Giao thức bất hoạt SARS-CoV-2 Coronavirus với Sonication

Hielscher VialTweeter là một đơn vị chuẩn bị đa mẫu siêu âm độc đáo, được sử dụng để bất hoạt coronavirus SARS-COV-2. VialTweeter cho phép chuẩn bị tối đa 10 lọ mẫu cùng một lúc và do đó là đơn vị lý tưởng để xử lý mẫu hàng loạt.

Vô hiệu hóa SARS-CoV-2 Coronavirus bằng VialTweeter

Sau khi loại bỏ chất cố định, các lớp đơn được rửa ba lần bằng nước muối đệm phốt phát (PBS) trước khi cạo các tế bào thành 1mL MEM / 5% FBS và sonicated (3 × 10 giây trên, 10 giây tắt ở 100% công suất và biên độ) bằng cách sử dụng bộ xử lý siêu âm Hielscher UP200St với VialTweeter Đính kèm. Supernatants đã được làm rõ bằng cách ly tâm ở 3000 × g trong 10 phút. 

Đọc giao thức đầy đủ tại đây để bất hoạt coronavirus SARS-CoV-2 của Welch et al. (2020) bên dưới:

Tế bào và virus

Tế bào Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) được nuôi cấy trong môi trường thiết yếu tối thiểu (MEM) của Eagle sửa đổi bổ sung huyết thanh bê thai (FCS) 10% (v / v). Virus được sử dụng là chủng SARS-CoV-2 hCOV-19/2/2020, được PHE phân lập từ chùm bệnh nhân đầu tiên ở Anh vào ngày 29/01/2020. Virus này thu được ở đoạn 1 và được sử dụng cho các nghiên cứu bất hoạt ở đoạn 2 hoặc 3.
Đối với thuốc thử và hóa chất được sử dụng để bất hoạt SARS-CoV-2 cũng như loại bỏ độc tính tế bào thuốc thử, vui lòng xem báo cáo khoa học của Welch et al. (2020).

Virus bất hoạt bởi chất tẩy rửa – Giao thức bất hoạt SARS-CoV-2 Coronavirus của Welch et al. 2020

Ngừng hoạt động SARS-CoV-2

Đối với các sản phẩm thương mại, các chế phẩm virus (dịch nuôi cấy mô, chuẩn độ từ 1 × 10⁶ đến 1 × 10⁸ PFU / ml) được xử lý ba lần bằng thuốc thử ở nồng độ và thời gian tiếp xúc được khuyến nghị trong hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất, nếu có, hoặc cho nồng độ và thời gian được yêu cầu cụ thể bởi các phòng thí nghiệm thử nghiệm. Khi nhà sản xuất đưa ra một phạm vi nồng độ, tỷ lệ sản phẩm trên mẫu thấp nhất đã được thử nghiệm (tức là nồng độ khuyến nghị thấp nhất của sản phẩm thử nghiệm). Thuốc thử ống vận chuyển mẫu vật đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng tỷ lệ một thể tích dịch nuôi cấy mô với mười thể tích thuốc thử, trừ khi nhà sản xuất chỉ định tỷ lệ thể tích của chất lỏng mẫu so với thuốc thử. Chất tẩy rửa, chất cố định và dung môi đã được thử nghiệm ở nồng độ được chỉ định trong thời gian chỉ định. Tất cả các bước bất hoạt được thực hiện ở nhiệt độ phòng xung quanh (18 - 25 ° C). Để thử nghiệm các loại mẫu thay thế, virus được đưa vào ma trận mẫu được chỉ định theo tỷ lệ 1: 9, sau đó được xử lý bằng thuốc thử như trên. Tất cả các thí nghiệm bao gồm các mẫu được xử lý giả kiểm soát ba lần với thể tích PBS tương đương thay cho thuốc thử thử nghiệm. Ngay sau thời gian tiếp xúc yêu cầu, 1mL mẫu được xử lý đã được xử lý bằng ma trận lọc được lựa chọn thích hợp. Loại bỏ thuốc thử để thử nghiệm bất hoạt được thực hiện ở định dạng cột quay lớn hơn bằng cách sử dụng Cột quay loại bỏ chất tẩy rửa Pierce 4mL (Thermo Fisher) hoặc bằng cách lấp đầy các cột máy ly tâm dung tích Pierce 10mL rỗng (Thermo Fisher) bằng Hạt sinh học SM2, Sephacryl S-400HR hoặc Sephadex LH-20 để tạo ra các hạt / nhựa đóng gói 4ml. Để tinh chế bằng bộ lọc Amicon, 2 mẫu × 500μl đã được tinh chế bằng hai bộ lọc ly tâm bằng phương pháp được mô tả trước đó, sau đó gộp lại với nhau. Đối với formaldehyde và formaldehyde có loại bỏ glutaraldehyd, một bộ lọc được sử dụng với thể tích mẫu 1× 500μl, lơ lửng sau khi xử lý trong PBS 500μl và thêm vào 400ul MEM / 5% FBS. Để bất hoạt bị nhiễm bệnh lớp đơn, 12,5 cm² bình của các tế bào Vero E6 (2,5 × 10⁶ tế bào/bình trong 2,5ml MEM/5% FBS) bị nhiễm ở MOI 0,001 và ủ ở 37°C/5% CO₂ trong 24 giờ. Supernatant đã được loại bỏ, và các tế bào cố định bằng cách sử dụng 5mL formaldehyde, hoặc formaldehyde và glutaraldehyde ở nhiệt độ phòng trong 15 hoặc 60 phút. Chất cố định đã được loại bỏ và các lớp đơn được rửa ba lần bằng PBS trước khi cạo các tế bào thành 1mL MEM / 5% FBS và sonicated (3 × 10 giây bật, tắt 10 giây ở 100% công suất và biên độ) bằng UP200St với tệp đính kèm VialTweeter (Công nghệ siêu âm Hielscher). Supernatants đã được làm rõ bằng cách ly tâm ở 3000 × g trong 10 phút.

Chi tiết về thuốc thử được sử dụng để bất hoạt virus corona SARS-CoV-2 bằng VialTweeter siêu âm theo giao thức của Welch et al. 2020

Giao thức đầy đủ bao gồm việc sử dụng Hielscher VialTweeter có thể được tìm thấy ở đây:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Dismembrators siêu âm tinh vi và Cell Disruptors

Các ultrasonicator đa mẫu VialTweeter chỉ là một trong nhiều giải pháp siêu âm để chuẩn bị mẫu trong các phòng thí nghiệm sinh học, sinh hóa và lâm sàng. Hielscher Ultrasonics cung cấp dismembrator siêu âm lý tưởng cho ứng dụng của bạn, ví dụ như ly giải tế bào, khai thác tế bào, đồng nhất mô, lysate hòa tan, hòa tan, mẫu khử khí, vv
Hãy cho chúng tôi biết có bao nhiêu mẫu bạn phải xử lý mỗi giờ và ngày, nếu bạn thích sonication trực tiếp hoặc gián tiếp và mục tiêu của điều trị mẫu siêu âm là gì. Chúng tôi sẽ giới thiệu cho bạn đơn vị siêu âm phù hợp nhất cho thói quen làm việc hàng ngày của bạn!
Bộ vi xử lý siêu âm kỹ thuật số của Hielscher Ultrasonics được trang bị phần mềm thông minh, ghi dữ liệu tự động, tùy chọn cài đặt trước dễ dàng để kiểm soát nhiệt độ, thời gian sonication, chế độ chu kỳ / xung cũng như chiếu sáng mẫu và điều khiển từ xa trình duyệt. Chúng tôi cố gắng làm cho các thiết bị siêu âm của chúng tôi thông minh nhất có thể để nghiên cứu và thói quen làm việc của bạn trở nên thuận tiện và thành công nhất có thể.
Nhấn vào đây, để tìm thêm các ứng dụng bao gồm các giao thức chuẩn bị mẫu siêu âm với VialTweeter!