Chiết xuất protein từ mô khối u có hỗ trợ siêu âm – Quy trình

Quy trình này mô tả phương pháp chiết xuất protein từ mô khối u có hỗ trợ siêu âm, cải tiến quy trình ly giải bằng urê tiêu chuẩn của CPTAC bằng cách bổ sung bước xử lý siêu âm bằng đầu dò có kiểm soát trong quá trình phá vỡ mô. Dựa trên chiến lược chuẩn bị hệ protein và hệ phosphoprotein chuyên sâu đã được thiết lập của CPTAC, thay đổi này giúp cải thiện khả năng phá vỡ tế bào và các cấu trúc dưới tế bào, giảm độ nhớt của mẫu và tăng cường giải phóng các protein thường khó thu hồi hơn nếu chỉ ly giải bằng urê, đặc biệt là các protein gắn màng và các protein liên kết DNA hoặc liên quan đến nhân. Trong nghiên cứu làm cơ sở cho quy trình này, quy trình có hỗ trợ siêu âm đã tăng khả năng phát hiện cả protein lẫn phosphopeptide, đồng thời duy trì khả năng tương thích với chuỗi bước tiếp theo theo phương pháp CPTAC, gồm phân cắt bằng enzyme, đánh dấu TMT, phân đoạn, làm giàu phosphopeptide và phân tích LC-MS/MS.

Chiết xuất protein từ mô khối u có hỗ trợ siêu âm để phân tích chuyên sâu hệ protein và hệ phosphoprotein

Quy trình sau đây được tối ưu hóa để chiết xuất protein từ mô khối u đã được nghiền thành bột ở nhiệt độ cực thấp trong đệm ly giải urê 8 M: Bước xử lý siêu âm bằng đầu dò được bổ sung giúp cải thiện khả năng thu hồi các nhóm protein khó chiết xuất, đặc biệt là các protein liên quan đến màng và DNA/nhân, trước khi phân cắt bằng enzyme và phân tích LC-MS/MS ở các bước tiếp theo. Trong nghiên cứu làm cơ sở cho quy trình này của Li et al. (2025), việc bổ sung siêu âm đã tăng khả năng phát hiện các protein liên quan đến màng và nhân, đồng thời hỗ trợ độ bao phủ chuyên sâu với >12.000 protein và >25.000 phosphopeptide trong quy trình của họ.

Phạm vi áp dụng của quy trình

Sử dụng quy trình này cho:

• mô khối u được đông lạnh khi còn tươi và nghiền thành bột ở nhiệt độ cực thấp
• cặn tế bào hoặc các mẫu sinh học khác đã có phương pháp chiết xuất bằng urê được thiết lập
• các quy trình phân tích hệ protein và hệ phosphoprotein toàn cục sử dụng phân cắt bằng trypsin và đánh dấu TMT tùy chọn

Nghiên cứu của Li et al. (2025) cho biết quy trình này cũng áp dụng được cho các loại mẫu khác như dòng tế bào, máu và nước tiểu, tuy nhiên có thể cần tối ưu hóa tùy theo loại mẫu.

Quy trình chuẩn bị mẫu được tối ưu hóa có tích hợp bước xử lý siêu âm. Quy trình được tối ưu hóa và thiết kế thí nghiệm dựa trên quy trình chuẩn bị mẫu CPTAC để phân tích hệ protein và hệ phosphoprotein toàn cục.
Nghiên cứu và sơ đồ: ©Li et al., 2025

Nguyên lý hoạt động

Nghiên cứu gốc đã bổ sung siêu âm vào quy trình ly giải bằng urê tiêu chuẩn của CPTAC và ghi nhận khả năng phát hiện các protein liên quan đến màng và nhân được cải thiện. Các tác giả nêu rõ rằng các thông số siêu âm phải được tinh chỉnh theo kích thước/nồng độ mẫu – thông qua việc lựa chọn kích thước đầu siêu âm, năng lượng đầu vào và thời gian xung.

Ví dụ, đối với Hielscher UP200Ht và UP200St, điều này có nghĩa là:

• sử dụng biên độ và chế độ xung làm các biến điều khiển chính
• giữ mẫu lạnh trong suốt quá trình (tức là trên đá)
• bắt đầu với các thông số cài đặt thận trọng
• tối ưu hóa dựa trên độ trong của mẫu, nhiệt độ, lượng protein thu hồi và chất lượng peptide ở các bước tiếp theo

 
Cả hai mẫu máy siêu âm Hielscher 200 oát UP200Ht và UP200St đều được thiết kế cho các thể tích mẫu nhỏ và trung bình, với biên độ và chế độ xung có thể điều chỉnh; cả hai máy đồng nhất hóa siêu âm đều có điều khiển kỹ thuật số qua màn hình cảm ứng để điều chỉnh thông số chính xác, ghi dữ liệu tự động, cảm biến nhiệt độ có thể cắm kết nối, điều khiển từ xa và chiếu sáng mẫu.
 

Thuốc thử để chiết xuất protein có hỗ trợ siêu âm

Đệm ly giải urê

Pha mới ngay trước khi sử dụng:

• Urê 8 M
• NaCl 75 mM
• Tris 50 mM, pH 8,0
• EDTA 1 mM
• Aprotinin 2 µg/mL
• Leupeptin 10 µg/mL
• PMSF 1 mM
• NaF 10 mM
• PUGNAc 20 µM
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Urê phải được hòa tan hoàn toàn trước khi thêm các chất phụ gia; nên thêm các chất ức chế ngay trước khi sử dụng; nên giữ đệm trên đá; và sau khi thêm các chất phụ gia, nên lắc xoay nhẹ thay vì trộn xoáy mạnh.
 

Các thuốc thử bổ sung:

• Thuốc thử định lượng protein bằng phương pháp BCA
• Tris-HCl 50 mM, pH 8,0
• DTT
• Iodoacetamide
• LysC
• Trypsin
• Axit formic
• Thuốc thử TMT, nếu sử dụng phương pháp phân tích hệ protein định lượng đa kênh
• Thuốc thử IMAC, nếu thực hiện làm giàu phosphopeptide

Thiết bị để chiết xuất protein có hỗ trợ siêu âm

Cần có

Khuyến nghị lựa chọn đầu dò

Đối với mẫu có thể tích khoảng 200–1000 µL, hãy sử dụng đầu phát siêu âm đường kính nhỏ phù hợp để xử lý trực tiếp các thể tích nhỏ ở cường độ cao. Hielscher cung cấp nhiều đường kính đầu phát siêu âm khác nhau, và đường kính đầu dò nhỏ hơn tạo ra cường độ cao hơn tại đầu dò.

Lưu ý thực hành: Sử dụng đầu dò nhỏ nhất có thể trộn hiệu quả mà không tạo bọt quá mức hoặc chạm vào thành bình chứa.

Nếu xử lý nhiều mẫu cùng lúc, bạn có thể cân nhắc máy siêu âm nhiều ống VialTweeter hoặc máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP!

Hướng dẫn từng bước: Quy trình chiết xuất protein có hỗ trợ siêu âm

A. Làm lạnh trước và chuẩn bị

1. Làm lạnh máy ly tâm xuống 4°C.
2. Pha mới dung dịch đệm ly giải urê và giữ trên đá.
3. Lắp UP200Ht hoặc UP200St trên giá đỡ bên trong hộp cách âm.
4. Chuẩn bị bể nước đá đủ lớn để giữ các ống mẫu thẳng đứng và ổn định.

Việc pha mới dung dịch đệm và thao tác trong điều kiện lạnh là hết sức quan trọng.

B. Chiết xuất ban đầu bằng urê

1. Giữ mô đã nghiền thành bột ở nhiệt độ cực thấp trên đá.
2. Thêm 200 µL dung dịch đệm ly giải urê đã làm lạnh cho mỗi 50 mg mô ướt.
3. Trộn vortex ở tốc độ cao trong 5–10 s.
4. Ủ trong 15 min ở 4°C.
5. Lặp lại bước trộn vortex kết hợp ủ thêm một lần nữa.
6. Ly tâm ở 20.000g trong 10 min tại 4°C.
7. Chuyển dịch ly giải/dịch nổi sang một ống sạch có khả năng hạn chế hấp phụ mẫu.

C. Xử lý siêu âm bằng UP200Ht hoặc UP200St

Điều kiện ban đầu để xử lý siêu âm

• Biên độ: bắt đầu ở 20–30%
• Độ dài xung: BẬT trong 5 s
• Làm lạnh: giữ trên đá trong 2 min giữa các xung
• Số chu kỳ: 4 chu kỳ
• Tổng thời gian phát siêu âm thực tế: 20 s
• Tổng thời gian xử lý bao gồm làm lạnh: khoảng 8–10 min

Các bước xử lý siêu âm

1. Chuyển dịch ly giải sang ống phù hợp để xử lý siêu âm. Sử dụng ống hẹp, thành mỏng, cho phép trao đổi nhiệt tốt và nhúng đầu dò an toàn.
2. Đặt ống vào bể nước đá. Bài báo xác định rằng làm lạnh trong quá trình xử lý siêu âm là hết sức quan trọng để ngăn tổn thương do nhiệt.
3. Nhúng đầu dò vào mẫu. Giữ đầu dò ngập đủ sâu để duy trì hiện tượng xâm thực ổn định, nhưng không để đầu dò chạm vào thành hoặc đáy ống.
4. Phát một xung 5 s ở biên độ ban đầu.
5. Ngay lập tức đặt toàn bộ phần chứa mẫu trở lại trong đá trong 2 min.
6. Lặp lại cho đến khi hoàn thành 4 chu kỳ.
7. Kiểm tra dịch ly giải sau chu kỳ.
8. Chỉ tiếp tục nếu cần, mỗi lần bổ sung một xung 5 s và luôn làm lạnh đầy đủ sau đó.
9. Dừng khi dịch ly giải trở nên đồng đều hơn và bớt kéo sợi/nhớt.
   Điểm kết thúc là khi dịch ly giải trở nên trong mờ hơn, tạo thành giọt thay vì chảy thành dòng nhớt liên tục.
10. Ly tâm ở khoảng 16.000g trong 15 min tại 4°C.
11. Chuyển dịch nổi đã làm trong sang một ống mới và đo nồng độ protein.

So sánh phân tích hệ protein toàn diện và hệ phosphoprotein giữa các mẫu được xử lý siêu âm và các mẫu không được xử lý siêu âm.
a. Số lượng protein được định danh (phân tích hệ protein toàn diện) trong tất cả các mô khối u PDX có hoặc không được xử lý siêu âm. b. Số lượng phosphopeptide được định danh (làm giàu bằng IMAC) trong tất cả các mô khối u PDX có hoặc không được xử lý siêu âm. Chỉ tính các protein và phosphopeptide có tỷ số độ phong phú lớn hơn hoặc bằng phân vị thứ 25. Tỷ số độ phong phú được tính giữa các mẫu cùng loại.
Nghiên cứu và đồ thị: ©Li và cộng sự, 2025

Phân giải bằng enzyme và phân tích ở các bước tiếp theo

Sau khi xử lý siêu âm và làm trong, tiến hành theo quy trình ban đầu theo phương pháp CPTAC:

1. Pha loãng dịch ly giải theo tỷ lệ 1:3 (v/v) bằng Tris-HCl 50 mM pH 8,0 để giảm nồng độ urê xuống <2 M.
2. Thêm LysC với lượng 1 mAU cho mỗi 50 µg protein và ủ trong 2 h ở 25°C.
3. Thêm trypsin theo tỷ lệ enzyme:cơ chất 1:49 (w/w) và phân giải qua đêm ở 25°C.
4. Dừng phản ứng bằng axit formic đến nồng độ cuối cùng là 1%.
5. Tiếp tục khử muối, gắn nhãn TMT, phân đoạn, làm giàu phosphopeptide và phân tích LC-MS/MS theo yêu cầu.

Biểu hiện khác biệt của các phosphopeptide từ phân tích MS có gắn nhãn TMT.
a. Phân nhóm dạng đáy, làm nổi bật một số phosphopeptide người (vị trí bắt đầu và kết thúc của trình tự protein) có mức biểu hiện tăng trong các mẫu được xử lý siêu âm so với các mẫu không được xử lý siêu âm. b. Phân nhóm lòng ống, làm nổi bật một số phosphopeptide người (vị trí bắt đầu và kết thúc của trình tự protein) có mức biểu hiện tăng trong các mẫu được xử lý siêu âm so với các mẫu không được xử lý siêu âm. c. Các con đường KEGG được làm giàu dựa trên các protein chứa phosphopeptide có mức biểu hiện tăng trong các khối u thuộc phân nhóm dạng đáy được xử lý siêu âm. d. Các con đường KEGG được làm giàu dựa trên các protein chứa phosphopeptide có mức biểu hiện tăng trong các khối u thuộc phân nhóm lòng ống được xử lý siêu âm.
Nghiên cứu và biểu đồ: ©Li et al., 2025

Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng sản xuất tại Đức

Các thiết bị siêu âm Hielscher nổi tiếng với các tiêu chuẩn cao nhất về chất lượng và thiết kế. Độ bền và khả năng vận hành dễ dàng cho phép tích hợp thuận lợi các thiết bị siêu âm của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Các thiết bị siêu âm Hielscher dễ dàng đáp ứng các điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi cao.

Hielscher Ultrasonics là công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt chú trọng đến các thiết bị siêu âm hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến nhất và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, các thiết bị siêu âm Hielscher tuân thủ CE và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.

Tài liệu / Tài liệu tham khảo

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.