Ly giải tế bào BL21 bằng siêu âm
Tế bào BL21 thuộc một chủng E. coli được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu, công nghệ sinh học và sản xuất công nghiệp nhờ khả năng biểu hiện protein với hiệu suất cao. Phá vỡ tế bào, ly giải và chiết xuất protein bằng siêu âm là phương pháp phổ biến để phân lập và thu nhận các protein mục tiêu từ bên trong tế bào BL21. Siêu âm phá vỡ hoàn toàn tế bào và giải phóng toàn bộ protein bị giữ bên trong, giúp thu nhận được 100% lượng protein.
Tế bào BL21 dùng để biểu hiện protein
BL21 là một chủng vi khuẩn E. coli có khả năng tiếp nhận DNA nhờ xử lý hóa học, thích hợp cho biến nạp và biểu hiện protein ở mức cao bằng hệ thống cảm ứng T7 RNA polymerase-IPTG. Tế bào BL21 cho phép biểu hiện protein với hiệu suất cao từ bất kỳ gen nào chịu sự kiểm soát của promoter T7. Chủng E. coli BL21(DE3) là chủng sản xuất protein dựa trên T7 RNA polymerase, được kết hợp với các vector biểu hiện dựa trên promoter T7 và được ứng dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm và công nghiệp để sản xuất protein tái tổ hợp. Trong BL21(DE3), gen mã hóa protein tái tổ hợp được phiên mã bởi T7 RNA polymerase (T7 RNAP) được mã hóa trên nhiễm sắc thể; enzyme này phiên mã nhanh gấp tám lần RNAP thông thường của E. coli. Điều này giúp chủng BL21(DE3) đạt hiệu suất cao và trở thành một trong những hệ thống tế bào biểu hiện protein được ưa chuộng nhất.
Quy trình ly giải và chiết xuất protein từ tế bào BL21 bằng siêu âm
Việc ly giải tế bào BL21 chủ yếu được thực hiện bằng siêu âm kết hợp với natri lauroyl sarcosinate (còn gọi là sarkosyl) làm đệm ly giải. Ưu điểm của việc phá vỡ tế bào và chiết xuất protein bằng siêu âm nằm ở độ tin cậy, khả năng tái lập kết quả cũng như việc vận hành thiết bị siêu âm đơn giản, an toàn và nhanh chóng. Quy trình dưới đây hướng dẫn từng bước ly giải tế bào BL21 bằng siêu âm:
- Để loại bỏ các protein chaperone, cặn tế bào vi khuẩn BL21 được huyền phù lại trong 50 ml đệm natri Tris-EDTA (STE) lạnh như nước đá (gồm 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, bổ sung 100 mM PMSF).
- Sau đó, thêm 500 ul lysozyme (10 mg/ ml) và ủ tế bào trên đá trong 15 min.
- Tiếp theo, thêm 500 ul DTT và 7 ml sarkosyl (10% (w/v) được pha trong đệm STE).
- Điều thiết yếu là giữ tất cả các dung dịch đệm tinh sạch lạnh như nước đá và luôn giữ mẫu trên đá. Nếu có thể, tất cả các bước tinh sạch nên được thực hiện trong phòng lạnh.
- Để ly giải và chiết xuất protein bằng siêu âm, các mẫu được xử lý bằng siêu âm trong thiết bị VialTweeter MultiSample Ultrasonicator trong 4 x 30 sec ở biên độ 100%, với khoảng nghỉ 2 min giữa mỗi lần xử lý siêu âm. Ngoài ra, có thể sử dụng máy đồng nhất siêu âm dạng đầu dò có đầu tip siêu nhỏ, ví dụ UP200Ht với S26d2 (3 x 30 sec, nghỉ 2 min. giữa các chu kỳ siêu âm, biên độ 80%).
- Đối với các bước tinh sạch tiếp theo, mẫu phải được giữ trên đá hoặc bảo quản ở -80°C cho đến khi xử lý tiếp.
Thiết bị phá vỡ tế bào bằng siêu âm UP200St với đầu tip siêu nhỏ S26d2 để ly giải và chiết xuất protein
Ly giải bằng siêu âm với khả năng kiểm soát nhiệt độ chính xác
Việc kiểm soát nhiệt độ chính xác và đáng tin cậy có vai trò then chốt khi xử lý mẫu sinh học. Nhiệt độ cao khởi phát sự phân hủy protein do nhiệt trong mẫu.
Giống như mọi kỹ thuật chuẩn bị mẫu bằng cơ học, xử lý siêu âm sinh ra nhiệt. Tuy nhiên, nhiệt độ mẫu có thể được kiểm soát tốt khi sử dụng VialTweeter. Chúng tôi giới thiệu nhiều phương án để theo dõi và kiểm soát nhiệt độ mẫu trong khi chuẩn bị mẫu bằng VialTweeter và VialPress để phân tích.
- Theo dõi nhiệt độ mẫu: Bộ xử lý siêu âm UP200St, dùng để vận hành VialTweeter, được trang bị phần mềm thông minh và cảm biến nhiệt độ có thể cắm nối. Cắm cảm biến nhiệt độ vào UP200St và đưa đầu cảm biến nhiệt độ vào một trong các ống mẫu. Thông qua màn hình cảm ứng màu kỹ thuật số, bạn có thể thiết lập một khoảng nhiệt độ cụ thể cho quá trình xử lý mẫu bằng siêu âm trong menu của UP200St. Máy siêu âm sẽ tự động dừng khi đạt nhiệt độ tối đa và tạm ngừng cho đến khi nhiệt độ mẫu giảm xuống giá trị thấp hơn của khoảng nhiệt độ ∆ đã thiết lập. Sau đó, quá trình xử lý bằng siêu âm tự động bắt đầu trở lại. Tính năng thông minh này ngăn ngừa sự phân hủy do nhiệt.
- Khối VialTweeter có thể được làm lạnh trước. Đặt khối VialTweeter (chỉ đầu truyền siêu âm, không có bộ chuyển đổi!) vào tủ lạnh hoặc tủ đông để làm lạnh trước khối titan, giúp làm chậm sự tăng nhiệt độ trong mẫu. Nếu có thể, bản thân mẫu cũng có thể được làm lạnh trước.
- Sử dụng đá khô để làm mát trong quá trình xử lý bằng siêu âm. Dùng một khay nông chứa đầy đá khô và đặt VialTweeter lên đá để nhiệt có thể tản nhanh.
Khách hàng trên toàn thế giới sử dụng VialTweeter và VialPress cho công việc chuẩn bị mẫu hằng ngày trong các phòng thí nghiệm sinh học, hóa sinh, y học và lâm sàng. Nhờ phần mềm thông minh và chức năng kiểm soát nhiệt độ của bộ xử lý UP200St, nhiệt độ được kiểm soát đáng tin cậy và tránh được sự phân hủy mẫu do nhiệt. Chuẩn bị mẫu bằng siêu âm với VialTweeter và VialPress mang lại kết quả có độ tin cậy và khả năng tái lập cao!
Tìm máy phá vỡ tế bào bằng siêu âm tối ưu cho ứng dụng ly giải của bạn
Hielscher Ultrasonics là nhà sản xuất có kinh nghiệm lâu năm về máy phá vỡ tế bào và máy đồng nhất hóa bằng siêu âm hiệu suất cao cho các phòng thí nghiệm, hệ thống quy mô để bàn và quy mô công nghiệp. Quy mô nuôi cấy tế bào vi khuẩn, mục tiêu nghiên cứu hoặc sản xuất và thể tích tế bào cần xử lý mỗi giờ hoặc mỗi ngày là những yếu tố thiết yếu để tìm máy phá vỡ tế bào bằng siêu âm phù hợp cho ứng dụng của bạn.
Hielscher Ultrasonics cung cấp nhiều giải pháp để xử lý đồng thời nhiều mẫu bằng siêu âm (tối đa 10 lọ với VialTweeter) và xử lý hàng loạt mẫu (tức là đĩa vi chuẩn độ / đĩa ELISA với UIP400MTP), cũng như máy siêu âm phòng thí nghiệm dạng đầu dò truyền thống với các mức công suất khác nhau từ 50 đến 400 oát cho đến các bộ xử lý siêu âm hoàn toàn ở quy mô công nghiệp với công suất lên đến 16.000 oát mỗi thiết bị để phá vỡ tế bào và chiết xuất protein cho mục đích thương mại trong sản xuất quy mô lớn. Tất cả các máy siêu âm Hielscher đều được chế tạo để vận hành 24/7/365 ở mức tải tối đa. Độ bền và độ tin cậy là những đặc tính cốt lõi của các thiết bị siêu âm của chúng tôi.
Tất cả các máy đồng nhất hóa bằng siêu âm kỹ thuật số đều được trang bị phần mềm thông minh, màn hình cảm ứng màu và chức năng tự động ghi dữ liệu, giúp thiết bị siêu âm trở thành công cụ làm việc tiện lợi trong phòng thí nghiệm và cơ sở sản xuất.
Hãy cho chúng tôi biết bạn cần xử lý loại tế bào nào, với thể tích bao nhiêu, tần suất như thế nào và nhằm mục tiêu gì khi xử lý các mẫu sinh học. Chúng tôi sẽ đề xuất máy phá vỡ tế bào bằng siêu âm phù hợp nhất với các yêu cầu quy trình của bạn.
Bảng dưới đây cho biết năng lực xử lý gần đúng của các hệ thống siêu âm của chúng tôi, từ máy đồng nhất hóa cầm tay nhỏ gọn và máy siêu âm đa mẫu đến các bộ xử lý siêu âm công nghiệp cho các ứng dụng thương mại:
| Thể tích mẻ | Lưu lượng | Thiết bị được khuyến nghị |
|---|---|---|
| Đĩa 96 giếng / đĩa vi chuẩn độ | n.a. | UIP400MTP |
| 10 lọ, mỗi lọ từ 0,5 đến 1,5mL | n.a. | VialTweeter trên UP200St |
| 0,01 đến 250mL | 5 đến 100mL/min | UP50H |
| 0,01 đến 500mL | 10 đến 200mL/min | UP100H |
| 10 đến 2000mL | 20 đến 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 đến 20L | 0,2 đến 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 đến 100L | 2 đến 10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 đến 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | lớn hơn | cụm thiết bị UIP16000 |
Liên hệ với chúng tôi! / Hãy hỏi chúng tôi!
Máy siêu âm dạng đĩa UIP400MTP để phá vỡ tế bào với năng suất xử lý mẫu cao trong đĩa 96 giếng
Máy siêu âm UP200Ht với đầu dò vi mô S26d2 kích thước 2mm để xử lý các mẫu nhỏ bằng siêu âm
Tìm hiểu thêm về cách bạn có thể sử dụng máy đồng nhất hóa mô bằng siêu âm để chuẩn bị dung dịch đệm hiệu quả và đáng tin cậy!
Những điều cần biết
Vi khuẩn Escherichia coli
Escherichia coli là một loại vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử và có hình que thẳng đặc trưng. Vi khuẩn E.coli có mặt trong môi trường, thực phẩm và đường ruột của người và động vật. E. coli thường di chuyển nhờ các roi phân bố quanh tế bào, nhưng cũng có những loại không di động. E.coli là các sinh vật hóa dị dưỡng hữu cơ kỵ khí tùy nghi, nghĩa là chúng có khả năng chuyển hóa bằng cả hô hấp và lên men. Hầu hết các loại E.coli đều lành tính và thực hiện các chức năng hữu ích trong cơ thể, ví dụ như ức chế sự phát triển của các loài vi khuẩn có hại, tổng hợp vitamin, v.v.
Các tế bào vi khuẩn Escherichia coli thuộc loại B là một nhóm chủng E.coli đặc biệt, được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu để tìm hiểu các cơ chế như tính nhạy cảm với thực khuẩn thể hoặc các hệ thống hạn chế–biến đổi. Hơn nữa, vi khuẩn E.coli được đánh giá cao như một công cụ đáng tin cậy để biểu hiện protein trong các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và khoa học sự sống. Ví dụ, E.coli được sử dụng để tổng hợp các hợp chất như protein và oligosaccharide ở quy mô công nghiệp. Nhờ các đặc điểm riêng như thiếu hụt protease, tạo ít acetate ở nồng độ glucose cao và tính thấm tăng cường, tế bào E. coli B là các tế bào chủ được sử dụng thường xuyên nhất để sản xuất protein được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền.
Protein tái tổ hợp
Protein tái tổ hợp (rProt) ngày càng có vai trò quan trọng trong nhiều ngành, bao gồm sản xuất hóa chất, dược phẩm, mỹ phẩm, y học và thú y, nông nghiệp, thực phẩm cũng như xử lý chất thải.
Việc sản xuất protein tái tổ hợp đòi hỏi phải sử dụng một hệ thống biểu hiện. Cả tế bào nhân sơ và tế bào nhân thực đều có thể được sử dụng làm hệ thống tế bào biểu hiện để sản xuất DNA tái tổ hợp. Trong khi tế bào vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất để biểu hiện protein nhờ các yếu tố như chi phí thấp, dễ mở rộng quy mô và điều kiện môi trường nuôi cấy đơn giản, các hệ thống tế bào động vật có vú, nấm men, tảo, côn trùng và hệ thống không tế bào là những lựa chọn thay thế đã được thiết lập. Loại protein, hoạt tính chức năng cũng như sản lượng protein biểu hiện cần đạt ảnh hưởng đến việc lựa chọn hệ thống tế bào dùng để biểu hiện protein.
Để biểu hiện protein tái tổ hợp, một tế bào cụ thể phải được chuyển nạp một vector DNA chứa khuôn DNA tái tổ hợp. Sau đó, các tế bào được chuyển nạp khuôn này sẽ được nuôi cấy. Nhờ cơ chế của tế bào, các tế bào phiên mã và dịch mã protein quan tâm, qua đó tạo ra protein mục tiêu.
Do các protein được biểu hiện bị giữ trong chất nền tế bào, tế bào phải được ly giải (phá vỡ và làm vỡ) để giải phóng protein. Trong bước tinh sạch tiếp theo, protein được tách và tinh sạch.
Protein tái tổ hợp đầu tiên được sử dụng trong điều trị là insulin người tái tổ hợp vào năm 1982. Ngày nay, hơn 170 loại protein tái tổ hợp được sản xuất trên toàn thế giới để điều trị y khoa. Các protein tái tổ hợp thường được sử dụng trong y học bao gồm, ví dụ, hormone tái tổ hợp, interferon, interleukin, yếu tố tăng trưởng, yếu tố hoại tử khối u, yếu tố đông máu, thuốc tiêu huyết khối và enzyme để điều trị các bệnh nghiêm trọng như đái tháo đường, chứng lùn, nhồi máu cơ tim, suy tim sung huyết, đột quỵ não, đa xơ cứng, giảm bạch cầu trung tính, giảm tiểu cầu, thiếu máu, viêm gan, viêm khớp dạng thấp, hen suyễn, bệnh Crohn và trong các liệu pháp điều trị ung thư. (xem Phuc V. Pham, trong Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Tài liệu / Tài liệu tham khảo
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Thiết bị siêu âm VialTweeter để xử lý siêu âm đồng thời 10 mẫu, ví dụ để phá vỡ tế bào BL21
Công nghệ siêu âm hiệu suất cao! Danh mục sản phẩm của Hielscher bao quát toàn bộ các quy mô, từ thiết bị siêu âm phòng thí nghiệm nhỏ gọn, qua các thiết bị để bàn đến các hệ thống siêu âm quy mô công nghiệp hoàn chỉnh.