Phân mảnh DNA siêu âm cho giải trình tự thế hệ tiếp theo
Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) đòi hỏi sự cắt và phân mảnh đáng tin cậy của DNA bộ gen để giải trình tự các chuỗi DNA di truyền và tạo ra các thư viện bộ gen. Sự phân mảnh DNA có kiểm soát thành các mảnh DNA là một bước chuẩn bị mẫu thiết yếu cần thiết trước khi DNA được giải trình tự. Siêu âm được chứng minh là kỹ thuật hiệu quả và đáng tin cậy để phân mảnh DNA có độ dài nhất định. Các giao thức phân mảnh DNA siêu âm đạt được kết quả phân mảnh có thể tái tạo. Máy siêu âm Hielscher có khả năng tạo ra một loạt các phân bố kích thước DNA gen, có thể kiểm soát chính xác thông qua các thông số hoạt động. Vì hệ thống cắt DNA siêu âm Hielscher có sẵn cho các lọ đơn và nhiều lọ cũng như cho các vi mô, việc chuẩn bị mẫu trở nên hiệu quả cao.
Các phân tích electrophoretic của DNA gen của E. coli EDL933 phải chịu các ultrasonication phút 0 – 15. L cho biết Ladder DNA. (Basselet et al. 2008)
- kết quả có thể lặp lại / tái sản xuất
- điều chỉnh chính xác để có được chiều dài mảnh nhất định
- xử lý nhanh chóng
- kết quả phân mảnh DNA nhất quán
- thiết bị cho bất kỳ khối lượng mẫu nào (ví dụ: nhiều lọ hoặc vi mô)
- thông lượng cao
- kiểm soát nhiệt độ chính xác
- thao tác đơn giản, thân thiện với người dùng
Giải trình tự thế hệ tiếp theo: Phân mảnh DNA siêu âm để chuẩn bị thư viện
Để thực hiện giải trình tự thế hệ tiếp theo, ba bước cơ bản của (1) chuẩn bị thư viện, (2) giải trình tự và (3) phân tích dữ liệu phải được thực hiện. Trong quá trình chuẩn bị thư viện, DNA bị phân mảnh, sau đó các đầu mảnh được sửa chữa (đánh bóng) bằng cách thêm một cơ sở adenine duy nhất và các mảnh mục tiêu được chuyển đổi thành DNA hai sợi. Cuối cùng, cái gọi là bộ điều hợp được gắn bằng cách thắt dây, PCR hoặc gắn thẻ để sản phẩm DNA thư viện cuối cùng có thể được định lượng để giải trình tự.
Phân mảnh DNA bằng sonication: Đặc biệt là khi các công nghệ giải trình tự đọc ngắn như Illumina, không thể đọc các mảnh DNA dài hơn dễ dàng, các vị thế DNA phải được phân mảnh đến một kích thước nhất định có thể đạt được một cách đáng tin cậy bằng siêu âm.
Siêu âm có thể được sử dụng đáng tin cậy cho dna, RNA và phân mảnh nhiễm sắc thể.
Phân mảnh DNA siêu âm hoạt động như thế nào?
Sonication, còn được gọi là xử lý mẫu âm thanh, là một phương pháp được sử dụng rộng rãi để phân mảnh DNA. Đối với cắt DNA siêu âm, các mẫu được tiếp xúc với sóng siêu âm trong điều kiện được kiểm soát. Nguyên tắc làm việc của sự phân mảnh DNA siêu âm dựa trên các rung động và cavitation được tạo ra bởi sóng siêu âm. Các lực cắt do sự cavitation siêu âm (âm thanh) phá vỡ các phân tử DNA có trọng lượng phân tử cao. Việc thiết lập sonication như cường độ (biên độ, thời gian), chế độ xung và nhiệt độ cho phép phân mảnh DNA chính xác đến một chiều dài mong muốn nhất định của các mảnh DNA. Trong khi DNA thường được giảm xuống còn 100 đến 600 bp bằng cách sử dụng siêu âm, các mảnh DNA dài hơn lên đến 1300 bp có thể thu được khi điều kiện siêu âm nhẹ hơn được áp dụng.
Cắt DNA siêu âm trong khi ChIP – Immunoprecipitation, Campuchia
Chuyển thể từ Jkwchui dưới CC-BY-SA.03
Kiểm soát nhiệt độ để ngăn ngừa suy thoái DNA
Hình dạng phân tử hai sợi của DNA rất nhạy cảm với nhiệt độ cao để kiểm soát chính xác nhiệt độ trong các bước chuẩn bị mẫu là một yếu tố quan trọng cho kết quả phân tích đáng tin cậy.
Cho dù bạn đang sử dụng bộ siêu âm đầu dò của Hielscher, VialTweeter hoặc UIP400MTP – giám sát và kiểm soát nhiệt độ liên tục được đảm bảo do cảm biến nhiệt độ có thể cắm và phần mềm thiết bị thông minh. Để duy trì nhiệt độ trong một phạm vi nhất định, bạn có thể đặt giới hạn nhiệt độ trên và dưới. Do đó, bộ siêu âm sẽ tạm dừng ngay khi giới hạn nhiệt độ này vượt quá và tự động sẽ tiếp tục sonicate khi nhiệt độ đã giảm xuống một tập hợp ∆T.
Phần mềm tinh vi của máy siêu âm Hielscher đảm bảo duy trì đáng tin cậy các điều kiện xử lý mẫu lý tưởng.
Phân mảnh DNA mẫu khối lượng với bộ siêu âm tấm đa giếng UIP400MTP
Số lượng mẫu trong khoa học đời sống đã tăng đáng kể trong thập kỷ qua. Điều này có nghĩa là số lượng mẫu rất cao (ví dụ: 384, 1536 hoặc 3456 giếng trên mỗi microplate) phải được xử lý trong quá trình chuẩn bị và phân tích mẫu trong điều kiện bình đẳng nhất quán để có được kết quả tương đương và hợp lệ. Với UIP400MTP, Siêu âm Hielscher đang theo xu hướng xử lý mẫu hàng loạt. UIP400MTP là một trình siêu âm để chuẩn bị mẫu bằng cách sử dụng các microplates. UIP400MTP có thể xử lý các tấm với 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 hoặc 3456 giếng. Tùy thuộc vào loại microplate, mỗi giếng thường có thể giữ thể tích mẫu từ hàng chục khe nano đến vài ml. Được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu khoa học đời sống, UIP400MTP rất phổ biến được sử dụng để chuẩn bị mẫu trước khi xét nghiệm như ELISA (xét nghiệm miễn dịch liên kết với enzyme) hoặc PCR, trước khi phân tích protein, cũng như để chuẩn bị nhiễm sắc thể trước CHiP và CHiP-seq, xác định sửa đổi histone và các phương pháp điều trị phân tích khác (ví dụ: điện di gel, quang phổ khối).
VialTweeter cho Praparation mẫu lên đến 10 Lọ
VialTweeter là một máy siêu âm phòng thí nghiệm được sử dụng rộng rãi VialTweeter cho phép sonication hiệu quả và thoải mái lên đến 10 lọ cùng một lúc. Vì các lọ và ống nghiệm (ví dụ: lọ Eppendorf, lọ cryo, ống ly tâm) được sonicated gián tiếp, bất kỳ ô nhiễm chéo nào cũng tránh được. Vì cùng một cường độ siêu âm được gửi đến mỗi mẫu, tất cả các kết quả sonication đều đồng nhất và có thể tái tạo. VialTweeter cung cấp tất cả các tính năng thông minh như các thiết bị kỹ thuật số khác của chúng tôi (ví dụ: menu thông minh, cài đặt lập trình, điều khiển nhiệt độ, điều khiển từ xa, v.v.) để đảm bảo sự thoải mái cao nhất cho người dùng.
Đầu dò đa ngón tay cho tấm Microwell
Có sẵn cho các bộ đồng nhất đầu dò siêu âm UP200Ht và UP200St, đầu dò nhiều ngón tay với 4 hoặc 8 ngón tay là một lựa chọn thoải mái để sonicate nhiều mẫu cùng một lúc trong cùng một điều kiện. Ví dụ, sonotrode MTP-24-8-96 là một đầu dò tám ngón tay, lý tưởng cho việc tích hợp vào các hệ thống tự động hoặc chuẩn bị mẫu thủ công hiệu quả của các giếng của các tấm đa giếng. Sonotrode nhiều ngón tay là lý tưởng cho tự động cho các phòng thí nghiệm, nơi chủ yếu là mỏ và ống nghiệm sử dụng sonotrode siêu âm tiêu chuẩn được xử lý. Các đầu dò đa ngón tay và tiêu chuẩn có thể nhanh chóng thay đổi trong vòng vài phút biến bộ siêu âm đầu dò đơn thành bộ phá vỡ siêu âm đa đầu dò.
Hielscher Ultrasonicators cho phân mảnh DNA
Siêu âm Hielscher cung cấp các nền tảng dựa trên siêu âm khác nhau cho DNA, RNA và phân mảnh nhiễm sắc thể. Các nền tảng khác nhau này bao gồm đầu dò siêu âm (sonotrodes), giải pháp sonication gián tiếp để chuẩn bị mẫu đồng thời của nhiều ống hoặc tấm đa giếng (ví dụ: tấm 96 giếng, tấm microtiter), sonoreactors và cuphorn siêu âm. Tất cả các nền tảng để cắt DNA được cung cấp bởi các bộ xử lý siêu âm hiệu suất cao, được điều chỉnh tần số, có thể kiểm soát chính xác và mang lại kết quả tái tạo.
Bộ xử lý siêu âm cho bất kỳ số mẫu và kích thước
Với máy siêu âm đa mẫu của Hielscher VialTweeter (cho tối đa 10 ống nghiệm) và UIP400MTP (đối với các tấm vi mô / đa tầng), có thể dễ dàng giảm thời gian xử lý mẫu do siêu âm cường độ cao và có thể kiểm soát chính xác trong khi có được sự phân bố và năng suất kích thước mảnh DNA mong muốn. Phân mảnh DNA siêu âm làm cho việc chuẩn bị mẫu hiệu quả, đáng tin cậy và có thể mở rộng. Các giao thức có thể được thu nhỏ tuyến tính từ một đến nhiều mẫu bằng cách áp dụng siêu âm được kiểm soát liên tục.
Máy siêu âm đầu dò với một đến năm ngón tay là lý tưởng cho việc chuẩn bị số mẫu nhỏ hơn. Máy siêu âm phòng thí nghiệm của Hielscher có sẵn ở các kích cỡ khác nhau để chúng tôi có thể giới thiệu cho bạn thiết bị lý tưởng cho ứng dụng và yêu cầu của bạn.
kiểm soát quy trình chính xác
Các thiết lập sonication có thể kiểm soát chính xác là rất quan trọng vì sonification toàn diện có thể phá hủy DNA, RNA và nhiễm sắc thể, nhưng cắt siêu âm không đầy đủ dẫn đến các mảnh DNA và nhiễm sắc thể quá dài. Máy siêu âm kỹ thuật số của Hielscher có thể dễ dàng được thiết lập thành thông số sonication chính xác. Cài đặt sonication cụ thể cũng có thể được lưu dưới dạng cài đặt được lập trình để lặp lại nhanh chóng cùng một quy trình.
Tất cả sonication được tự động giao thức và lưu trữ dưới dạng tệp CSV trên thẻ SD tích hợp. Điều này cho phép tài liệu chính xác về các thử nghiệm được thực hiện và giúp có thể sửa đổi âm thanh chạy dễ dàng.
Thông qua điều khiển từ xa trình duyệt, tất cả các máy siêu âm kỹ thuật số có thể được vận hành và giám sát thông qua bất kỳ trình duyệt tiêu chuẩn nào. Cài đặt phần mềm bổ sung là không cần thiết, vì kết nối LAN cho phép thiết lập plug-n-play rất đơn giản.
Sự thân thiện với người dùng cao nhất trong chuẩn bị mẫu siêu âm
Tất cả các máy siêu âm Hielscher được thiết kế để cung cấp siêu âm hiệu suất cao, đồng thời luôn rất thân thiện với người dùng và dễ vận hành. Tất cả các cài đặt đều có cấu trúc tốt trong một menu rõ ràng, có thể dễ dàng truy cập thông qua màn hình cảm ứng màu hoặc điều khiển từ xa trình duyệt. Phần mềm thông minh với cài đặt có thể lập trình và ghi dữ liệu tự động đảm bảo cài đặt sonication tối ưu cho kết quả đáng tin cậy và có thể tái tạo. Giao diện menu sạch sẽ và dễ sử dụng biến máy siêu âm Hielscher thành các thiết bị thân thiện và hiệu quả với người dùng.
Bảng dưới đây cung cấp cho bạn một dấu hiệu về khả năng xử lý gần đúng của các máy siêu âm phòng thí nghiệm của chúng tôi, lý tưởng cho các nhiệm vụ chuẩn bị mẫu như phân mảnh DNA và RNA, phân tích tế bào cũng như chiết xuất protein:
| Thiết bị | Công suất [W] | Loại | Khối lượng [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP (UIP400MTP) | 400 | đối với microplates | 6 – 3456 giếng | VialTweeter | 200 | cho tối đa 10 lọ cộng với khả năng kẹp | 0.5 – 1,5 |
| UP50H | 50 | Đầu dò loại | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | Đầu dò loại | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | Đầu dò loại | 0.1 – 1000 |
| UP200ST | 200 | Đầu dò loại | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | Đầu dò loại | 5,0 – 2000 |
| Cuphorn | 200 | CupHorn, sonoreactor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | tế bào dòng chảy nhiễm bẩn |
Liên hệ chúng tôi! / Hỏi chúng tôi!
Đơn vị chuẩn bị đa mẫu siêu âm VialTweeter cho phép sonication đồng thời lên đến 10 lọ. Với thiết bị kẹp vialPress, lên đến 4 ống bổ sung có thể được ép lên phía trước cho sonication dữ dội.
Sonotrode MTP-24-8-96 có tám đầu dò siêu âm cho sonication của các giếng của tấm microtiter.
Văn học/tài liệu tham khảo
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Sự kiện đáng biết
Giải trình tự thế hệ tiếp theo là gì?
Giải trình tự thế hệ tiếp theo, cũng là Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS), giải trình tự thông lượng cao hoặc giải trình tự thế hệ thứ hai, đề cập đến cách tiếp cận giải trình tự song song lớn, trong đó lượng DNA rất lớn (khổng lồ) của hàng triệu mảnh được giải trình tự đồng thời song song mỗi lần chạy.
Để thực hiện giải trình tự thế hệ tiếp theo, ba bước cơ bản của (1) chuẩn bị thư viện, (2) giải trình tự và (3) phân tích dữ liệu phải được thực hiện. Trong quá trình chuẩn bị thư viện, các sợi DNA phải được phân mảnh thành các mảnh DNA có độ dài nhất định. Sonication là một trong những kỹ thuật ưa thích để phân mảnh DNA.
Trong quá trình giải trình tự DNA, thứ tự nucleotide trong DNA – Được gọi là trình tự axit nucleic - được xác định. Trình tự axit nucleic được tạo thành từ bốn bazơ nucleotide - adenine, cytosine, guanine, thymine – mã nào cho thông tin.
Giải trình tự thế hệ tiếp theo đang thúc đẩy nghiên cứu về khoa học đời sống và y học cá nhân hóa vì giải trình tự DNA và RNA được sử dụng nhiều trong nghiên cứu di truyền, nghiên cứu ung thư, nghiên cứu các bệnh hiếm gặp và phức tạp, nghiên cứu vi sinh vật, agrigenomics và nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác.
Giải trình tự thế hệ tiếp theo vs Giải trình tự Sanger
Trong khi với giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS), có thể giải trình tự số lượng lớn các mẫu gen, Giải trình tự Sanger (còn được gọi là phương pháp chấm dứt chuỗi hoặc Giải trình tự thế hệ đầu tiên) chỉ có khả năng giải trình tự số mẫu nhỏ. Giải trình tự Sanger chỉ giải trình tự một đoạn DNA tại một thời điểm và có thể được thực hiện trong một ngày. Do sự thích nghi của nó, trình tự Sanger cũng được coi là công nghệ tiêu chuẩn vàng, được sử dụng để xác minh kết quả thu được từ trình tự thế hệ tiếp theo.
Giải trình tự Sanger đạt được độ dài đọc khoảng 800bp (thường là 500-600bp với DNA không làm giàu). Độ dài đọc dài hơn trong giải trình tự Sanger cho thấy những lợi thế đáng kể so với các phương pháp giải trình tự khác đặc biệt là về trình tự các vùng lặp đi lặp lại của bộ gen. Một thách thức của dữ liệu trình tự đọc ngắn đặc biệt là một vấn đề trong việc giải trình tự các bộ gen mới (de novo) và trong việc giải trình tự các phân đoạn bộ gen được sắp xếp lại cao, thường là những phân đoạn được nhìn thấy của bộ gen ung thư hoặc ở các vùng nhiễm sắc thể thể hiện sự biến đổi cấu trúc. [cp. Morozova và Marra, 2008]
Hielscher Ultrasonics sản xuất homogenizers siêu âm hiệu suất cao từ Phòng thí nghiệm đến kích thước công nghiệp.