Quá trình hòa tan bằng sóng siêu âm các cục protein
Trong lĩnh vực proteomics, việc chuẩn bị mẫu không bao giờ là một chi tiết nhỏ. Đây chính là nền tảng quyết định độ chính xác trong việc xác định, độ tin cậy trong định lượng và khả năng tái hiện. Một trong những thách thức dai dẳng nhất trong việc chuẩn bị mẫu protein là việc hòa tan lại hiệu quả các cặn protein sau các bước kết tủa hoặc cô đặc. Đây chính là nơi mà việc hòa tan cặn protein bằng sóng siêu âm ngày càng trở nên quan trọng. Bằng cách áp dụng quá trình siêu âm có kiểm soát, các phòng thí nghiệm có thể nâng cao hiệu suất thu hồi protein, đẩy nhanh quá trình hòa tan cặn và chuẩn bị mẫu hiệu quả hơn cho các bước phân tích phổ khối và sinh hóa tiếp theo.
Hòa tan protein: Tại sao siêu âm lại quan trọng trong lĩnh vực proteomics hiện đại
Các cặn protein thường hình thành trong quá trình kết tủa bằng acetone, ethanol, methanol-chloroform, amoni sunfat hoặc TCA. Các quy trình này được sử dụng rộng rãi để loại bỏ tạp chất, cô đặc protein và tinh chế dịch chiết trước khi phân tích. Tuy nhiên, sau khi quá trình kết tủa hoàn tất, cặn thu được có thể khó hòa tan trở lại. Các tập hợp dày đặc, vùng kỵ nước, protein liên kết với màng và các phức hợp protein tương tác mạnh thường không thể hòa tan bằng cách trộn hoặc khuấy thông thường. Việc hòa tan không hoàn toàn có thể dẫn đến mất mẫu, đại diện protein không chính xác và độ lặp lại kém giữa các thí nghiệm.
Phương pháp siêu âm giải quyết chính xác điểm nghẽn này. Thông qua việc tạo ra năng lượng cơ học trong môi trường lỏng, siêu âm phá vỡ cấu trúc viên nén đặc, thúc đẩy sự thâm nhập của dung dịch đệm và phân tán vật liệu kết tụ vào dung dịch. Kết quả là quá trình tái tạo protein diễn ra nhanh hơn và thường hoàn chỉnh hơn, điều này đặc biệt có giá trị khi làm việc với các mẫu có lượng hạn chế, dịch chiết phức tạp hoặc các mục tiêu proteomic khó phân tích.
Máy siêu âm tấm siêu âm UIP400MTP để chiết xuất protein và hòa tan cặn
Tại sao viên protein lại khó hòa tan
Quá trình kết tủa protein có hiệu quả vì nó buộc protein phải tách ra khỏi dung dịch. Tuy nhiên, chính quá trình khiến cho việc kết tủa trở nên hữu ích cũng gây ra vấn đề trong việc thu hồi cặn. Sau khi kết tủa, protein có thể bị nén chặt và bị biến tính một phần. Các tương tác kỵ nước có thể gia tăng, liên kết giữa các phân tử có thể tăng lên, và một số protein có thể giữ lại muối, lipid, axit nucleic hoặc các thành phần ma trận khác. Ngay cả khi sử dụng dung dịch đệm hòa tan mạnh, quá trình tái phân tán thụ động thường diễn ra chậm và không hoàn toàn.
Trong lĩnh vực proteomics, điều này rất quan trọng bởi vì việc hòa tan cặn không hoàn toàn không chỉ làm giảm tổng sản lượng. Nó còn có thể loại trừ một cách có chọn lọc một số loại protein nhất định, đặc biệt là protein màng, protein cấu trúc hoặc các loại protein dễ kết tụ. Điều đó có nghĩa là kết quả phân tích cuối cùng có thể không còn phản ánh đúng thành phần thực sự của mẫu ban đầu. Trong proteomics độ phân giải cao, nơi mà những khác biệt nhỏ về nồng độ hoặc biến đổi sau dịch mã có thể mang tính quyết định về mặt sinh học, sự sai lệch trong quá trình chuẩn bị như vậy là một hạn chế nghiêm trọng.
Cách siêu âm giúp cải thiện quá trình hòa tan cặn protein
Xử lý bằng sóng siêu âm giúp cải thiện quá trình hòa tan bằng cách đưa năng lượng cơ học tần số cao vào mẫu. Năng lượng này giúp phá vỡ các khối kết tụ chặt chẽ và tăng cường sự tiếp xúc giữa dung dịch đệm hòa tan và các protein bị bao bọc bên trong. Thay vì chỉ dựa vào quá trình khuếch tán và trộn thủ công, quy trình này chủ động phân tán khối kết tụ thành các phần nhỏ hơn, dễ hòa tan hơn.
Hiệu quả thực tế là rất đáng kể. Quá trình siêu âm có thể:
- tăng tốc độ hòa tan các cục protein đặc hoặc khó tan
- nâng cao hiệu quả thu hồi các protein khó hòa tan và bị kết tụ
- giảm thời gian chuẩn bị trong các quy trình phân tích proteomics
- hỗ trợ các mẫu đồng nhất hơn cho quá trình phân giải và phân tích
Khả năng phân tán được cải thiện này đặc biệt hữu ích khi cặn lắng được tái hòa tan trong các dung dịch đệm chứa urê, thiourê, chất tẩy rửa, chất làm rối loạn cấu trúc protein hoặc các chất phản ứng khác thường được sử dụng trong lĩnh vực proteomics. Quá trình siêu âm giúp các thành phần này tiếp cận và hòa tan cặn lắng hiệu quả hơn, từ đó tạo ra dung dịch mẫu đồng nhất hơn.
Ưu điểm của phương pháp hòa tan bằng sóng siêu âm trong lĩnh vực proteomics
Ưu điểm chính của phương pháp hòa tan bằng sóng siêu âm là biến một bước chuẩn bị thường bị đánh giá thấp thành một quy trình có thể kiểm soát và hiệu quả. Trong lĩnh vực proteomics, điều này mang lại những tác động trực tiếp đến phân tích.
- Thứ nhất, việc cải thiện quá trình hòa tan giúp tăng khả năng mẫu đưa vào quá trình phân giải enzym sẽ phản ánh đầy đủ toàn bộ quần thể protein. Ví dụ, quá trình phân giải bằng trypsin phụ thuộc vào việc các protein được mở cấu trúc đầy đủ và có thể tiếp cận được trong dung dịch. Nếu một phần của cặn vẫn chưa hòa tan, những protein đó thực tế sẽ bị loại trừ khỏi quá trình tạo peptide và do đó không thể được phát hiện.
- Thứ hai, phương pháp siêu âm có thể nâng cao độ lặp lại. Việc tái hòa tan cặn bằng tay vốn dĩ có độ biến động cao, đặc biệt khi có sự tham gia của các kỹ thuật viên khác nhau, kích thước cặn khác nhau hoặc các ma trận mẫu khác nhau. Việc xử lý bằng siêu âm có kiểm soát giúp chuẩn hóa lượng năng lượng vật lý tác động lên mẫu, từ đó có thể giảm thiểu sự biến động giữa các lần chuẩn bị và nâng cao tính nhất quán trong các quy trình LC-MS hoặc quy trình dựa trên gel ở các bước tiếp theo.
- Thứ ba, công nghệ siêu âm mang lại giá trị cao đối với các mẫu có lượng đầu vào ít và các mẫu quý hiếm. Các lĩnh vực như proteomics lâm sàng, phát hiện dấu ấn sinh học, thí nghiệm nuôi cấy tế bào và nghiên cứu mô thường phải dựa vào nguồn vật liệu hạn chế. Bất kỳ sự mất mát protein nào trong quá trình hòa tan đều làm giảm giá trị thông tin của mẫu. Quá trình tái hòa tan bằng siêu âm hiệu quả giúp bảo toàn được lượng chất phân tích nhiều nhất có thể.
- Cuối cùng, phương pháp siêu âm giúp tăng tốc độ quy trình làm việc. Các phòng thí nghiệm proteomics xử lý nhiều mẫu cần có các phương pháp chuẩn bị mẫu đáng tin cậy và tiết kiệm thời gian. Một cặn lắng tan nhanh và hoàn toàn không chỉ mang lại sự tiện lợi mà còn giúp giảm thiểu sự chậm trễ, hạn chế rủi ro do sai sót trong quá trình xử lý và nâng cao năng suất.
Phương pháp siêu âm so với các phương pháp tái huyền phù truyền thống
Các phương pháp tái phân tán cặn truyền thống thường bao gồm các bước như hút bằng ống tiêm, khuấy, lắc vortex, ủ trong thời gian dài hoặc gia nhiệt lặp đi lặp lại. Mặc dù các kỹ thuật này có thể hiệu quả đối với cặn có cấu trúc lỏng lẻo, chúng thường gặp khó khăn khi xử lý vật liệu protein có độ nén cao hoặc tính kỵ nước. Chỉ riêng việc trộn cơ học có thể không đủ để phá vỡ hoàn toàn cấu trúc cặn, dẫn đến việc còn lại các hạt rắn có thể nhìn thấy hoặc các phần không tan không thể quan sát được.
Phương pháp siêu âm mang lại một cách tiếp cận chủ động và có mục tiêu hơn. Thay vì phụ thuộc vào quá trình khuếch tán chậm của dung dịch đệm, phương pháp này phá vỡ vật liệu lắng đọng một cách vật lý và thúc đẩy quá trình đồng nhất hóa nhanh chóng. Điều này không loại bỏ nhu cầu sử dụng dung dịch đệm tái huyền phù phù hợp, nhưng nó giúp nâng cao đáng kể hiệu quả của dung dịch đệm đó.
So với các phương pháp hoàn toàn thủ công, quá trình hòa tan bằng sóng siêu âm thường mang lại khả năng kiểm soát quy trình tốt hơn, hiệu quả cao hơn và phù hợp hơn với các ứng dụng proteomics đòi hỏi khắt khe. Đối với các phòng thí nghiệm mong muốn đạt được cả chất lượng phân tích lẫn độ tin cậy trong vận hành, điều này khiến việc sử dụng sóng siêu âm trở thành một lựa chọn hấp dẫn.
Các ứng dụng hiệu quả nhất của phương pháp hòa tan cặn protein bằng sóng siêu âm
Quá trình hòa tan bằng sóng siêu âm đặc biệt hữu ích trong các quy trình làm việc liên quan đến:
- quá trình kết tủa protein trước khi phân tích khối phổ,
- phục hồi các hạt từ dịch tế bào hoặc chiết xuất mô,
- phân lập các protein có cấu trúc màng dày đặc hoặc dễ tạo thành các cụm,
- và chuẩn bị mẫu cho phân tích proteomics định lượng, nơi tính lặp lại là yếu tố thiết yếu.
Điều này cũng đặc biệt quan trọng khi các viên nén đã được bảo quản, sấy khô quá kỹ hoặc được sản xuất từ các ma trận sinh học phức tạp. Trong những trường hợp như vậy, phương pháp tái huyền phù thụ động có thể trở nên kém hiệu quả, trong khi siêu âm giúp khôi phục khả năng sử dụng của mẫu với ít thao tác thủ công hơn.
VialTweeter sonicator để xử lý bằng sóng siêu âm đồng thời 10 mẫu, ví dụ như để chiết xuất và hòa tan protein
Tìm máy siêu âm phù hợp nhất cho quy trình hòa tan protein của bạn!
Đối với các phòng thí nghiệm xử lý mẫu quý hiếm, nguyên liệu đầu vào ít hoặc phân tích proteomics công suất cao, danh mục sản phẩm của Hielscher cung cấp nhiều giải pháp siêu âm có thể được điều chỉnh chính xác để phù hợp với quy trình làm việc.
Cho dù bạn chọn máy siêu âm kiểu đầu dò Hielscher, máy siêu âm nhiều ống VialTweeter hay máy siêu âm đĩa vi UIP400MTP – Mỗi mẫu máy siêu âm đều được thiết kế để đáp ứng các tình huống chuẩn bị mẫu khác nhau, đồng thời đều sở hữu cùng một ưu điểm cốt lõi: cung cấp năng lượng siêu âm ổn định, giúp xử lý mẫu một cách hiệu quả và có kiểm soát.
Sonicators loại đầu dò
Các đầu dò siêu âm như UP200Ht đặc biệt phù hợp để xử lý siêu âm trực tiếp từng mẫu riêng lẻ. Đối với các phòng thí nghiệm proteomics, UP200Ht là lựa chọn lý tưởng khi cần tái hòa tan mạnh mẽ các cặn protein trong thể tích nhỏ đến trung bình, đặc biệt là trong những trường hợp yêu cầu kiểm soát quy trình và độ lặp lại cao. Việc xử lý siêu âm trực tiếp bằng đầu dò có thể nhanh chóng phá vỡ cấu trúc cặn đặc và giúp dung dịch hòa tan tiếp cận các protein vốn có thể vẫn còn chưa hòa tan hoàn toàn.
Tổng quan về tất cả các loại máy siêu âm dạng đầu dò!
Máy siêu âm đa ống VialTweeter
Khi cần xử lý nhiều lọ kín trong cùng một điều kiện, máy siêu âm đa ống VialTweeter mang lại lợi thế rõ rệt. VialTweeter cho phép thực hiện quá trình siêu âm cường độ cao với thể tích nhỏ, xử lý đồng thời nhiều lọ kín trong điều kiện vô trùng. Việc chuẩn bị mẫu đồng thời trong nhiều ống nghiệm dưới cùng điều kiện, cùng với việc giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm chéo, mất mẫu và hình thành aerosol trong quá trình xử lý ống nghiệm đóng kín, khiến VialTweeter trở thành công cụ đáng tin cậy cho việc chuẩn bị mẫu. Đối với lĩnh vực proteomics, điều này đặc biệt quan trọng khi xử lý các mẫu cặn quý giá từ nhiều bản sao hoặc mẫu lâm sàng, nơi tính nhất quán giữa các ống nghiệm là yếu tố then chốt.
Tìm hiểu thêm về VialTweeter!
Máy siêu âm tấm siêu âm UIP400MTP
Đối với các phòng thí nghiệm có công suất xử lý cao, máy siêu âm microplate UIP400MTP mở rộng những lợi ích của công nghệ siêu âm vào các quy trình làm việc dựa trên đĩa. UIP400MTP là máy siêu âm dành cho đĩa vi giếng và đĩa đa giếng, cho phép xử lý siêu âm đồng đều trên các đĩa tiêu chuẩn, bao gồm cả định dạng 96 giếng, và nhấn mạnh tính phù hợp của nó trong việc chuẩn bị mẫu tự động trong các lĩnh vực như proteomics, chẩn đoán và phát hiện thuốc. Nền tảng này được thiết kế để xử lý đồng thời nhiều mẫu, với các ưu điểm như giảm nguy cơ lây nhiễm chéo, giảm cường độ lao động, cải thiện hiệu suất thu hồi mẫu và tích hợp vào các quy trình làm việc tự động.
Trong lĩnh vực proteomics thực tiễn, điều này có nghĩa là các bước hòa tan cặn, phá vỡ tế bào, chiết xuất và các bước chuẩn bị liên quan có thể được mở rộng quy mô một cách hiệu quả hơn nhiều. Thay vì xử lý mẫu từng cái một, các phòng thí nghiệm có thể sử dụng sóng siêu âm để xử lý toàn bộ đĩa mẫu với mức năng lượng đầu vào ổn định. Điều này đặc biệt hữu ích khi quy trình làm việc cần kết hợp năng suất cao với độ chính xác phân tích, ví dụ như trong các nghiên cứu sàng lọc, proteomics định lượng hoặc các quy trình chuẩn bị mẫu tiêu chuẩn hóa. Do đó, UIP400MTP không chỉ là một công cụ tiện lợi; nó là một nền tảng hỗ trợ xu hướng rộng lớn hơn hướng tới tự động hóa, khả năng tái tạo và proteomics thông lượng cao mạnh mẽ.
Tìm hiểu thêm về máy siêu âm vi đĩa UIP400MTP!
VialTweeter trong buồng làm lạnh – Các thông số quá trình được kiểm soát trong quá trình siêu âm.
Chiết xuất và hòa tan protein với năng suất cao với máy siêu âm cho đĩa vi giếng UIP400MTP
Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng Sản xuất tại Đức
Hielscher ultrasonicators nổi tiếng với chất lượng cao nhất và tiêu chuẩn thiết kế của họ. Mạnh mẽ và hoạt động dễ dàng cho phép tích hợp trơn tru của ultrasonicators của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi dễ dàng được xử lý bởi Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics là một công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt nhấn mạnh vào ultrasonicators hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, Hielscher ultrasonicators là CE tuân thủ và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.
Văn học / Tài liệu tham khảo
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
- Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
- Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.
Các câu hỏi thường gặp
Tại sao bồn siêu âm không phù hợp để hòa tan protein?
Trong bể siêu âm, hiện tượng xâm thực (cavitation) – nguyên lý hoạt động của quá trình siêu âm – diễn ra rất không đồng đều, khiến các mẫu phải chịu các mức độ xử lý siêu âm khác nhau. Tùy thuộc vào vị trí của các ống mẫu trong bể siêu âm, mỗi mẫu sẽ chịu tác động với cường độ khác nhau. Nghiên cứu proteomics đòi hỏi tính so sánh. Nếu một cặn mẫu chưa tan hoàn toàn trong khi cặn khác đã được tái phân tán hoàn toàn, dữ liệu thu được có thể phản ánh sự sai lệch trong quá trình chuẩn bị hơn là thực tế sinh học. Trái ngược với bể siêu âm, các thiết bị siêu âm không tiếp xúc như VialTweeter hoặc Microplate Sonicator UIP400MTP hỗ trợ việc xử lý tiêu chuẩn hóa hơn bằng cách cho phép xử lý song song nhiều mẫu trong các điều kiện siêu âm phù hợp, giúp cải thiện khả năng tái tạo trong các thí nghiệm. Điều này đặc biệt hữu ích trong các nghiên cứu về dấu ấn sinh học, proteomics so sánh và các quy trình làm việc với nhiều bản sao sinh học hoặc kỹ thuật.
Các phương pháp phân tích phổ biến nhất trong lĩnh vực proteomics là gì?
Các phương pháp xét nghiệm phổ biến nhất trong lĩnh vực proteomics là các phương pháp định lượng protein và các phương pháp đặc trưng hóa protein được sử dụng trong quá trình chuẩn bị và phân tích mẫu. Các phương pháp thử nghiệm thường được sử dụng bao gồm phương pháp Bradford, phương pháp BCA, phương pháp Lowry và đo độ hấp thụ tia cực tím (UV) ở bước sóng 280 nm để đo nồng độ protein. Trong các quy trình proteomics rộng hơn, SDS-PAGE, Western blotting, ELISA, phân giải trong gel và các phân tích dựa trên phổ khối cũng được sử dụng rộng rãi để đánh giá sự phong phú, độ tinh khiết, khối lượng phân tử và bản chất của protein.
Coomassie Brilliant Blue là gì?
Coomassie Brilliant Blue là một loại thuốc nhuộm triphenylmethane được sử dụng rộng rãi trong khoa học protein để nhuộm protein trên gel và định lượng protein bằng phương pháp quang phổ. Chất này chủ yếu liên kết với các dư lượng axit amin bazơ và thơm, đặc biệt là arginine, và trải qua sự dịch chuyển quang phổ khi liên kết với protein. Đặc tính này khiến nó trở nên hữu ích cả trong việc quan sát protein sau khi điện di lẫn trong phương pháp định lượng protein theo phương pháp Bradford.
Phương pháp Bradford hoạt động như thế nào?
Phương pháp Bradford hoạt động bằng cách trộn mẫu protein với thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue trong điều kiện axit. Khi thuốc nhuộm liên kết với protein, bước sóng hấp thụ cực đại của nó dịch chuyển từ khoảng 465 nm sang 595 nm, gây ra sự thay đổi màu có thể đo lường được từ nâu đỏ sang xanh lam. Sự gia tăng độ hấp thụ tại 595 nm tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi xác định, cho phép định lượng bằng cách so sánh với đường cong chuẩn, thường được chuẩn bị bằng albumin huyết thanh bò.
Sử dụng sóng siêu âm hội tụ trên các mẫu trong đĩa nhiều giếng
Hielscher Ultrasonics sản xuất homogenizers siêu âm hiệu suất cao từ phòng thí nghiệm đến quy mô công nghiệp.