Sono-Synthese von Nano-Hydroxylapatit

Hydroxylapatit (HA oder HAp) ist aufgrund seiner dem Knochenmaterial ähnlichen Struktur eine häufig verwendete bioaktive Keramik für medizinische Zwecke. Die ultraschallunterstützte Synthese (Sono-Synthese) von Hydroxylapatit ist ein erfolgreiches Verfahren zur Herstellung von nanostrukturiertem HAp nach höchsten Qualitätsstandards. Das Ultraschallverfahren ermöglicht die Herstellung von nanokristallinem HAp sowie von modifizierten Partikeln, z.B. Kern-Schale-Nanosphären, und Verbundwerkstoffen.

Hydroxylapatit: Ein vielseitiges Mineral

Hydroxylapatit oder Hydroxyapatit (HAp, auch HA) ist eine natürlich vorkommende mineralische Form von Calciumapatit mit der Formel Ca₅(PO₄)₃(OH). Um anzugeben, dass die kristalline Elementarzelle zwei Formeleinheiten umfasst, wird die Formel üblicherweise als Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ geschrieben. Hydroxylapatit ist das Hydroxyl-Endglied der komplexen Apatitgruppe. Das OH- Ion kann durch Fluorid, Chlorid oder Carbonat ersetzt werden, wodurch Fluorapatit oder Chlorapatit entsteht. Es kristallisiert im hexagonalen Kristallsystem. HAp ist als Knochenmaterial bekannt, da bis zu 50 wt% des Knochens aus einer modifizierten Form von Hydroxylapatit bestehen.
In der Medizin ist nanostrukturierter poröser HAp ein interessantes Material für Anwendungen als künstlicher Knochen. Aufgrund seiner guten Biokompatibilität im Kontakt mit Knochen und seiner dem Knochenmaterial ähnlichen chemischen Zusammensetzung wird poröse HAp-Keramik in großem Umfang für biomedizinische Anwendungen eingesetzt, darunter die Regeneration von Knochengewebe, die Zellproliferation und die Wirkstoffabgabe.
„Im Tissue Engineering von Knochen wurde es als Füllmaterial für Knochendefekte und zur Augmentation, als künstliches Knochentransplantatmaterial sowie bei Revisionsoperationen von Prothesen eingesetzt. Seine große Oberfläche führt zu einer hervorragenden Osteokonduktivität und Resorbierbarkeit und ermöglicht ein schnelles Einwachsen von Knochen.“ [Soypan et al. 2007] Daher sind viele moderne Implantate mit Hydroxylapatit beschichtet.
Eine weitere vielversprechende Anwendung von mikrokristallinem Hydroxylapatit ist sein Einsatz als „knochenaufbauendes“ Nahrungsergänzungsmittel mit einer im Vergleich zu Calcium besseren Aufnahme.
Neben seiner Verwendung als Reparaturmaterial für Knochen und Zähne findet HAp weitere Anwendungen in der Katalyse, der Düngemittelproduktion, als Bestandteil pharmazeutischer Produkte, in der Proteinchromatographie und in Wasseraufbereitungsverfahren.

Leistungsultraschall: Effekte und Auswirkungen

Die Beschallung wird als ein Verfahren beschrieben, bei dem ein akustisches Feld verwendet wird, das in ein flüssiges Medium eingekoppelt wird. Die Ultraschallwellen breiten sich in der Flüssigkeit aus und erzeugen abwechselnde Hochdruck- und Niederdruckzyklen (Kompression und Verdünnung). Während der Verdünnungsphase entstehen kleine Vakuumblasen oder Hohlräume in der Flüssigkeit, die über mehrere Hochdruck- und Niederdruckzyklen wachsen, bis die Blase keine weitere Energie mehr aufnehmen kann. In diesem Stadium implodieren die Blasen während einer Kompressionsphase heftig. Bei einem solchen Blasenkollaps wird eine große Menge Energie in Form von Stoßwellen, hohen Temperaturen (ca. 5.000K) und Drücken (ca. 2.000atm) freigesetzt. Darüber hinaus sind diese „Hotspots“ durch sehr hohe Abkühlraten gekennzeichnet. Die Implosion der Blase erzeugt außerdem Flüssigkeitsstrahlen mit Geschwindigkeiten von bis zu 280m/s. Dieses Phänomen wird als Kavitation bezeichnet.
Wenn sich diese extremen Kräfte, die beim Kollaps der Kavitationsblasen entstehen, im beschallten Medium ausbreiten, wirken sie auf Partikel und Tröpfchen ein – dabei kommt es zu Kollisionen zwischen Partikeln, sodass die Feststoffe zerbrechen. Dadurch werden Partikelzerkleinerung durch Mahlen, Deagglomeration und Dispergierung erreicht. Die Partikel können bis in den Submikron- und Nanometerbereich zerkleinert werden.
Neben den mechanischen Effekten kann eine leistungsstarke Beschallung freie Radikale erzeugen, Moleküle durch Scherung spalten und Partikeloberflächen aktivieren. Diese Phänomene werden als Sonochemie bezeichnet.

Sono-Synthese

Eine Ultraschallbehandlung der Suspension führt zu sehr feinen, gleichmäßig verteilten Partikeln, sodass mehr Keimbildungsstellen für die Fällung entstehen.
Unter Ultraschall synthetisierte HAp-Partikel weisen einen geringeren Agglomerationsgrad auf. Die geringere Agglomerationsneigung von ultraschallsynthetisiertem HAp wurde z.B. durch die FESEM-Analyse (Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie) von Poinern et al. (2009) bestätigt.

Ultraschall unterstützt und fördert chemische Reaktionen durch Ultraschallkavitation und deren physikalische Effekte, die die Partikelmorphologie während der Wachstumsphase direkt beeinflussen. Die wichtigsten Vorteile der Ultraschallbehandlung, die zur Herstellung äußerst feiner Reaktionsgemische führt, sind

1) erhöhte Reaktionsgeschwindigkeit,
2) verkürzte Verarbeitungszeit
3) eine insgesamt effizientere Energienutzung.

Poinern et al. (2011) entwickelten ein nasschemisches Verfahren, bei dem Calciumnitrattetrahydrat (Ca[NO3]2 · 4H2O) und Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) als Hauptreaktanten verwendet werden. Zur Regulierung des pH-Werts während der Synthese wurde Ammoniumhydroxid (NH4OH) zugesetzt.
Als Ultraschallprozessor diente ein UP50H (50 W, 30 kHz, Sonotrode MS7 mit 7 mm Durchmesser) von Hielscher Ultrasonics.

Mit Ultraschall dispergierter Calciumhydroxylapatit

Mit Ultraschall zerkleinerter und dispergierter Calciumhydroxylapatit

Schritte der Nano-HAp-Synthese:

Eine 40 mL Lösung von 0,32M Ca(NO₃)₂ · 4H₂O wurde in einem kleinen Becherglas hergestellt. Der pH-Wert der Lösung wurde anschließend mit etwa 2,5mL NH₄OH auf 9,0 eingestellt. Die Lösung wurde mit dem UP50H bei einer Amplitudeneinstellung von 100% für 1 Stunde beschallt.
Nach Ablauf der ersten Stunde wurde eine 60 mL Lösung von 0,19M [KH₂PO₄] langsam tropfenweise zur ersten Lösung gegeben, während diese eine zweite Stunde lang mit Ultraschall behandelt wurde. Während des Mischvorgangs wurde der pH-Wert überprüft und bei 9 gehalten, während das Ca/P-Verhältnis bei 1,67 gehalten wurde. Die Lösung wurde anschließend durch Zentrifugation (~2000 g) filtriert. Danach wurde der entstandene weiße Niederschlag in mehrere Proben für die Wärmebehandlung aufgeteilt.
Der Einsatz von Ultraschall während der Synthese vor der thermischen Behandlung beeinflusst die Bildung der ursprünglichen Vorläufer der Nano-HAp-Partikel erheblich. Dies liegt daran, dass die Partikelgröße mit der Keimbildung und dem Wachstumsmuster des Materials zusammenhängt, die wiederum mit dem Grad der Übersättigung in der flüssigen Phase verbunden sind.
Darüber hinaus können sowohl die Partikelgröße als auch die Morphologie während dieses Syntheseprozesses direkt beeinflusst werden. Die Erhöhung der Ultraschallleistung von 0 auf 50W zeigte, dass sich die Partikelgröße vor der thermischen Behandlung verringern ließ.
Mit zunehmender Ultraschallleistung bei der Beschallung der Flüssigkeit wurde eine größere Anzahl von Blasen beziehungsweise Kavitationsereignissen erzeugt. Dadurch entstanden mehr Keimbildungsstellen, und die an diesen Stellen gebildeten Partikel waren folglich kleiner. Außerdem zeigen Partikel, die über längere Zeiträume mit Ultraschall behandelt werden, weniger Agglomeration. Nachfolgende FESEM-Daten bestätigten die verringerte Partikelagglomeration beim Einsatz von Ultraschall während der Synthese.
Nano-HAp-Partikel im Nanometerbereich mit kugelförmiger Morphologie wurden durch ein nasschemisches Fällungsverfahren unter Ultraschalleinwirkung hergestellt. Es wurde festgestellt, dass die Kristallstruktur und Morphologie der entstandenen Nano-HAp-Pulver von der Leistung der Ultraschallquelle und der anschließenden thermischen Behandlung abhingen. Es zeigte sich, dass der Einsatz von Ultraschall im Syntheseprozess die chemischen Reaktionen und physikalischen Effekte förderte, die nach der thermischen Behandlung zur Entstehung der ultrafeinen Nano-HAp-Pulver führten.

Kontinuierliche Ultraschallbehandlung mit einer Glasdurchflusszelle

Beschallung in einer Ultraschallreaktorkammer

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Hydroxylapatit:

wichtigstes anorganisches Calciumphosphatmineral
hohe Biokompatibilität
langsame biologische Abbaubarkeit
osteokonduktiv
nicht toxisch
nicht immunogen
kann mit Polymeren und/oder Glas kombiniert werden
gute strukturelle Matrix zur Absorption anderer Moleküle
hervorragender Knochenersatz

Ultraschallhomogenisatoren sind leistungsstarke Werkzeuge zur Synthese und Funktionalisierung von Partikeln wie HAp

Ultraschallgerät mit Sonotrode UP50H

HAp-Synthese über ein ultraschallunterstütztes Sol-Gel-Verfahren

Ultraschallunterstütztes Sol-Gel-Verfahren zur Synthese nanostrukturierter HAp-Partikel:
Material:
– Reaktanten: Calciumnitrat Ca(NO₃)₂, Diammoniumhydrogenphosphat (NH₄)₂HPO₄, Natriumhydroxid NaOH;
– Reagenzglas mit 25 ml

Lösen Sie Ca(NO₃)₂ und (NH₄)₂HPO₄ in destilliertem Wasser (Molverhältnis von Calcium zu Phosphor: 1,67)
Geben Sie etwas NaOH zur Lösung, um ihren pH-Wert bei etwa 10 zu halten.
Ultraschallbehandlung mit einem UP100H (Sonotrode MS10, Amplitude 100%)

Die hydrothermalen Synthesen wurden bei 150°C für 24 h in einem elektrischen Ofen durchgeführt.
Nach der Reaktion kann kristalliner HAp durch Zentrifugation und Waschen mit deionisiertem Wasser gewonnen werden.
Analyse des erhaltenen HAp-Nanopulvers mittels Mikroskopie (SEM, TEM) und/oder Spektroskopie (FT-IR). Die synthetisierten HAp-Nanopartikel weisen eine hohe Kristallinität auf. Je nach Beschallungsdauer lassen sich unterschiedliche Morphologien beobachten. Eine längere Beschallung kann zu gleichmäßigen HAp-Nanostäbchen mit einem hohen Aspektverhältnis und einer äußerst hohen Kristallinität führen. [vgl. Manafi et al. 2008]

Modifikation von HAp

Aufgrund seiner Sprödigkeit ist die Anwendung von reinem HAp begrenzt. In der Materialforschung wurden zahlreiche Anstrengungen unternommen, HAp mit Polymeren zu modifizieren, da natürlicher Knochen ein Verbundwerkstoff ist, der hauptsächlich aus nanoskaligen, nadelförmigen HAp-Kristallen besteht (sie machen etwa 65wt% des Knochens aus). Die ultraschallunterstützte Modifikation von HAp und die Synthese von Verbundwerkstoffen mit verbesserten Materialeigenschaften bieten vielfältige Möglichkeiten (siehe einige Beispiele unten).

Praxisbeispiele:

Synthese von Nano-HAp

In der Studie von Poinern et al. (2009) wurde ein Hielscher UP50H Ultraschallgerät mit Sonotrode erfolgreich für die Sono-Synthese von HAp eingesetzt. Mit zunehmender Ultraschallenergie nahm die Partikelgröße der HAp-Kristallite ab. Nanostrukturierter Hydroxylapatit (HAp) wurde durch ein ultraschallunterstütztes Nassfällungsverfahren hergestellt. Ca(NO₃) und KH₂₅PO₄ wurden als Hauptausgangsstoffe und NH₃ als Fällungsmittel verwendet. Die hydrothermale Fällung unter Ultraschallbestrahlung führte zu nanoskaligen HAp-Partikeln mit kugelförmiger Morphologie im Nanometerbereich (ca. 30nm ± 5%). Poinern und seine Mitarbeiter bewerteten die sono-hydrothermale Synthese als wirtschaftliches Verfahren mit guten Möglichkeiten zur Maßstabsvergrößerung für die kommerzielle Produktion.

Synthese von Gelatine-Hydroxylapatit (Gel-HAp)

Brundavanam und seine Mitarbeiter stellten erfolgreich einen Gelatine-Hydroxylapatit-Verbundwerkstoff (Gel-HAp) unter milden Beschallungsbedingungen her. Zur Herstellung von Gelatine-Hydroxylapatit wurde 1g Gelatine vollständig in 1000mL MilliQ-Wasser bei 40°C gelöst. Anschließend wurden 2mL der vorbereiteten Gelatinelösung zur Ca2+/NH₃-Mischung gegeben. Die Mischung wurde mit einem UP50H Ultraschallgerät (50W, 30kHz) beschallt. Während der Beschallung wurden 60mL einer 0,19M Lösung von KH₂PO₄ tropfenweise zur Mischung gegeben.
Die gesamte Lösung wurde für 1h beschallt. Der pH-Wert wurde überprüft und durchgehend bei pH 9 gehalten, und das Ca/P-Verhältnis wurde auf 1,67 eingestellt. Die Filtration des weißen Niederschlags erfolgte durch Zentrifugation, wodurch eine dickflüssige Suspension entstand. Verschiedene Proben wurden in einem Rohrofen für 2h bei Temperaturen von 100, 200, 300 und 400°C wärmebehandelt. Dabei entstand ein Gel–HAp-Pulver in körniger Form, das zu einem feinen Pulver gemahlen und mittels XRD, FE-SEM und FT-IR charakterisiert wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass eine milde Ultraschallbehandlung und die Anwesenheit von Gelatine während der Wachstumsphase des HAp die Adhäsion verringern – dadurch entstehen kleinere Gel–HAp-Nanopartikel mit einer regelmäßigen Kugelform. Die milde Beschallung unterstützt die Synthese nanoskaliger Gel–HAp-Partikel durch die Homogenisierungseffekte des Ultraschalls. Die Amid- und Carbonylgruppen der Gelatine lagern sich anschließend während der Wachstumsphase durch sonochemisch unterstützte Wechselwirkungen an die HAp-Nanopartikel an.
[Brundavanam et al. 2011]

Abscheidung von HAp auf Titanplättchen

Ozhukil Kollatha et al. (2013) beschichteten Ti-Plättchen mit Hydroxylapatit. Vor der Abscheidung wurde die HAp-Suspension mit einem UP400S (400 Watt Ultraschallgerät mit Sonotrode H14, Beschallungsdauer 40 Sek. bei 75% Amplitude) homogenisiert.

Silberbeschichtetes HAp

Ignatev und seine Mitarbeiter (2013) entwickelten ein biosynthetisches Verfahren, bei dem Silbernanopartikel (AgNp) auf HAp abgeschieden wurden, um eine HAp-Beschichtung mit antibakteriellen Eigenschaften zu erhalten und die zytotoxische Wirkung zu verringern. Zur Deagglomeration der Silbernanopartikel und zu ihrer Sedimentation auf dem Hydroxylapatit wurde ein Hielscher UP400S eingesetzt.

Ignatev und seine Mitarbeiter verwendeten das Ultraschallgerät mit Sonotrode UP400S zur Herstellung von silberbeschichtetem HAp.

Ein Aufbau aus Magnetrührer und Ultraschallgerät UP400S wurde zur Herstellung von silberbeschichtetem HAp verwendet [Ignatev et al 2013]

Unsere leistungsstarken Ultraschallgeräte sind zuverlässige Werkzeuge zur Behandlung von Partikeln im Submikron- und Nanometerbereich. Ob Sie Partikel in kleinen Röhrchen für Forschungszwecke synthetisieren, dispergieren oder funktionalisieren möchten oder große Volumina von Nanopulversuspensionen für die kommerzielle Produktion behandeln müssen – Hielscher bietet das passende Ultraschallgerät für Ihre Anforderungen!

Ultraschallhomogenisator UP400S

Literatur/Quellen

Brundavanam, R. K.; Jinag, Z.-T., Chapman, P.; Le, X.-T.; Mondinos, N.; Fawcett, D.; Poinern, G. E. J. (2011): Effect of dilute gelatine on the ultrasonic thermally assisted synthesis of nano hydroxyapatite. Ultrason. Sonochem. 18, 2011. 697–703.
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Ignatev, M.; Rybak, T.; Colonges, G.; Scharff, W.; Marke, S. (2013): Plasma Sprayed Hydroxyapatite Coatings with Silver Nanoparticles. Acta Metallurgica Slovaca, 19/1; 2013. 20–29.
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Poinern, G.E.J.; Brundavanam, R.K.; Thi Le, X.; Fawcett, D. (2012): The Mechanical Properties of a Porous Ceramic Derived from a 30 nm Sized Particle Based Powder of Hydroxyapatite for Potential Hard Tissue Engineering Applications. American Journal of Biomedical Engineering 2/6; 2012. 278–286.
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