Sono-Synthese von Nano-Hydroxylapatit

Hydroxylapatit (HA oder HAp) ist häufig verwendete bioaktive Keramik, die sich aufgrund ihrer knochen-ähnlichen Struktur für medizinische Zwecke eignet. Die ultraschall-gestützte Synthese (Sono-Synthese) von Hydroxyapatit ist eine effektive Methode, um qualitativ hochwertiges, nanostrukturiertes HAp zu produzieren. Der sonochemische Syntheseweg erlaubt es, nano-kristallines HAp sowie modifizierte HAp-Partikel zu produzieren, z.B. Core-Shell-Nanosphären und Komposite.

Hydroxylapatit: Ein vielseitiges Mineral

Hydroxylapatit (HAp, auch HA) ist ein natürlich vorkommendes Mineral aus Calcium-Apatit mit der Formel Ca₅(PO₄)₃(OH). Um anzuzeigen, dass die Kristall-Einheitszelle aus zwei Einheiten besteht, wird in der Regel Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂geschrieben. Hydroxylapatit ist das letzte Hydroxyl-Mineral in der komplexen Apatit-Gruppe. Die OH-Ionen können durch Fluorid, Chlorid oder Calciumcarbonat ersetzt werden, so dass Fluorapatit oder Chlorapatit entstehen. Es kristallisiert im hexagonalen Kristallsystem und entwickelt meist kurz- bis langprismatische Kristalle. HAp ist als Knochenmaterial bekannt, da bis zu 50% des Knochens aus einer modifizierten Hydroxylapatit-Form bestehen.
In der Medizin gilt nanostrukturiertes poröses HAp als interessantes Material für künstliche Knochen. Aufgrund seiner guten Biokompatibilität mit Knochenmaterial und aufgrund seiner ähnlichen chemischen Zusammensetzung findet poröse HAp Keramik zahlreiche Anwendungen im biomedizinischen Bereich, z.B. für die Regeneration von Knochengewebe,die Zellproliferation und den Drug-Delivery.
"In der Knochengewebezüchtung (Bone Tissue Engineering) wird es als Füllmaterial und Knochenaufbaumaterial bei Knochendefekten, Knochentransplantationen und Revisionsprothesen-Operationen eingesetzt. Die große Partikeloberfläche führt zu einer hervorragenden Osteokonduktivität, Resorbierbarkeit, so dass das Knochengewebe schnell zusammenwächst." [Soypan et al. 2007] Daher werden bereits die meisten modernen Implantate mit Hydroxylapatit beschichtet.
Eine weitere vielversprechende Anwendung von mikrokristallinem Hydroxylapatit ist seine Verwendung als „Knochen aufbauendes“ Nahrungsergänzungsmittel mit einer deutlich besseren Absorption im Vergleich zu Kalzium.
Neben seiner Verwendung als Reparatur- und Aufbaumaterial für Knochen und Zähne wird HAp u.a. auch für Katalyseprozesse, in der Düngemittelproduktion, als Verbundstoff in pharmazeutischen Produkten, in der Protein-Chromatographie und Wasseraufbereitungsprozessen eingesetzt.

Hochleistung-Ultraschall: Effekte und Wirkung

Die Beschallung wird als ein Verfahren beschrieben, bei dem ein akustisches Feld verwendet wird, das mit einem flüssigen Medium gekoppelt ist. Die Ultraschallwellen breiten sich in der Flüssigkeit aus und erzeugen abwechselnd Hoch- und Niederdruckzyklen (Kompression und Verdünnung). In der Phase der Verdünnung entstehen kleine Vakuumblasen oder Hohlräume in der Flüssigkeit, die über mehrere Hoch-/Niederdruckzyklen wachsen, bis die Blase keine Energie mehr aufnehmen kann. In dieser Phase implodieren die Blasen gewaltsam während einer Kompressionsphase. Bei einem solchen Blasenkollaps wird eine große Menge Energie in Form von Schockwellen, hohen Temperaturen (ca. 5.000K) und Drücken (ca. 2.000atm) freigesetzt. Außerdem zeichnen sich diese "Hot Spots" durch sehr hohe Abkühlungsraten aus. Die Implosion der Blase führt auch zu Flüssigkeitsstrahlen mit einer Geschwindigkeit von bis zu 280 m/s. Dieses Phänomen wird als Kavitation bezeichnet.
Wenn diese extremen Kräfte, die während der Implosion der Kavitationsblasen generiert werden, sich im beschallten Medium ausbreiten, werden Partikel und Tröpfchen beeinflusst – Tropfen und Partikel werden beschleunigt und prallen auseinander. Durch die interpartikuläre Kollision werden Tröpfen zerrissen und Partikel zerschlagen. Dadurch werden Effekte wie die Vermahlung, Dispergierung, Desagglomeration und Emulgierung erreicht. Partikel und Tropfen können durch die Beschallung effektiv auf submikron - und nano-skalige Größen reduziert werden.
Neben den mechanischen Effekten können durch eine intensive Beschallung (Sonorisierung) freie Radikale erzeugt, Moleküle geschert und Partikeloberflächen aktiviert werden. Der Einfluss von Hochleistungsultraschll auf chemische Systeme wird als Sonochemie bezeichnet.

Sono-Synthese

Mit einer Ultraschall-Behandlung von Flüssigkeiten bzw. Slurries können sehr feine Partikel mit sehr gleichmäßiger Verteilung erzeugt werden, so dass während Fällungsreaktionen eine hohe Dichte an Kristallisationskeimen entsteht.
Hydroxylapatit-Partikel, die mit Ultraschall synthetisiert wurden, zeigen eine geringere Agglomeration. Die geringere Tendenz zur Agglomeration von ultraschall-synthetisierten HAp bestätigt Poinern et al. (2009) in seinen Analysen, z.B. FESEM (Field Emission Scanning Electron Microscopy).

Ultraschall unterstützt und fördert die chemische Reaktion durch die Ultraschallkavitation und ihre physikalischen Effekte, welche die Partikelmorphologie direkt während der Wachstumsphase beeinflussen. Die wesentlichen Vorteile der Ultraschall-Synthese liegen in der Herstellung einer sehr feinen Reaktionslösung, wodurch

die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht wird,
die Verarbeitungszeit reduziert wird
und die Energieeffizienz gesteigert wird.

Poinern et al. (2011) hat einen nasschemischen Syntheseweg entwickelt, bei dem Calciumnitrat-Tetrahydrat (Ca[NO3]2 · 4H2O) und Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) als Hauptedukte verwendet werden. Um den pH-Wert während der Synthese zu kontrollieren, wurde Ammoniumhydroxid (NH4OH) hinzugefügt.
Ponnern et al. (2011) verwendete in seiner Studie den Ultraschallprozessor UP50H (50 W, 30 kHz, MS7-Sonotrode mit einem Durchmesser von 7mm) von Hielscher Ultrasonics.

Mit Ultraschall dispergiertes Calcium-Hydroxylapatit

Mit Ultraschall reduzierter und dispergierter Calcium-Hydroxylapatit

Schritte der Nano-Hydroxylapatit-Synthese:

40mL einer Lösung aus 0,32M Ca(NO₃)₂ · 4H₂O wurden in einem kleinen Becherglas vorbereitet. Der pH-Wert der Lösung wurde mit ca. 2,5ml NH ₄OH auf pH9,0 korrigiert. Die Lösung wurde mit dem Ultraschallstabgerät UP50H bei 100 % Amplitudeneinstellung für 1 Stunde beschallt.
Nachdem die einstündige Beschallung abgeschlossen war, wurde in der zweiten, ebenfalls einstündigen Beschallungsphase 60ml der 0,19M [KH₂PO₄]-Lösung tropfenweise der Ausgangslösung hinzugefügt. Während des Mischprozesses wurde der pH-Wert überprüft und konstant bei pH9 gehalten, während das Ca/P-Verhältnis bei 1,67 gehalten wurde. Die Lösung wurde anschließend zentrifugiert (~ 2000 g), wodurch ein weißer Niederschlag gewonnen wurde, der für eine Wärmebehandlung in mehrere Proben portioniert wurde.
Die Beschallung mit Hochleistungs-Ultraschall während des Synthese-Verfahrens vor der thermischen Behandlung zeigt deutliche Effekte auf die Entstehung der Vorläufer der ersten Nano-Hydroxylapatit-Partikel. Dies ist der Partikelgröße geschuldet, welche in Zusammenhang mit der Keimbildung und dem Wachstumsmuster des Materials steht, welche wiederum mit dem Übersättigungsgrad der Lösung zusammenhängt.
Darüber hinaus können die Korngröße und die Morphologie direkt während der Synthese beeinflusst werden. Die eingetragene Ultraschall-Leistung zwischen 0 bis 50W zeigte, dass es möglich war, die Korngröße vor der thermischen Behandlung zu verringern.
Der zunehmende Eintrag an Ultraschall-Leistung lässt darauf schließen, dass bei höherer Beschallungsintensität mehr Kavitationsblasen erzeugt wurden. Dies wiederum führte zu einer vermehrten Keimbildung, wodurch die Partikel, die sich an diesen Keimpunkten bilden, kleiner sind. Zudem ist zu beobachten, dass Partikel, die länger beschallt wurden, weniger agglomerieren. Nachfolgende FESEM-Daten bestätigen, dass die Partikel weniger agglomerieren, wenn während des Syntheseprozesses Ultraschall eingesetzt wird.
Pointern et al. (2011) gelang es mittels ultraschall-gestützter nasschemischer Fällungsreaktion Nano-HAp-Partikel im Nanometerbereich und mit sphärischer Morphologie herzustellen. Die Studie ergab, dass die kristalline Struktur und Morphologie des produzierten Nano-HAP-Pulvers abhängig von der Beschallungsintensität und der anschließend verwendeten Wärmebehandlung war. Es ist offensichtlich, dass Ultraschall die Synthese positiv beeinflusst, so dass ultrafeines Nano-HAp-Pulver ausgefällt wurde.

Kontinuierliche Ultraschallbehandlung mit einer Glasdurchflusszelle

Beschallung im Ultraschallreaktor

Hielscher Ultrasonics ist stolzer Sponsor der 7th International Electronic Conference on Medicinal Chemistry. Klicken Sie hier, um mehr über Präsentationen und Teilnahme zu erfahren!

Hydroxylapatit:

wichtigstes anorganisches Kalziumphosphat-Mineral
hohe Biokompatibilität
langsame Abbaubarkeit
Osteokonduktivität
nicht toxisch
nicht immunogen
mit Polymeren und/oder Glas kombinierbar
gute Absorptionsstruktur-Matrix für andere Moleküle
ausgezeichnetes Knochenersatzmaterial

Ultraschallhomogenisatoren sind leistungsstarke Werkzeuge zur Synthese und Funktionalisierung von Partikeln, wie z. B. HAp

Ultraschall-Stabschwinger UP50H

HAp-Synthese via sonochemisches Sol-Gel-Verfahren

Ultraschall-gestützter Sol-Gel-Weg für die Synthese von nanostrukturierten HAp-Partikeln:
Material:
– Edukte: Kalziumnitrat Ca(NO₃)₂, Di-Ammoniumhydrogenphosphat (NH₄)₂HPO₄Natriumhydroxyd NaOH;
– 25ml Reagenzglas

Lösen Sie Ca(NO₃)₂ und (NH₄)₂HPO₄ in destilliertem Wasser (molares Verhältnis Kalzium : Phosphor = 1,67)
Fügen Sie der Lösung etwas NaOH hinzu, um pH-Wert bei ca. pH 10 zu halten.
Beschallen Sie die Lösung mit dem Ultraschallstabschwinger UP100H (Sonotrode MS10, Amplitude 100 %)

Die hydrothermale Synthese wurde bei 150°C für 24h in einem Ofen durchgeführt.
Nach der Reaktion wurde das kristalline HAp mit einer Zentrifuge abgetrennt und mit entionisiertem Wasser gewaschen.
Das gewonnene HAp-Nanopulver wurde mittels Mikroskopie (SEM, TEM) und/oder Spektroskopie (FT-IR) analysiert. Die synthetisierten HAp-Nanopartikel zeigten eine hohe Kristallinität. Je nach Beschallungsintensität und -dauer konnte eine unterschiedliche Morphologie beobachtet werden. Eine längere Beschallungsdauer erzeugte einheitliche HAp-Nanorods mit einem hohen Aspektverhältnis und ultra-hoher Kristallinität. [vgl. Manafi et al. 2008]

Modifiziertes Hydroxylapatit

Durch seine Sprödigkeit ist die Anwendung reinen Hydroxylapatits nur beschränkt möglich. In der Materialforschung wurden zahlreiche Anstrengungen unternommen, um HAp mit Polymeren zu modifizieren, da natürliches Knochenmaterial vor allem aus nadelförmigen Nano-Hydroxylapatitkristallen zusammensetzt (ca. 65wt % des Knochens). Durch die ultraschall-gestützte Modifikation von Hydroxylapatit und die Synthese von Kompositen mit verbesserten Materialeigenschaften öffnen sich vielfältige neue Möglichkeiten (s. Beispiele unten).

Beispiele aus der Praxis:

Synthese von Nano-HAp

In der Studie von Poinern et al. (2009) wurde das Hielscher Ultraschallgerät UP50H erfolgreich für die Sono-Synthese von HAp benutzt. Mit zunehmendem Ultraschall-Energieeintrag verringerte sich die Partikelgröße der HAp-Kristalle. Es wurde nanostrukturiertes Hydroxylapatit (HAp) mittels ultraschall-gestützter nasschemischer Füllungsreaktion produziert. Ca(NO₃) und KH₂₅PO₄ dienten als Ausgangsstoffe und NH₃ wurde als Ausfällpräparat eingesetzt. Durch die hydrothermale Ausfällung mit Ultraschall konnten nano-skalige HAp-Partikel mit sphärischer Morphologie im Nanobereich von ca. 30nm ± 5 % hergestellt werden. Poinern und seine Kollegen haben gezeigt, dass die Ultraschall-gestützte Hydrothermalsynthese eine ökonomische Methode ist, die einfach zur kommerziellen Produktion hochskaliert werden kann.

Synthese von Gelantine-Hydroxylapatit (Gel-HAp)

Brundavanam und seine Kollegen haben mittels Ultraschall eine Gelantine-Hydroxylapatit (Gel-HAp) Zusammensetzung hergestellt. Für die Herstellung des Gelantine-Hydroxylapatits wurde 1g Gelatine bei 40°C vollständig in 1000 mL MilliQ Wasser aufgelöst. Daraufhin wurden 2mL der vorbereiteten Gelatine-Lösung zu der Ca2+/NH₃ -Mischung hinzugefügt. Die Mischung wurde mit einem UP50H Ultrasonicator (50W, 30kHz) beschallt. Während der Beschallung wurden 60ml 0,19M KH₂PO₄ tropfenweise hinzugefügt.
Die gesamte Lösung wurde 1 Stunde lang beschallt. Der pH-Wert wurde überprüft und stets auf pH 9 gehalten, und das Ca/P-Verhältnis wurde auf 1,67 eingestellt. Der weiße Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abfiltriert, wobei eine dicke Aufschlämmung entstand. Verschiedene Proben wurden in einem Rohrofen 2 Stunden lang bei Temperaturen von 100, 200, 300 und 400°C wärmebehandelt. Dadurch wurde ein Gel-HAp-Pulver in Granulatform erhalten, das zu einem feinen Pulver gemahlen und mittels XRD, FE-SEM und FT-IR charakterisiert wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass die milde Ultraschallbehandlung und das Vorhandensein von Gelatine während der Wachstumsphase des HAp eine geringere Adhäsion bewirken, was zu einer kleineren und gleichmäßigen Kugelform der Gel-HAp-Nanopartikel führt. Die milde Beschallung unterstützt die Synthese von Gel-HAp-Partikeln in Nanogröße aufgrund von Ultraschall-Homogenisierungseffekten. Die Amid- und Carbonylspezies aus der Gelatine lagern sich anschließend während der Wachstumsphase durch sonochemisch unterstützte Wechselwirkungen an die HAp-Nanopartikel an.
[Brundavanam et al. 2011]

Abscheiden von HAp auf Titanplättchen

Ozhukil Kollatha et al. (2013) haben Titanplättchen mit Hydroxylapatit beschichtet. Vor dem Abscheiden wurde die HAp-Suspension mit mit einem UP400S (400 Watt Ultraschallgerät mit Ultraschallhorn H14, Sonorisierungsdauer 40 Sek. bei 75 % Amplitude) beschallt.

Silber-beschichtetes HAp

Ignatev hat mit seiner Forschergruppe (2013) eine biosynthetische Methode entwickelt, bei der Silber-Nanopartikel (AgNp) auf HAp angelagert wurden, um den eine HAp-Partikeln durch die Silber-Beschichtung antibakterielle Eigenschaften zu verleihen und die zytotoxische Wirkung zu verringern. Für die Desagglomeration der Silber-Nanopartikel und für ihre Anlagerung auf den Hydroxylapatit wurde das Hielscher Ultraschallgerät UP400S verwendet.

Ignatev und seine Mitarbeiter verwendeten für die Herstellung von silberbeschichtetem HAp das Ultraschallsondengerät UP400S.

Ein Aufbau mit Magnetrührer und Ultraschallgerät UP400S für die Herstellung von silber-beschichteten HAp-Partikeln [Ignatev et al. 2013]

Unsere leistungsstarken Ultraschallgeräte sind zuverlässige Werkzeuge, um Partikel im submikron- und nanoskaligen Bereich zu verarbeiten. Egal ob Sie Partikel im Laborgefäß oder im kommerziellen Maßstab synthetisieren, dispergieren oder funktionalisieren wollen – Hielscher bietet Ihnen das passende Ultraschalgerät, das zu Ihren Anforderungen passt!

Ultraschallhomogenisator UP400S

Literatur

Brundavanam, R. K.; Jinag, Z.-T., Chapman, P.; Le, X.-T.; Mondinos, N.; Fawcett, D.; Poinern, G. E. J. (2011): Effect of dilute gelatine on the ultrasonic thermally assisted synthesis of nano hydroxyapatite. Ultrason. Sonochem. 18, 2011. 697-703.
Cengiz, B.; Gokce, Y.; Yildiz, N.; Aktas, Z.; Calimli, A. (2008): Synthese und Charakterisierung von Hydroyapatit-Nanopartikeln. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 322; 2008. 29-33.
Ignatev, M.; Rybak, T.; Colonges, G.; Scharff, W.; Marke, S. (2013): Plasma Sprayed Hydroxyapatite Coatings with Silver Nanoparticles. Acta Metallurgica Slovaca, 19/1; 2013. 20-29.
Jevtića, M.; Radulovićc, A.; Ignjatovića, N.; Mitrićb, M.; Uskoković, D. (2009): Controlled assembly of poly(d,l-lactide-co-glycolide)/ hydroxyapatite core–shell nanospheres under ultrasonic irradiation. Acta Biomaterialia 5/ 1; 2009. 208–218.
Kusrini, E.; Pudjiastuti, A. R.; Astutiningsih, S.; Harjanto, S. (2012): Preparation of Hydroxyapatite from Bovine Bone by Combination Methods of Ultrasonic and Spray Drying. Intl. Conf. on Chemical, Bio-Chemical and Environmental Sciences (ICBEE’2012) Singapore, December 14-15, 2012.
Manafi, S.; Badiee, S.H. (2008): Effect of Ultrasonic on Crystallinity of Nano-Hydroxyapatite via Wet Chemical Method. Ir J Pharma Sci 4/2; 2008. 163-168
Ozhukil Kollatha, V.; Chenc, Q.; Clossetb, R.; Luytena, J.; Trainab, K.; Mullensa, S.; Boccaccinic, A. R.; Clootsb, R. (2013): AC vs. DC Electrophoretic Deposition of Hydroxyapatite on Titanium. Journal of the European Ceramic Society 33; 2013. 2715–2721.
Poinern, G.E.J.; Brundavanam, R.K.; Thi Le, X.; Fawcett, D. (2012): The Mechanical Properties of a Porous Ceramic Derived from a 30 nm Sized Particle Based Powder of Hydroxyapatite for Potential Hard Tissue Engineering Applications. American Journal of Biomedical Engineering 2/6; 2012. 278-286.
Poinern, G.J.E.; Brundavanam, R.; Thi Le, X.; Djordjevic, S.; Prokic, M.; Fawcett, D. (2011): Thermische und Ultraschall-Einflüsse bei der Bildung von Hydroxylapatit-Bio-Keramik im Nanometerbereich. International Journal of Nanomedicine 6; 2011. 2083-2095.
Poinern, G.J.E.; Brundavanam, R.K.; Mondinos, N.; Jiang, Z.-T. (2009): Synthese und Charakterisierung von Nanohydroxyapatit mit einer ultraschallunterstützten Methode. Ultrasonics Sonochemistry, 16 /4; 2009. 469- 474.
Soypan, I.; Mel, M.; Ramesh, S.; Khalid, K.A: (2007): Porous hydroxyapatite for artificial bone applications. Science and Technology of Advanced Materials 8. 2007. 116.
Suslick, K. S. (1998): Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology; 4th Ed. J. Wiley & Sons: New York, Vol. 26, 1998. 517-541.