Chiết xuất protein từ mô khối u với sự hỗ trợ của sóng siêu âm – Protocol
Quy trình này mô tả một phương pháp chiết xuất protein từ mô khối u có sự hỗ trợ của sóng siêu âm, nhằm cải tiến quy trình phân giải bằng urê tiêu chuẩn của CPTAC bằng cách bổ sung bước siêu âm có kiểm soát trong quá trình phá vỡ mô. Dựa trên chiến lược chuẩn bị proteome và phosphoproteome quy mô lớn đã được thiết lập của CPTAC, sự điều chỉnh này cải thiện quá trình phá vỡ cấu trúc tế bào và cấu trúc dưới tế bào, giảm độ nhớt của mẫu, đồng thời tăng cường giải phóng các protein thường khó thu hồi hơn khi chỉ sử dụng phương pháp ly giải bằng urê, đặc biệt là các protein gắn với màng, liên kết với DNA hoặc liên quan đến nhân tế bào. Trong nghiên cứu cơ bản, quy trình làm việc hỗ trợ bằng siêu âm đã tăng cường khả năng phát hiện cả protein và phosphopeptide đồng thời duy trì khả năng tương thích với các bước xử lý tiếp theo theo phong cách CPTAC, bao gồm tiêu hóa, đánh dấu TMT, phân đoạn, làm giàu phosphopeptide và phân tích LC-MS/MS.
Chiết xuất protein từ mô khối u với sự hỗ trợ của sóng siêu âm để phân tích proteomics và phosphoproteomics sâu
The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.
đầu dò siêu âm UP200St để chiết xuất protein trong lĩnh vực proteomics
Phạm vi áp dụng của Nghị định thư
Áp dụng quy trình này cho:
- mô khối u đông lạnh tươi, được nghiền mịn bằng phương pháp đông lạnh
- các viên tế bào hoặc các mẫu sinh học khác mà phương pháp chiết xuất dựa trên urê đã được áp dụng
- các quy trình phân tích proteomics và phosphoproteomics toàn cầu sử dụng phương pháp phân giải bằng enzym trypsin và gắn nhãn TMT (tùy chọn)
Nghiên cứu của Li và cộng sự (2025) cho biết quy trình này cũng có thể áp dụng cho các loại mẫu khác như dòng tế bào, máu và nước tiểu, tuy nhiên có thể cần phải tối ưu hóa tùy theo loại mẫu.
Quy trình chuẩn bị mẫu được tối ưu hóa với bước xử lý bằng sóng siêu âm. Quy trình tối ưu hóa và thiết kế thí nghiệm này dựa trên quy trình chuẩn bị mẫu của CPTAC dành cho phân tích proteomics và phosphoproteomics toàn diện.
Nghiên cứu và sơ đồ: ©Li et al., 2025
Nguyên tắc làm việc
Nghiên cứu ban đầu đã bổ sung quá trình siêu âm vào quy trình phân giải protein bằng urê CPTAC tiêu chuẩn và phát hiện thấy khả năng phát hiện các protein liên kết với màng tế bào và nhân tế bào được cải thiện. Các tác giả cho biết các thông số siêu âm cần được điều chỉnh phù hợp với kích thước và nồng độ của mẫu. – bằng cách lựa chọn kích thước sonotrode, công suất đầu vào và thời gian xung.
Ví dụ, đối với các model Hielscher UP200Ht và UP200St, điều này có nghĩa là:
- sử dụng biên độ và chế độ xung làm các biến điều khiển chính
- Giữ mẫu ở nhiệt độ lạnh trong suốt quá trình (tức là đặt trên đá)
- bắt đầu với các cài đặt an toàn
- tối ưu hóa dựa trên độ trong của mẫu, nhiệt độ, năng suất protein và chất lượng peptide ở các bước tiếp theo
Cả hai mẫu máy siêu âm Hielscher 200 watt là UP200Ht và UP200St đều được thiết kế dành cho các mẫu có thể tích nhỏ và trung bình, với các cài đặt biên độ và xung có thể điều chỉnh; cả hai máy đồng nhất siêu âm này đều được trang bị màn hình cảm ứng kỹ thuật số để điều chỉnh thông số chính xác, ghi dữ liệu tự động, cảm biến nhiệt độ có thể tháo lắp, điều khiển từ xa và đèn chiếu sáng mẫu.
Các chất phản ứng dùng trong quá trình chiết xuất protein có sự hỗ trợ của sóng siêu âm
Dung dịch đệm ly giải urê
Chuẩn bị ngay trước khi dùng:
- 8 M urê
- 75 mM NaCl
- 50 mM Tris, pH 8,0
- 1 mM EDTA
- 2 µg/mL aprotinin
- 10 µg/mL leupeptin
- 1 mM PMSF
- 10 mM NaF
- 20 µM PUGNAc
- Hỗn hợp chất ức chế phosphatase 2, tỷ lệ 1:100 (thể tích/thể tích)
- Hỗn hợp chất ức chế phosphatase 3, tỷ lệ 1:100 (thể tích/thể tích)
Phải hòa tan hoàn toàn urê trước khi thêm các chất phụ gia; các chất ức chế nên được thêm vào ngay trước khi sử dụng; dung dịch đệm cần được bảo quản trên đá; và sau khi thêm các chất phụ gia, nên lắc nhẹ thay vì khuấy mạnh bằng máy vortex.
Các chất phản ứng khác:
- Dung dịch thử định lượng protein BCA
- 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
- DTT
- Iodoacetamid
- LysC
- Trypsin
- Axit formic
- Các chất phản ứng TMT, nếu sử dụng phương pháp phân tích protein định lượng đa thông tin
- Các chất phản ứng IMAC, nếu tiến hành quá trình làm giàu phosphopeptide
Máy siêu âm UP200Ht kèm đầu dò siêu nhỏ S26d2 để chuẩn bị mẫu
Thiết bị chiết xuất protein hỗ trợ bằng sóng siêu âm
Bắt buộc
Gợi ý lựa chọn đầu dò
Đối với các mẫu có thể tích khoảng 200–1000 µL, hãy sử dụng đầu siêu âm có đường kính nhỏ, phù hợp để xử lý trực tiếp với cường độ cao đối với thể tích nhỏ. Hielscher cung cấp nhiều loại đầu siêu âm với các đường kính khác nhau, và đường kính đầu nhỏ hơn sẽ mang lại cường độ cao hơn tại đầu siêu âm.
Lưu ý thực tế: Nên sử dụng đầu dò có kích thước nhỏ nhất có thể đảm bảo quá trình trộn hiệu quả mà không gây tạo bọt quá mức hoặc va chạm vào thành bình.
Nếu bạn đang làm việc với nhiều mẫu cùng một lúc, bạn có thể cân nhắc Máy siêu âm đa ống VialTweeter hoặc Máy siêu âm cho đĩa vi giếng UIP400MTP!
Hướng dẫn từng bước: Quy trình chiết xuất protein với sự hỗ trợ của sóng siêu âm
A. Làm lạnh trước và chuẩn bị
- Làm lạnh máy ly tâm xuống 4°C.
- Chuẩn bị dung dịch đệm ly giải urê mới và để trên đá.
- Đặt máy UP200Ht hoặc UP200St lên giá đỡ bên trong buồng cách âm.
- Chuẩn bị một chậu nước đá đủ lớn để có thể đặt các ống mẫu đứng thẳng và ổn định.
Việc chuẩn bị dung dịch đệm tươi và xử lý ở nhiệt độ thấp là rất quan trọng.
B. Chiết xuất urê ban đầu
- Giữ mô đã được nghiền lạnh trên đá.
- Thêm 200 µL dung dịch đệm ly giải urê đã làm lạnh cho mỗi 50 mg mô ướt.
- Xoáy trong 5–10 giây ở tốc độ cao.
- Ủ trong 15 phút ở 4°C.
- Lặp lại bước tạo xoáy kết hợp ủ một lần nữa.
- Ly tâm ở tốc độ 20.000g trong 10 phút ở nhiệt độ 4°C.
- Chuyển dịch chiết/dịch nổi sang một ống sạch có độ bám dính thấp.
C. Xử lý bằng sóng siêu âm với máy UP200Ht hoặc UP200St
Điều kiện ban đầu cho quá trình siêu âm
- Biên độ: bắt đầu từ 20–30%
- Thời gian xung: 5 giây (bật)
- Làm mát: Để trên đá 2 phút giữa các lần kích thích
- Số chu kỳ: 4 chu kỳ
- Tổng thời gian siêu âm hoạt động: 20 giây
- Tổng thời gian thực hiện, bao gồm cả thời gian làm lạnh: khoảng 8–10 phút
Các bước xử lý bằng sóng siêu âm
- Chuyển dịch chiết vào một ống thích hợp để xử lý bằng sóng siêu âm. Nên sử dụng ống có đường kính nhỏ, thành mỏng để đảm bảo trao đổi nhiệt tốt và có thể nhúng đầu dò một cách an toàn.
- Đặt ống vào bồn nước đá. Bài báo chỉ ra rằng việc làm mát trong quá trình siêu âm là yếu tố quan trọng để ngăn ngừa tổn thương do nhiệt.
- Nhúng đầu dò vào mẫu. Giữ đầu dò ngập đủ sâu để tạo ra hiện tượng xâm thực ổn định, nhưng không để đầu dò chạm vào thành hoặc đáy ống.
- Phát một xung kéo dài 5 giây với biên độ ban đầu.
- Ngay lập tức đặt mẫu trở lại vào đá trong 2 phút.
- Lặp lại cho đến khi hoàn thành 4 chu kỳ.
- Kiểm tra dịch chiết sau mỗi chu kỳ.
- Chỉ tiếp tục nếu cần thiết, mỗi lần chỉ sử dụng thêm một xung 5 giây, và luôn để thiết bị nguội hoàn toàn sau đó.
- Dừng lại khi dịch chiết trở nên đồng nhất hơn và bớt sợi/đặc quánh.
Kết quả cuối cùng là một dung dịch chiết xuất có độ trong suốt cao hơn, tạo thành các giọt thay vì một dòng chảy đặc sệt liên tục. - Ly tâm ở tốc độ khoảng 16.000g trong 15 phút ở nhiệt độ 4°C.
- Chuyển phần dịch trong đã lọc sang một ống mới và đo nồng độ protein.
So sánh phân tích proteomics và phosphoproteomics toàn diện giữa các mẫu đã được xử lý bằng sóng siêu âm và các mẫu chưa được xử lý bằng sóng siêu âm.
a. Số lượng protein được xác định (phân tích proteomics toàn diện) trong tất cả các mô khối u PDX có hoặc không có xử lý siêu âm. b. Số lượng phosphopeptide được xác định (phương pháp làm giàu IMAC) trong tất cả các mô khối u PDX có hoặc không có xử lý siêu âm. Chỉ tính đến các protein và phosphopeptide có tỷ lệ nồng độ lớn hơn hoặc bằng phân vị thứ 25. Tỷ lệ nồng độ được tính toán giữa các mẫu cùng loại.
Nghiên cứu và biểu đồ: ©Li et al., 2025
Quá trình xử lý và phân tích ở giai đoạn sau
Sau khi xử lý bằng sóng siêu âm và làm trong, hãy tiến hành theo quy trình làm việc theo kiểu CPTAC ban đầu như sau:
- Pha loãng dịch chiết theo tỷ lệ 1:3 (thể tích/thể tích) với dung dịch Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 để khử urê xuống <2 M.
- Thêm LysC với liều lượng 1 mAU trên 50 µg protein và ủ trong 2 giờ ở 25°C.
- Thêm trypsin theo tỷ lệ 1:49 (theo khối lượng) giữa enzyme và chất nền, sau đó ủ qua đêm ở 25°C.
- Làm nguội bằng axit formic cho đến khi nồng độ cuối cùng đạt 1%.
- Tiếp tục tiến hành khử muối, gắn nhãn TMT, phân đoạn, làm giàu phosphopeptide và phân tích LC-MS/MS theo yêu cầu.
Sự biểu hiện khác biệt của các peptit phosphoryl hóa được xác định bằng phương pháp phổ khối (MS) có gắn nhãn TMT.
a. Dạng cơ bản, nêu bật một số peptit phosphoryl hóa của người (đoạn đầu và đoạn cuối của trình tự protein) có mức biểu hiện tăng cao trong các mẫu được xử lý bằng sóng siêu âm so với các mẫu không được xử lý. b. Dạng luminal, nêu bật một số phosphopeptide của con người (protein_sequence begin và end) được điều chỉnh tăng trong các mẫu được xử lý bằng sóng siêu âm so với các mẫu không được xử lý bằng sóng siêu âm. c. Các con đường KEGG được làm giàu dựa trên các protein của phosphopeptide được điều chỉnh tăng trong các khối u dạng cơ bản được xử lý bằng sóng siêu âm. d. Các con đường KEGG được làm giàu dựa trên các protein của phosphopeptide được điều chỉnh tăng trong các khối u dạng luminal được xử lý bằng sóng siêu âm.
Nghiên cứu và biểu đồ: ©Li et al., 2025
Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng Sản xuất tại Đức
Hielscher ultrasonicators nổi tiếng với chất lượng cao nhất và tiêu chuẩn thiết kế của họ. Mạnh mẽ và hoạt động dễ dàng cho phép tích hợp trơn tru của ultrasonicators của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi dễ dàng được xử lý bởi Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics là một công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt nhấn mạnh vào ultrasonicators hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, Hielscher ultrasonicators là CE tuân thủ và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.
Sonicator tấm đa giếng UIP400MTP để chiết xuất protein với năng suất cao từ các mẫu
Văn học / Tài liệu tham khảo
- Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
- Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
- Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.
Các câu hỏi thường gặp
Sự khác biệt giữa quá trình chiết xuất protein từ mô thực vật và mô động vật có vú là gì?
Việc chiết xuất protein từ mô thực vật thường khó khăn hơn so với mô động vật có vú vì tế bào thực vật có thành tế bào cứng, giàu cellulose, chứa nhiều polysaccharide, hợp chất phenolic, sắc tố và các enzym nội sinh hoạt tính, những yếu tố này có thể cản trở quá trình hòa tan protein, gây nhiễm bẩn cho dịch chiết hoặc thúc đẩy quá trình phân hủy protein. Ngược lại, mô động vật có vú không có thành tế bào và thường dễ bị phá vỡ hơn về mặt hóa học, mặc dù nó thường chứa nhiều lipid, chất nền ngoại bào và protease hơn, những chất này vẫn có thể làm phức tạp quá trình chiết xuất. Do đó, các quy trình đối với thực vật thường yêu cầu phá vỡ cơ học mạnh hơn, nghiền ở nhiệt độ thấp và các chất phụ gia như PVPP, chất khử hoặc làm sạch dựa trên phenol, trong khi mô động vật thường được xử lý thành công hơn bằng các dung dịch đệm dựa trên chất tẩy rửa như RIPA hoặc hệ thống phân giải dựa trên urê. Cả mô thực vật và mô động vật đều có thể được phân giải hiệu quả bằng phương pháp siêu âm!
Làm thế nào để cải thiện hiệu quả chiết xuất protein từ mô bằng dung dịch đệm RIPA?
Quá trình chiết xuất protein từ mô bằng dung dịch đệm RIPA có thể được cải thiện bằng cách tối ưu hóa cả quá trình phá vỡ và bảo vệ mẫu. Các biện pháp quan trọng nhất bao gồm: giữ mô và dung dịch đệm ở nhiệt độ thấp, sử dụng các chất ức chế protease và phosphatase mới pha, băm nhỏ hoặc nghiền mịn mô kỹ lưỡng trước khi ly giải, duy trì tỷ lệ dung dịch đệm/mô phù hợp, và thêm bước phá vỡ cơ học như đồng nhất hóa hoặc siêu âm ngắn để phá vỡ mô dày đặc và giảm độ nhớt. Hiệu quả chiết xuất cũng được cải thiện khi lysate được ủ trên đá với sự trộn lẫn không liên tục, sau đó là ly tâm tốc độ cao trong tủ lạnh để loại bỏ các mảnh vụn không hòa tan. Đối với các mô sợi, giàu lipid hoặc có cấu trúc phức tạp, lặp lại quá trình chiết xuất một lần hoặc tăng thời gian tiếp xúc với chất tẩy rửa có thể cải thiện hiệu suất thu hồi, nhưng nên tránh siêu âm quá mức hoặc xử lý ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài vì chúng có thể làm biến tính protein hoặc tăng quá trình phân giải protein.
Cần tuân thủ những yêu cầu an toàn nào trong quá trình chiết xuất protein bằng sóng siêu âm?
Thực hiện quá trình siêu âm bằng đầu dò trong buồng cách âm hoặc khi đã trang bị thiết bị bảo vệ thính giác phù hợp. Hướng dẫn sử dụng đã cảnh báo cụ thể về tiếng ồn có thể nghe thấy gây hại phát sinh trong quá trình siêu âm.
Hãy đeo kính bảo hộ, áo blouse phòng thí nghiệm và găng tay.
Giữ đầu dò cách xa da và tuyệt đối không được sử dụng sóng siêu âm trên mạch máu hở nếu không có thiết bị chống bắn tung tóe.
Xử lý PMSF và các chất ức chế khác theo các quy định về an toàn hóa chất tại địa phương.
Giữ mẫu trên đá để giảm thiểu tổn thương protein do nhiệt gây ra; bài báo nhiều lần nhấn mạnh rằng việc kiểm soát nhiệt độ là yếu tố then chốt.
Máy tạo sóng siêu âm VialTweeter tăng tốc và cải thiện quá trình chiết xuất protein trong lĩnh vực proteomics
Hielscher Ultrasonics sản xuất homogenizers siêu âm hiệu suất cao từ phòng thí nghiệm đến quy mô công nghiệp.