Ly giải tế bào của tế bào BL21 bằng siêu âm
Tế bào BL21 là một chủng E. coli được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu, công nghệ sinh học và sản xuất công nghiệp do khả năng biểu hiện protein hiệu quả cao. Phá vỡ tế bào siêu âm, ly giải và khai thác protein là phương pháp phổ biến để cô lập và thu thập các protein mục tiêu từ bên trong tế bào của tế bào BL21. Ultrasonication phá vỡ các tế bào hoàn toàn và giải phóng tất cả các protein bị mắc kẹt, làm cho 100% protein có sẵn.
Tế bào BL21 để biểu hiện protein
Tế bào BL21 là một chủng vi khuẩn E. coli có thẩm quyền hóa học thích hợp cho sự biến đổi và biểu hiện protein mức độ cao bằng cách sử dụng hệ thống cảm ứng T7 RNA polymerase-IPTG. Các tế bào BL21 cho phép biểu hiện protein hiệu quả cao của bất kỳ gen nào nằm dưới sự kiểm soát của chất xúc tiến T7. Chủng E. coli BL21 (DE3) là một chủng sản xuất protein dựa trên polymerase RNA T7 kết hợp với các vectơ biểu hiện dựa trên chất xúc tiến T7 và được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm và công nghiệp để sản xuất protein tái tổ hợp. Trong BL21 (DE3), sự biểu hiện của gen mã hóa protein tái tổ hợp được phiên mã bởi T7 RNA polymerase (T7 RNAP) được mã hóa nhiễm sắc thể, phiên mã nhanh hơn tám lần so với RNAP E. coli thông thường. Điều này làm cho chủng BL21 (DE3) có hiệu quả cao và biến nó thành một trong những hệ thống tế bào biểu hiện protein được ưa thích nhất.
Giao thức ly giải siêu âm và khai thác protein từ tế bào BL21
Ly giải tế bào của các tế bào BL21 chủ yếu được thực hiện bằng cách sử dụng ultrasonication kết hợp với natri lauroyl sarcosinate (còn được gọi là sarkosyl) như bộ đệm ly giải. Những lợi thế của sự gián đoạn tế bào siêu âm và khai thác protein nằm ở độ tin cậy, khả năng tái sản xuất cũng như hoạt động đơn giản, an toàn và nhanh chóng của ultrasonicators. Giao thức dưới đây đưa ra hướng từng bước để ly giải tế bào BL21 siêu âm:
- Để loại bỏ các protein chaperone, các viên vi khuẩn BL21 đã được lơ lửng trong 50 ml dung dịch đệm Natri Tris-EDTA (STE) lạnh (bao gồm 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl bổ sung 100 mM PMSF).
- Các, 500 ul lysozyme (10 mg / ml) được thêm vào và các tế bào được ủ trên băng trong 15 phút.
- Sau đó, 500 ul DTT và 7 ml sarkosyl (10% (w / v) được tạo thành trong dung dịch đệm STE) được thêm vào.
- Điều cần thiết là phải giữ cho tất cả các bộ đệm lọc lạnh và duy trì các mẫu trên đá mọi lúc. Tất cả các bước thanh lọc nên được thực hiện trong phòng lạnh nếu có thể.
- Đối với ly giải siêu âm và khai thác protein, các mẫu được sonicated trong VialTweeter MultiSample Ultrasonicator trong 4 x 30 giây ở biên độ 100% với khoảng thời gian 2 phút giữa mỗi sonication. Ngoài ra, một homogenizer siêu âm loại thăm dò với micro-tip ví dụ, UP200Ht với S26d2 (3 x 30 giây, 2 phút tạm dừng giữa các chu kỳ siêu âm, biên độ 80%) có thể được sử dụng.
- Đối với các bước tinh chế tiếp theo, các mẫu phải được giữ trên đá hoặc được bảo quản ở -80 ° C cho đến khi xử lý tiếp.
Siêu âm tế bào phá vỡ UP200St với đầu micro-tip S26d2 để ly giải và chiết xuất protein
Ly giải siêu âm dưới sự kiểm soát nhiệt độ Prescise
Việc kiểm soát nhiệt độ chính xác và đáng tin cậy là rất quan trọng khi xử lý các mẫu sinh học. Nhiệt độ cao bắt đầu sự thoái hóa protein do nhiệt trong các mẫu.
Như tất cả các kỹ thuật chuẩn bị mẫu cơ học, sonication tạo ra nhiệt. Tuy nhiên, nhiệt độ của các mẫu có thể được kiểm soát tốt khi sử dụng VialTweeter. Chúng tôi cung cấp cho bạn các tùy chọn khác nhau để theo dõi và kiểm soát nhiệt độ của các mẫu của bạn trong khi chuẩn bị chúng với VialTweeter và VialPress để phân tích.
- Theo dõi nhiệt độ mẫu: Bộ xử lý siêu âm UP200St, điều khiển VialTweeter, được trang bị phần mềm thông minh và cảm biến nhiệt độ có thể cắm được. Cắm cảm biến nhiệt độ vào UP200St và lắp đầu của cảm biến nhiệt độ vào một trong các ống mẫu. Thông qua màn hình cảm ứng màu kỹ thuật số, bạn có thể đặt trong menu của UP200St một phạm vi nhiệt độ cụ thể cho sonication mẫu của bạn. Ultrasonicator sẽ tự động dừng khi đạt đến nhiệt độ tối đa và tạm dừng cho đến khi nhiệt độ mẫu giảm xuống giá trị thấp hơn của ∆ nhiệt độ cài đặt. Sau đó, sonication bắt đầu tự động một lần nữa. Tính năng thông minh này ngăn chặn sự xuống cấp do nhiệt.
- Khối VialTweeter có thể được làm mát trước. Đặt khối VialTweeter (chỉ sonotrode mà không có đầu dò!) vào tủ lạnh hoặc tủ đông để làm mát trước khối titan giúp trì hoãn sự gia tăng nhiệt độ trong mẫu. Nếu có thể, bản thân mẫu cũng có thể được làm lạnh trước.
- Sử dụng đá khô để làm mát trong quá trình sonication. Sử dụng một khay nông chứa đầy đá khô và đặt VialTweeter lên đá để nhiệt có thể nhanh chóng tiêu tan.
Khách hàng trên toàn thế giới sử dụng VialTweeter và VialPress cho công việc chuẩn bị mẫu hàng ngày của họ trong các phòng thí nghiệm sinh học, sinh hóa, y tế và lâm sàng. Phần mềm thông minh và kiểm soát nhiệt độ của bộ xử lý UP200St, nhiệt độ được kiểm soát đáng tin cậy và tránh suy thoái mẫu do nhiệt. Chuẩn bị mẫu siêu âm với VialTweeter và VialPress mang lại kết quả có độ tin cậy cao và tái tạo!
Tìm bộ phá vỡ siêu âm tối ưu cho ứng dụng ly giải của bạn
Hielscher Ultrasonics là nhà sản xuất lâu năm có kinh nghiệm của hiệu suất cao tế bào siêu âm phá vỡ và homogenizers cho các phòng thí nghiệm, băng ghế dự bị và hệ thống quy mô công nghiệp. Kích thước nuôi cấy tế bào vi khuẩn của bạn, mục tiêu nghiên cứu hoặc sản xuất của bạn và khối lượng tế bào để xử lý mỗi giờ hoặc ngày là những yếu tố cần thiết để tìm ra chất phá vỡ tế bào siêu âm phù hợp cho ứng dụng của bạn.
Hielscher Ultrasonics cung cấp các giải pháp khác nhau cho sonication đồng thời của đa mẫu (lên đến 10 lọ với VialTweeter) và mẫu khối lượng (tức là, tấm microtiter / tấm ELISA với UIP400MTP), cũng như ultrasonicator phòng thí nghiệm loại thăm dò cổ điển với mức công suất khác nhau từ 50 đến 400 watt để bộ vi xử lý siêu âm công nghiệp đầy đủ với lên đến 16.000watts mỗi đơn vị cho sự gián đoạn tế bào thương mại và khai thác protein trong sản xuất lớn. Tất cả các ultrasonicators Hielscher được xây dựng cho hoạt động 24/7/365 dưới tải đầy đủ. Mạnh mẽ và đáng tin cậy là các tính năng cốt lõi của các thiết bị siêu âm của chúng tôi.
Tất cả các homogenizers siêu âm kỹ thuật số được trang bị phần mềm thông minh, màn hình cảm ứng màu và giao thức dữ liệu tự động, mà làm cho các thiết bị siêu âm thành một công cụ làm việc thuận tiện trong phòng thí nghiệm và các cơ sở sản xuất.
Hãy cho chúng tôi biết, loại tế bào nào, thể tích nào, tần suất nào và với mục tiêu nào bạn phải xử lý các mẫu sinh học của mình. Chúng tôi sẽ giới thiệu cho bạn chất phá vỡ tế bào siêu âm phù hợp nhất cho các yêu cầu quá trình của bạn.
Bảng dưới đây cung cấp cho bạn một dấu hiệu về khả năng xử lý gần đúng của các hệ thống siêu âm của chúng tôi từ homogenizers cầm tay nhỏ gọn và MultiSample Ultrasonicators để bộ vi xử lý siêu âm công nghiệp cho các ứng dụng thương mại:
| Khối lượng hàng loạt | Tốc độ dòng chảy | Thiết bị được đề xuất |
|---|---|---|
| Tấm 96 giếng / microtiter | N.A. | UIP400MTP |
| 10 lọ à 0,5 đến 1,5mL | N.A. | VialTweeter tại UP200St |
| 0.01 đến 250mL | 5 đến 100ml / phút | UP50H |
| 0.01 đến 500mL | 10 đến 200ml / phút | UP100H |
| 10 đến 2000mL | 20 đến 400ml / phút | UP200Ht, UP400ST |
| 0.1 đến 20L | 0.2 đến 4L / phút | UIP2000hdT |
| 10 đến 100L | 2 đến 10L / phút | UIP4000hdt |
| N.A. | 10 đến 100L / phút | UIP16000 |
| N.A. | Lớn | Cụm UIP16000 |
Liên hệ với chúng tôi! / Hãy hỏi chúng tôi!
UIP400MTP tấm sonicator cho sự gián đoạn tế bào thông lượng cao trong các tấm 96 giếng
Siêu âm UP200Ht với 2mm microtip S26d2 cho sonication của các mẫu nhỏ
Đọc thêm về cách bạn có thể sử dụng máy đồng nhất mô siêu âm của bạn để chuẩn bị hiệu quả và đáng tin cậy các giải pháp đệm!
Sự thật đáng biết
Vi khuẩn Escherichia Coli
Escherichia coli là một loại vi khuẩn, không hình thành bào tử, Gram âm và được đặc trưng bởi dạng que thẳng. Vi khuẩn E.coli có trong môi trường, thực phẩm và ruột của người và động vật. E. coli thường di chuyển bằng cách sử dụng peritrichous Flagella, nhưng cũng có những loại không di động. E.coli được gọi là sinh vật chemoorganotroph kỵ khí, có nghĩa là chúng có khả năng chuyển hóa cả hô hấp và lên men. Hầu hết các loại E.coli đều lành tính và đáp ứng các chức năng hữu ích trong cơ thể, ví dụ như ngăn chặn sự phát triển của các loài vi khuẩn có hại, tổng hợp vitamin, v.v.
Tế bào vi khuẩn Escherichia coli thuộc loại B được gọi là loại B là một loại chủng E.coli đặc biệt, được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu để điều tra các cơ chế như độ nhạy cảm của vi khuẩn hoặc hệ thống sửa đổi hạn chế. Hơn nữa, vi khuẩn E.coli được đánh giá là công cụ đáng tin cậy để biểu hiện protein trong các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và khoa học đời sống. Ví dụ, E.coli được sử dụng để tổng hợp các hợp chất như protein và oligosacarit ở quy mô công nghiệp. Do các đặc điểm cụ thể như thiếu protease, sản xuất axetat thấp ở mức glucose cao và tăng cường tính thấm, tế bào B E. coli được sử dụng thường xuyên nhất để sản xuất protein biến đổi gen.
Protein tái tổ hợp
Protein tái tổ hợp (rProt) đang đạt được tầm quan trọng đáng kể trong các ngành đa dạng, bao gồm trong sản xuất hóa chất, dược phẩm, mỹ phẩm, y học người và động vật, nông nghiệp, thực phẩm cũng như các ngành công nghiệp xử lý chất thải.
Việc sản xuất protein tái tổ hợp đòi hỏi phải sử dụng một hệ thống biểu hiện. Khi biểu hiện hệ thống tế bào để sản xuất DNA tái tổ hợp, cả tế bào nhân sơ và tế bào nhân chuẩn đều có thể được sử dụng. Trong khi tế bào vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất để biểu hiện protein do các yếu tố như chi phí thấp, khả năng mở rộng dễ dàng và điều kiện môi trường đơn giản, động vật có vú, nấm men, tảo, côn trùng và hệ thống không có tế bào được thiết lập thay thế. Loại protein, hoạt động chức năng, cũng như năng suất cần thiết của protein biểu hiện ảnh hưởng đến việc lựa chọn hệ thống tế bào được sử dụng để biểu hiện protein.
Để biểu hiện protein tái tổ hợp, một tế bào cụ thể phải được truyền một vectơ DNA có chứa mẫu DNA tái tổ hợp. Các tế bào được truyền với mẫu sau đó được nuôi cấy. Do cơ chế tế bào, các tế bào phiên mã và dịch protein quan tâm, do đó tạo ra protein được nhắm mục tiêu.
Khi các protein biểu hiện bị mắc kẹt trong ma trận tế bào, tế bào phải được ly giải (bị gián đoạn và phá vỡ) để giải phóng các protein. Trong bước tinh chế tiếp theo, protein được tách ra và tinh chế.
Protein tái tổ hợp đầu tiên được sử dụng trong điều trị là insulin tái tổ hợp ở người vào năm 1982. Ngày nay, hơn 170 loại protein tái tổ hợp được sản xuất trên toàn thế giới để điều trị y tế. Các protein tái tổ hợp thường được sử dụng trong y học là ví dụ như hormone tái tổ hợp, interferon, interleukin, yếu tố tăng trưởng, yếu tố hoại tử khối u, yếu tố đông máu, thuốc tiêu huyết khối và enzyme để điều trị các bệnh chính như tiểu đường, lùn, nhồi máu cơ tim, suy tim sung huyết, apoplexy não, đa xơ cứng, giảm bạch cầu trung tính, giảm tiểu cầu, thiếu máu, viêm gan, viêm khớp dạng thấp, hen suyễn, bệnh Crohn và các liệu pháp điều trị ung thư. (xem Phúc V. Phạm, trong Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Văn học / Tài liệu tham khảo
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonicator cho sonication đồng thời của 10 mẫu, ví dụ để phá vỡ các tế bào BL21
Siêu âm hiệu suất cao! Phạm vi sản phẩm của Hielscher bao gồm toàn bộ quang phổ từ ultrasonicator phòng thí nghiệm nhỏ gọn trên các đơn vị băng ghế dự bị đến các hệ thống siêu âm công nghiệp đầy đủ.