sogar die Reinigung und Spülung. Die Ultraschallleistung ist einstellbar und kann an die jeweiligen Produkte und Emulgieranforderungen angepasst werden. Spezielle Durchflusszellenreaktoren, die den anspruchsvollen Anforderungen an CIP (Clean-in-Place, Reinigung im eingebauten Zustand) und SIP (Sterilize-in-Place, Sterilisation im eingebauten Zustand) entsprechen, sind ebenfalls erhältlich.

Häufig gestellte Fragen zu Liposomen

Welche Arten von Liposomen werden unterschieden?

Liposomen werden anhand ihrer Größe und der Anzahl ihrer Doppelschichten in verschiedene Typen eingeteilt. Dazu gehören:

• Kleine unilamellare Vesikel (SUV): Dies sind die kleinsten Liposomen mit einer einzigen Lipiddoppelschicht.
• Große unilamellare Vesikel (LUV): Sie sind größer als SUV und besitzen ebenfalls eine einzige Doppelschicht.
• Multilamellare Vesikel (MLV): Diese enthalten mehrere konzentrische Doppelschichten.
• Multivesikuläre Vesikel (MVV): Diese bestehen aus mehreren kleineren Vesikeln innerhalb eines größeren Vesikels.

 
Weitere spezialisierte Typen sind:

• PEGylierte Liposomen: Mit Polyethylenglykol (PEG) modifizierte Liposomen zur Verbesserung der Stabilität und Verlängerung der Zirkulationszeit.
• Nanoliposomen: Sehr kleine Liposomen, die typischerweise zur gezielten Wirkstoffabgabe eingesetzt werden.

Welche Vesikelstrukturen können Liposomen aufweisen?

Anhand ihrer Vesikelstruktur werden Liposomen außerdem in sieben Haupttypen eingeteilt:

• Große multilamellare Vesikel (MLV): Enthalten mehrere Doppelschichten.
• Oligolamellare Vesikel (OLV): Besitzen wenige Doppelschichten.
• Kleine unilamellare Vesikel (SUV): Die kleinsten Vesikel mit einer einzigen Doppelschicht.
• Mittelgroße unilamellare Vesikel (MUV): Von mittlerer Größe mit einer einzigen Doppelschicht.
• Große unilamellare Vesikel (LUV): Größere Vesikel mit einer einzigen Doppelschicht.
• Riesige unilamellare Vesikel (GUV): Sehr große Vesikel mit einer einzigen Doppelschicht.
• Multivesikuläre Vesikel (MVV): Mehrere Vesikel innerhalb eines einzigen großen Vesikels.

Was sind die Unterschiede zwischen Liposomen und Niosomen?

Liposomen und Niosomen unterscheiden sich hauptsächlich in ihrer Zusammensetzung:
Liposomen: Bestehen aus zweikettigen Phospholipiden, die entweder neutral oder geladen sein können.
Niosomen: Bestehen aus ungeladenen einkettigen Tensiden und Cholesterin.
Beide Strukturen entstehen durch Beschallung, die die Zusammenlagerung zu Vesikeln mit Doppelschichten fördert.

Was ist die ideale Größe eines Liposoms?

Für die therapeutische Wirkstoffabgabe liegt der ideale Durchmesser eines Liposoms theoretisch zwischen 50 und 200 Nanometern. Dieser Größenbereich optimiert die Stabilität und Bioverfügbarkeit. Die Beschallung wird häufig eingesetzt, um das Vesikel auf die gewünschte Größe zu verkleinern.

Können Liposomen hydrophile Arzneistoffe transportieren?

Ja, Liposomen können hydrophile Arzneistoffe transportieren. In biomedizinischen Anwendungen werden sie wegen ihrer Fähigkeit geschätzt, sowohl hydrophobe als auch hydrophile Wirkstoffe zu verkapseln. Darüber hinaus bieten sie eine hohe Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit, wodurch sie wirksame Systeme zur Wirkstoffabgabe sind.

Wie werden Liposomen hergestellt?

Die gängigsten Verfahren zur Liposomenherstellung sind das Dünnfilmverfahren und das Umkehrphasenverdampfungsverfahren.
Dünnfilmhydratisierungsverfahren:

1. Lösen Sie die Lipide in einem organischen Lösungsmittel.
2. Verdampfen Sie das Lösungsmittel, um einen dünnen Lipidfilm zu bilden.
3. Hydratisieren Sie den Film unter Beschallung mit einer wässrigen Lösung, um multilamellare Vesikel zu bilden.

Umkehrphasenverdampfungsverfahren:

1. Lösen Sie die Lipide in Wasser und Ethanol.
2. Beschallen Sie die Lösung bei 60°C etwa 10 Minuten lang, um eine Lipidpaste zu erzeugen.
3. Kühlen Sie die Lipidaufschlämmung ab und geben Sie unter Rühren tropfenweise Wasser oder Puffer hinzu.
4. Hydratisieren Sie die Suspension 1 Stunde lang, um multilamellare Vesikel zu bilden.
5. Verringern Sie die Liposomengröße durch weitere Beschallung.

Was sind Archaeosomen?

Archaeosomen sind Liposomen aus archaealen Lipiden, die für ihre Stabilität und Widerstandsfähigkeit gegenüber extremen Bedingungen bekannt sind. Diese Eigenschaften machen Archaeosomen besonders nützlich für die Wirkstoffabgabe und die Impfstoffentwicklung unter anspruchsvollen Umgebungsbedingungen.

Wie werden Archaeosomen hergestellt?

Beschallungsverfahren nach Pise (2022): Archaeosomen können aus der polaren Lipidfraktion „PLF“ von Sulfolobussolfataricus durch Beschallung bei 60°C hergestellt werden, ohne dass zusätzliche Lipide von außen zugeführt werden müssen. Bei 0°C wurden polare Lipide von Sulfolobusacidocaldarius wirksam beschallt, um Archaeosomen zu bilden. BMD-beladene Archaeosomen und konventionelle Liposomen sowie archaeale Lipide, die aus den Archaeen H. salinarum isoliert und mit Phosphatidylcholin angereichert wurden, wurden mithilfe von Beschallungsverfahren hergestellt. Beschallte Vesikel für die topische Wirkstoffabgabe wurden hergestellt, indem MLV-Dispersionen mit einem sonotrodenbasierten Ultraschallgerät UP50H von Hielscher bei 80 Prozent Amplitude für 4 Minuten beschallt wurden (siehe Abbildung links).

Literatur/Referenzen

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.