Hòa tan cặn protein bằng siêu âm

Trong hệ protein học, chuẩn bị mẫu chưa bao giờ là một chi tiết nhỏ. Đây là nền tảng bảo đảm độ chính xác của việc định danh, độ tin cậy của phép định lượng và khả năng tái lập. Một trong những thách thức dai dẳng nhất trong chuẩn bị mẫu protein là hòa tan lại hiệu quả cặn protein sau các bước kết tủa hoặc cô đặc. Đây chính là lý do việc hòa tan cặn protein bằng siêu âm ngày càng trở nên quan trọng. Bằng cách áp dụng xử lý siêu âm có kiểm soát, các phòng thí nghiệm có thể cải thiện khả năng thu hồi protein, đẩy nhanh quá trình hòa tan cặn và chuẩn bị mẫu hiệu quả hơn cho các bước phân tích khối phổ và sinh hóa tiếp theo.

Hòa tan protein: Vì sao xử lý siêu âm quan trọng trong hệ protein học hiện đại

Cặn protein thường hình thành trong quá trình kết tủa bằng acetone, ethanol, methanol–chloroform, amoni sulfat hoặc TCA. Các quy trình này được sử dụng rộng rãi để loại bỏ tạp chất, cô đặc protein và tinh sạch dịch chiết trước khi phân tích. Tuy nhiên, sau khi kết tủa hoàn tất, cặn thu được có thể khó hòa tan lại. Các khối kết tụ đặc chắc, miền kỵ nước, protein liên kết với màng và phức hợp protein tương tác mạnh thường khó bị phân tán bằng phương pháp trộn hoặc trộn xoáy thông thường. Khi đó, việc hòa tan không hoàn toàn có thể dẫn đến mất mẫu, sai lệch về tính đại diện của các protein và khả năng tái lập kém giữa các thí nghiệm.
Xử lý siêu âm giải quyết chính điểm nghẽn này. Thông qua việc tạo ra năng lượng cơ học trong môi trường lỏng, xử lý siêu âm phá vỡ cấu trúc cặn đặc chắc, thúc đẩy dung dịch đệm thấm vào và phân tán vật chất kết tụ vào dung dịch. Kết quả là protein được hoàn nguyên nhanh hơn và thường hoàn toàn hơn, điều này đặc biệt có giá trị khi làm việc với lượng mẫu hạn chế, dịch ly giải phức tạp hoặc các đối tượng phân tích khó trong hệ protein học.

Vì sao cặn protein khó hòa tan

Kết tủa protein có hiệu quả vì quá trình này buộc protein tách khỏi dung dịch. Tuy nhiên, chính quá trình khiến phương pháp kết tủa trở nên hữu ích cũng gây ra khó khăn khi thu hồi protein từ cặn. Sau khi tạo thành cặn, protein có thể xếp sít nhau và bị biến tính một phần. Các tương tác kỵ nước có thể mạnh lên, liên kết giữa các phân tử có thể tăng và một số protein có thể giữ lại muối, lipid, axit nucleic hoặc các thành phần khác của nền mẫu. Ngay cả khi sử dụng dung dịch đệm có khả năng hòa tan mạnh, quá trình tái huyền phù thụ động vẫn thường chậm và không hoàn toàn.
Trong hệ protein học, điều này có ý nghĩa quan trọng vì việc hòa tan cặn không hoàn toàn không chỉ làm giảm tổng lượng thu hồi. Nó còn có thể loại bỏ có chọn lọc một số nhóm protein, đặc biệt là protein màng, protein cấu trúc hoặc các loại protein dễ kết tụ. Điều đó có nghĩa là kết quả phân tích cuối cùng có thể không còn phản ánh đúng thành phần thực sự của mẫu ban đầu. Trong hệ protein học có độ phân giải cao, nơi những khác biệt nhỏ về mức độ phong phú hoặc biến đổi sau dịch mã có thể mang tính quyết định về mặt sinh học, sai lệch do chuẩn bị mẫu như vậy là một hạn chế nghiêm trọng.

Xử lý siêu âm cải thiện quá trình hòa tan cặn protein như thế nào

Xử lý siêu âm cải thiện quá trình hòa tan bằng cách đưa năng lượng cơ học tần số cao vào mẫu. Năng lượng này giúp phá vỡ vật chất cặn đặc chắc và tăng sự tiếp xúc giữa dung dịch đệm hòa tan với các protein nằm bên trong. Thay vì chỉ dựa vào khuếch tán và trộn thủ công, quá trình này chủ động phân tán cặn thành các phần nhỏ hơn, dễ hòa tan hơn.

Hiệu quả thực tế rất đáng kể. Xử lý siêu âm có thể:

• đẩy nhanh quá trình hòa tan các cặn protein đặc chắc hoặc khó hòa tan
• cải thiện khả năng thu hồi các protein ít tan và protein kết tụ
• rút ngắn thời gian chuẩn bị trong các quy trình hệ protein học
• giúp tạo ra các mẫu đồng nhất hơn cho quá trình phân giải protein và phân tích

Khả năng phân tán được tăng cường này đặc biệt hữu ích khi các khối cặn được tái huyền phù trong dung dịch đệm chứa urê, thiourê, chất tẩy rửa, chất phá vỡ cấu trúc hoặc các thuốc thử khác thường dùng trong nghiên cứu hệ protein. Xử lý siêu âm giúp các thành phần này tiếp cận và hòa tan khối cặn hiệu quả hơn, tạo ra dung dịch mẫu đồng nhất hơn.

Ưu điểm của việc hòa tan bằng siêu âm trong nghiên cứu hệ protein

Ưu điểm chính của việc hòa tan bằng siêu âm là biến một bước chuẩn bị thường bị đánh giá thấp thành một quy trình có thể kiểm soát và hiệu quả. Trong nghiên cứu hệ protein, điều này tác động trực tiếp đến kết quả phân tích.

1. Thứ nhất, khả năng hòa tan được cải thiện làm tăng khả năng mẫu đưa vào bước phân giải bằng enzyme đại diện cho toàn bộ quần thể protein. Ví dụ, quá trình phân giải bằng trypsin phụ thuộc vào việc protein được mở cuộn đầy đủ và có thể được enzyme tiếp cận trong dung dịch. Nếu một phần khối cặn vẫn chưa hòa tan, các protein đó trên thực tế sẽ bị loại khỏi quá trình tạo peptide và do đó không được phát hiện.
2. Thứ hai, xử lý siêu âm có thể cải thiện khả năng tái lập. Việc tái huyền phù khối cặn bằng tay vốn có tính biến thiên, đặc biệt khi có sự khác biệt về người thao tác, kích thước khối cặn hoặc nền mẫu. Xử lý siêu âm có kiểm soát chuẩn hóa năng lượng vật lý tác động lên mẫu, nhờ đó có thể giảm biến thiên giữa các lần chuẩn bị và cải thiện tính nhất quán trong các quy trình LC-MS hoặc dựa trên gel ở các bước tiếp theo.
3. Thứ ba, xử lý siêu âm có giá trị rất lớn đối với các mẫu có lượng vật liệu đầu vào ít và các mẫu quý. Nghiên cứu hệ protein lâm sàng, khám phá dấu ấn sinh học, thí nghiệm nuôi cấy tế bào và nghiên cứu mô thường dựa vào lượng vật liệu hạn chế. Bất kỳ sự thất thoát protein nào trong quá trình hòa tan đều làm giảm giá trị thông tin của mẫu. Việc hòa tan lại hiệu quả bằng siêu âm giúp giữ lại lượng chất phân tích nhiều nhất có thể.
4. Cuối cùng, xử lý siêu âm giúp tăng tốc độ của quy trình. Các phòng thí nghiệm nghiên cứu hệ protein xử lý nhiều mẫu cần những phương pháp chuẩn bị ổn định và tiết kiệm thời gian. Một khối cặn hòa tan nhanh chóng và hoàn toàn không chỉ mang lại sự thuận tiện; điều này còn giảm chậm trễ, giảm nguy cơ sai sót khi thao tác và tăng năng suất xử lý mẫu.

Xử lý siêu âm so với các phương pháp tái huyền phù thông thường

Các phương pháp tái huyền phù khối cặn truyền thống thường bao gồm hút nhả bằng pipet, khuấy, lắc xoáy, ủ kéo dài hoặc gia nhiệt nhiều lần. Mặc dù các kỹ thuật này có thể hiệu quả đối với những khối cặn kết tụ lỏng lẻo, chúng thường gặp khó khăn với vật liệu protein có cấu trúc rất đặc chắc hoặc có tính kỵ nước. Chỉ trộn cơ học có thể không phá rã hoàn toàn cấu trúc khối cặn, để lại các hạt nhìn thấy được hoặc các phần không tan không nhìn thấy được.
Xử lý siêu âm mang lại cách tiếp cận chủ động và có mục tiêu hơn. Thay vì phụ thuộc vào sự khuếch tán chậm của dung dịch đệm, phương pháp này phá vỡ khối cặn bằng tác động vật lý và thúc đẩy quá trình đồng nhất hóa nhanh chóng. Điều này không loại bỏ nhu cầu sử dụng dung dịch đệm tái huyền phù phù hợp, nhưng giúp tăng đáng kể hiệu quả của dung dịch đệm đó.
So với các phương pháp hoàn toàn thủ công, hòa tan bằng siêu âm thường cho phép kiểm soát quy trình tốt hơn, đạt hiệu quả cao hơn và phù hợp hơn với các ứng dụng nghiên cứu hệ protein có yêu cầu khắt khe. Đối với các phòng thí nghiệm cần cả chất lượng phân tích lẫn độ tin cậy trong vận hành, những ưu điểm này khiến xử lý siêu âm trở thành một lựa chọn hấp dẫn.

Những trường hợp ứng dụng phù hợp nhất để hòa tan khối cặn protein bằng siêu âm

Hòa tan bằng siêu âm đặc biệt có lợi trong các quy trình bao gồm:

• kết tủa protein trước khi phân tích khối phổ,
• hoàn nguyên các khối cặn từ dịch ly giải tế bào hoặc dịch chiết mô,
• thu hồi các protein có nhiều trong màng hoặc dễ kết tụ,
• và chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu hệ protein định lượng, trong đó khả năng tái lập là yếu tố thiết yếu.

Phương pháp này cũng rất phù hợp khi các khối cặn đã được bảo quản, bị làm khô quá mức hoặc được tạo ra từ các nền mẫu sinh học phức tạp. Trong những trường hợp như vậy, việc tái huyền phù thụ động có thể trở nên đặc biệt kém hiệu quả, trong khi xử lý siêu âm giúp khôi phục khả năng sử dụng mẫu mà ít cần can thiệp thủ công hơn.

Tìm máy siêu âm tốt nhất cho quy trình hòa tan protein của bạn!

Đối với các phòng thí nghiệm làm việc với mẫu quý, lượng vật liệu đầu vào ít hoặc hệ protein học có năng suất xử lý mẫu cao, danh mục sản phẩm của Hielscher cung cấp nhiều hình thức xử lý siêu âm có thể phù hợp chính xác với quy trình làm việc.
Dù bạn chọn máy siêu âm dạng đầu dò của Hielscher, máy siêu âm đa ống VialTweeter hay máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP – mỗi mẫu máy siêu âm đều đáp ứng một tình huống chuẩn bị mẫu khác nhau, đồng thời có chung một ưu điểm cốt lõi: năng lượng siêu âm có khả năng tái lập để xử lý mẫu hiệu quả và có kiểm soát.

Máy siêu âm dạng đầu dò

Các đầu dò siêu âm như UP200Ht đặc biệt phù hợp để xử lý siêu âm trực tiếp từng mẫu riêng lẻ. Đối với các phòng thí nghiệm hệ protein học, UP200Ht là một lựa chọn hiệu quả khi cần tái huyền phù mạnh các cặn lắng protein trong thể tích nhỏ đến trung bình, đặc biệt khi việc kiểm soát phương pháp và độ lặp lại đóng vai trò quan trọng. Xử lý siêu âm trực tiếp bằng đầu dò có thể nhanh chóng phá vỡ khối cặn lắng đặc chắc và giúp dung dịch đệm hòa tan tiếp cận những protein mà nếu không được xử lý như vậy sẽ vẫn chưa hòa tan hoàn toàn.
Tổng quan về tất cả các máy siêu âm dạng đầu dò!
 
 
 

Máy siêu âm đa ống VialTweeter

Khi cần xử lý nhiều lọ kín trong các điều kiện giống hệt nhau, máy siêu âm đa ống VialTweeter mang lại ưu điểm rõ rệt. VialTweeter cho phép xử lý siêu âm mạnh các thể tích nhỏ bằng cách xử lý siêu âm nhiều lọ kín trong điều kiện vô trùng. Khả năng chuẩn bị mẫu đồng thời trong nhiều ống nghiệm ở cùng điều kiện, cùng với việc giảm nguy cơ nhiễm chéo, mất mẫu và hình thành khí dung trong quá trình xử lý trong lọ kín, giúp VialTweeter trở thành công cụ đáng tin cậy để chuẩn bị mẫu. Đối với hệ protein học, điều này đặc biệt có ý nghĩa khi xử lý các cặn lắng quý từ nhiều mẫu lặp hoặc mẫu lâm sàng, khi tính nhất quán giữa các ống đóng vai trò thiết yếu.
Tìm hiểu thêm về VialTweeter!

Máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP

Đối với các phòng thí nghiệm có năng suất xử lý mẫu cao, máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP mở rộng lợi ích của việc xử lý siêu âm sang các quy trình sử dụng đĩa. UIP400MTP, với vai trò là máy siêu âm đĩa vi giếng và đĩa nhiều giếng để xử lý siêu âm đồng đều trên các đĩa tiêu chuẩn, bao gồm cả định dạng 96 giếng, đồng thời nhấn mạnh tính phù hợp của thiết bị đối với việc chuẩn bị mẫu tự động trong các lĩnh vực như hệ protein học, chẩn đoán và khám phá thuốc. Nền tảng này được thiết kế để xử lý đồng thời nhiều mẫu, với các ưu điểm như giảm nguy cơ nhiễm chéo, giảm cường độ lao động, cải thiện khả năng thu hồi mẫu và tích hợp vào các quy trình tự động.
Trong thực hành hệ protein học, điều này có nghĩa là việc hòa tan cặn lắng, ly giải tế bào, chiết xuất và các bước chuẩn bị liên quan có thể được mở rộng quy mô hiệu quả hơn nhiều. Thay vì xử lý từng mẫu một, các phòng thí nghiệm có thể xử lý siêu âm toàn bộ đĩa với mức năng lượng đầu vào nhất quán. Điều này có giá trị bất cứ khi nào quy trình cần kết hợp năng suất xử lý mẫu với tính chặt chẽ trong phân tích, chẳng hạn như trong các nghiên cứu sàng lọc, hệ protein học định lượng hoặc các quy trình chuẩn bị mẫu đã được chuẩn hóa. Vì vậy, UIP400MTP không chỉ là một công cụ mang lại sự tiện lợi; đây còn là nền tảng hỗ trợ xu hướng rộng hơn hướng tới tự động hóa, khả năng tái lập và hệ protein học có năng suất xử lý mẫu cao với độ tin cậy cao.
Tìm hiểu thêm về máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP!

Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng sản xuất tại Đức

Các máy siêu âm Hielscher nổi tiếng với chất lượng và tiêu chuẩn thiết kế cao nhất. Độ bền và khả năng vận hành dễ dàng cho phép tích hợp thuận lợi các máy siêu âm của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Các máy siêu âm Hielscher dễ dàng đáp ứng điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi cao.

Hielscher Ultrasonics là công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt chú trọng các máy siêu âm hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến nhất và dễ sử dụng. Tất nhiên, các máy siêu âm Hielscher tuân thủ CE và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.

Tài liệu / Tài liệu tham khảo

• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
• Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
• Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.