Nano-verkapselter intranasaler Impfstoff gegen S. pneumoniae mit Ultraschall

Arzneimittelträger auf Nanopartikelbasis sind eine sich entwickelnde Technologie, die die Formulierung von Impfstoffverabreichungssystemen mit einer hohen Schutzrate gegen verschiedene Krankheiten ermöglicht. Die Emulgierung und Verkapselung mit Ultraschall ist eine hocheffiziente Methode zur Herstellung von beladenen nanostrukturierten Arzneimittelträgern wie Nanopartikeln, Nanopartikeln mit festen Lipiden, polymeren Arzneimittelträgern und Liposomen.

Vorteile der nano-verkapselten S. pneumoniae-Impfstoffe

The ultrasonicator UP200St in a stirred vessel for emulsification of reactantsMott et al. (2013) ermittelten die Wirksamkeit der intranasalen Verabreichung eines 234 ± 87,5 nm Polymilchsäure-Co-Glykolsäure-Nanopartikel-Impfstoffkonstrukts zur Erlangung eines Schutzes gegen experimentelle Pneumokokken-Infektionen der Atemwege. Nanopartikel, in denen hitze-abgetötete Streptococcus pneumoniae (NP-HKSP) verkapselt waren, wurden 11 Tage nach nasaler Verabreichung im Vergleich zu leeren NP in der Lunge nachgewiesen. Die Immunisierung mit NP-HKSP erzeugte eine signifikante Resistenz gegen S. pneumoniae Infektionen im Vergleich zur alleinigen Verabreichung von HKSP. Ein erhöhter Schutz korrelierte mit einem signifikanten Anstieg der antigenspezifischen Th1-assoziierten IFN-c-Zytokin-Antwort der pulmonalen Lymphozyten. Diese Studie belegt die Wirksamkeit der NP-basierten Technologie als nicht-invasiven und gezielten Ansatz für die nasal-pulmonale Immunisierung gegen Lungeninfektionen.

Protokoll für die ultraschall-gestützte Nanopartikel-Herstellung

Ultraschall-Lyse

1×106 Nanopartikel, in denen hitze-abgetötete Streptococcus pneumoniae (NP-HKSP) eingekapselt wurden, wurden durch Beschallung in 200 µl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) lysiert. 70 mg Polymilchsäure-Co-Glycolsäure (PLGA) wurden in 1 ml Ethylacetat gelöst. Diese beiden Lösungen wurden vermischt und mit einem Vortexer bei maximaler Geschwindigkeit 1 Minute lang verwirbelt, um eine primäre Wasser-in-Öl-Emulsion zu erzeugen.

Ultraschall-Verkapselung

Doppelemulsions-Verfahren: Die Primäremulsion wurde mit 3 ml einer 1%igen Polyvinylalkohol (PVA)-Lösung gemischt. Diese Lösung wurde mit Hilfe des Ultraschallprozessors UP200H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Deutschland) bei 40 % Amplitude für 2 Minuten im kontinuierlichen Modus (100 %-Zyklus) in einem sauberen Glasfläschchen beschallt. Das Glasfläschchen wurde das zur Wärmeableitung in Eis getaucht. Mittels Ultraschall wurden die HKSP vorzubereiten, um in PLGA-Nanopartikel verkapselt zu werden. Die Lösung wurde weiter mit autoklaviertem Wasser (0,22µ Filter sterilisiert) auf 20ml verdünnt und für 1h bei Raumtemperatur unter mildem Vakuum gerührt, um das Ethylacetat zu verdampfen. Die Lösung wurde dann zentrifugiert, um die NPs zu sammeln. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt, um überschüssiges PVA zu entfernen. Das Nanopartikel-Pellet wurde in 500 µl autoklaviertem Wasser resuspendiert und gefriergetrocknet. Die endgültigen Nanopartikel wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.

Messung der Partikelgröße von mit Ultraschall präparierten hitzegetöteten, mit Streptokokkus pneumoniae beladenen Nanopartikeln.

Partikelgröße der PLGA-Nanopartikel, in denen die durch Hitze abgetöteten Streptococcus pneumoniaeViren eingekapselt wurden. Die durch dynamische Lichtstreuung (DLS) gemessene Partikelgröße einer wässrigen Suspension von Nanopartikeln zeigt die durchschnittliche Größe und die Gaußsche Verteilung der Partikel.
Quelle: Mott et al (2013): Intranasal delivery of nanoparticle-based vaccine increases protection against S. pneumoniae. J Nanopart Res (2013) 15:1646.

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Ultraschallprozessoren für pharmazeutische Formulierungen

Hielscher Ultrasonics verfügt über langjährige Erfahrung in der Entwicklung, Herstellung, dem Vertrieb und Service von Hochleistungs-Ultraschall-Homogenisatoren für die Pharma- und Lebensmittelindustrie.
Die Herstellung von hochwertigen Liposomen, Solid-Lipid-Nanopartikeln, polymeren Nanopartikeln und Cyclodextrin-Komplexen sind Verfahren, die mit Hielscher-Ultraschallsystemen mit hoher Zuverlässigkeit und überlegener Qualität durchgeführt werden. Hielscher-Ultraschallgeräte ermöglichen eine präzise Kontrolle über alle Prozessparameter wie Amplitude, Temperatur, Druck und Beschallungsenergie. Die intelligente Software protokolliert automatisch alle Beschallungsparameter (Zeit, Datum, Amplitude, Nettoenergie, Gesamtenergie, Temperatur, Druck) auf einer integrierten SD-Karte.

Vorteile der ultraschall-gestützten PLGA-Nanopartikel-Produktion

  • Hochleistungs-Emulgierung
  • Exakte Kontrolle über Partikelgröße und -ladung
  • Hohe Wirkstoffladung
  • Exakte Kontrolle über Prozessparameter
  • Schneller Prozess
  • Nicht-thermisch / präzise Temperaturregelung
  • Lineare Skalierbarkeit
  • Reproduzierbarkeit
  • Prozess-Standardisierung / GMP
  • Autoklavierbare Sonotrode und Reaktoren
  • CIP / SIP

In der folgenden Tabelle finden Sie die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallsysteme:

Batch-Volumen Durchfluss Empfohlenes Ultraschallgerät
1 bis 500ml 10 bis 200ml/min UP100H
10 bis 2000ml 20 bis 400ml/min UP200Ht, UP400St
0.1 bis 20l 0,2 bis 4l/min UIP2000hdT
10 bis 100l 2 bis 10l/min UIP4000hdT
n.a. 10 bis 100l/min UIP16000
n.a. größere Cluster aus UIP16000

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Wissenswertes

Nanostrukturierte Arzneistoffträger

Nano-skalige Wirkstoffträger wie Nano-Emulsionen, Liposomen, Solid-Lipid-Nanopartikel, polymere Nanopartikel und nanostrukturierte Lipid Carrier werden zur Formulierung von Arzneimitteln mit verbesserten Funktionalitäten eingesetzt. Zu diesen verbesserten Funktionalitäten zählen höhere Bioverfügbarkeit, erhöhte Biokompatibilität, gezielte Wirkstoffabgabe, günstige Blut-Halbwertszeiten und eine sehr geringe bzw. keine Toxizität für gesundes Gewebe. Die Ultraschallverarbeitung ist eine sehr effiziente Technik zur Formulierung verschiedener Formen von Nanotherapeutika. Lesen Sie mehr über Ultraschallanwendungen in der pharmazeutischen Produktion!

Liposomen

Ein Liposom ist ein kugelförmiges Vesikel mit mindestens einer Lipid-Doppelschicht, die einen Kern aus hydrophoben Substanzen verkapselt. Sowohl die Größe als auch der hydrophobe und hydrophile Charakter machen Liposome zu potenten Wirkstoffabgabesystemen, z.B. von liposomalem Vitamin C. Die Eigenschaften der Liposome werden wesentlich durch die Lipidzusammensetzung, die Oberflächenladung, die Größe und die Präparationstechnik beeinflusst. Klicken Sie hier, um mehr über die Ultraschallherstellung von Liposomen zu erfahren!

Nano-Emulsionen

Nanoemulsionen oder Submikron-Emulsionen sind Emulsionen mit einer Tröpfchengröße zwischen 20-200nm und einer engen Tröpfchenverteilung. Die nanogroßen Tröpfchen bieten mehrere Vorteile sowohl für die orale Verabreichung als auch für die topische / transdermale Verabreichung von pharmazeutischen und bioaktiven Substanzen, z.B. CBD-Nanoemulsionen. Die nanogroßen Tröpfchen mit der Fähigkeit, lipophile Wirkstoffe effizient aufzulösen, sowie die erhöhte Absorptionsrate machen Nanoemulsionen zu einer häufig verwendeten Darreichungsform für eine hohe Bioverfügbarkeit. Nano-emulgierte Formulierungen können auch für eine verzögerte Freisetzung (Retardfunktion) von lipophilen oder hydrophilen Medikamenten eingesetzt werden.
Lesen Sie mehr über die Ultraschall-Herstellung von Nano-Emulsionen!

Solid-Lipid-Nanopartikel

Ein Solid-Lipid-Nanopartikel (SLN) ist ein kugelförmiger Nanopartikel mit einem mittleren Durchmesser zwischen 10 und 1000 Nanometern. Solid-Lipid-Nanopartikel haben eine feste Lipid-Kernmatrix, in der lipophile Moleküle (Wirkstoffe) gelöst werden können, so dass der Nanopartikel als Wirkstoffträger fungiert. Der Lipidkern wird durch einen Emulgator oder ein Tensid stabilisiert. Bei Anwendungen zur parenteralen und oralen Verabreichung sowie zur okularen, pulmonalen und topischen Wirkstoffverabreichung werden Solid-Lipid-Nanopartikel eingesetzt, um die Wirksamkeit der Behandlung zu erhöhen und systemische Nebenwirkungen zu reduzieren.
Lesen Sie mehr über die ultraschall-gestützte Synthese von Solid-Lipid-Nanopartikeln!

Nanostrukturierte Lipid-Carrier

Ebenso wie Solid-Lipid-Nanopartikel (SLN) sind nanostrukturierte Lipid Carriers (NLC) eine weitere Form von lipidbasierten Nanopartikeln. Nanostrukturierte Lipidcarrier (NLC) sind modifizierte feste Lipidnanopartikel, die aus einer Mischung aus festen und flüssigen Lipiden bestehen und eine verbesserte Stabilität und Belastbarkeit bieten.
Nanostrukturierte Lipidträger können mittels Ultraschall-Emulsionsmethode hergestellt werden.

Nano-Kristalle

Die Ultraschall-Kristallisation und -Ausfällung ist eine hochwirksame Methode, um Substanzen mit schlechter Wasserlöslichkeit in eine beschichtete Kristallstruktur zu verkapseln. Zheng et al. (2020) berichten über die Ultraschallverkapselung von Curcumin, einer bioaktiven Verbindung mit vielen positiven Effekten auf die Gesundheit, aber schlechter Bioverfügbarkeit aufgrund seiner geringen Wasserlöslichkeit. Das Forschungsteam entwickelte eine schichtweise (layer-by-layer = LbL) Nanoschalenbildung aus Polyelektrolyt, um die Curcumin-Moleküle einzukapseln. Sie stellen fest, dass "unsere ultraschall-gestützte LbL-Verkapselung im Gegensatz zu den üblicherweise verwendeten Emulsionsmethoden Nanopartikel von viel geringerer Größe erreichen kann. Für Curcumin erhielten wir kristalline Nanopartikel mit einer durchschnittlichen Größe von 80 nm und einem ξ-Potenzial von +30 mV oder -50 mV, was die Stabilität dieser Nanokolloide über Monate (in gesättigter Arzneimittellösung) sicherstellte. Die Bildung von Schalen mit zwei Doppelschichten aus biokompatiblen Polyelektrolyten ermöglichte eine langsame Wirkstofffreisetzung über ca. 20 Stunden".
Das Curcumin-Nukleationsprotokoll: Das Curcumin-Pulver wurde in einer 60%igen Ethanol/Wasser-Lösung aufgelöst. Nach vollständiger Auflösung des Curcumins wurden wässrige Polykationen, Poly(allylaminhydrochlorid), PAK oder biologisch abbaubares Protaminsulfat (PS) hinzugefügt. Dann wurde die Lösung mit einem UIP1000, einem 1kW starken Ultraschallgerät von Hielscher Ultrasonics, bei 100Watt pro mL Lösung beschallt. Während der Ultraschallbehandlung wurde der Lösung langsam Wasser hinzugefügt. Durch das hinzugefügte Wasser wird das Lösungsmittel polarer, was die Löslichkeit von Curcumin verringert. Wenn die Gleichgewichtskonzentration die Löslichkeitsschwelle überschreitet, wird eine Übersättigung des Curcumins erreicht und die Kristallkeimbildung beginnt. Unter Hochleistungs-Ultraschall wird das Wachstum der Wirkstoffpartikel in den Anfangsstadien gestoppt.
Lesen Sie mehr über die ultraschall-gestützte Fällung und Kristallisation von Nanokristallen!