Ly giải mẫu Drosophila Melanogaster bằng siêu âm

Drosophila melanogaster được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm làm sinh vật mô hình. Vì vậy, các bước chuẩn bị trước phân tích như ly giải, phá vỡ tế bào, chiết xuất protein và cắt DNA của mẫu Drosophila melanogaster phải được thực hiện thường xuyên. Các thiết bị phá vỡ mẫu bằng siêu âm có độ tin cậy và hiệu quả cao, đồng thời có thể dễ dàng thực hiện nhiều tác vụ như ly giải, chiết xuất protein hoặc phân mảnh DNA chỉ bằng cách điều chỉnh các thông số của quá trình siêu âm. Do đó, các máy đồng nhất hóa bằng siêu âm là những công cụ linh hoạt với phạm vi ứng dụng rộng.

Ly giải và chiết xuất protein bằng siêu âm

Ly giải, hòa tan tế bào, đồng nhất hóa mô và chiết xuất protein là những tác vụ điển hình của các thiết bị phá vỡ mẫu bằng siêu âm trong phòng thí nghiệm sinh học. Các thiết bị phá vỡ mẫu và phá vỡ tế bào bằng siêu âm rất phù hợp để đồng nhất hóa mô động vật, côn trùng (ví dụ: Drosophila melanogaster, C. elegans) hoặc mẫu thực vật. Các ứng dụng tiếp theo của siêu âm là ly giải huyền phù tế bào và cặn tế bào cũng như chiết xuất protein nội bào.
Ly giải và chiết xuất protein bằng siêu âm là những quá trình có độ tin cậy và khả năng tái lập cao, có thể được thực hiện dựa trên các quy trình đã được thiết lập. Vì cường độ của quá trình siêu âm có thể được điều chỉnh chính xác thông qua các thông số siêu âm như biên độ, chu kỳ / chế độ xung, nhiệt độ và thể tích mẫu, nên các quy trình đã được kiểm chứng có thể được lặp lại nhiều lần với cùng kết quả.

Phân mảnh DNA và RNA bằng siêu âm

Sau khi ly giải tế bào và chiết xuất protein, một bước thường cần thực hiện trong quá trình chuẩn bị mẫu là cắt và phân mảnh DNA, RNA và chất nhiễm sắc, ví dụ trước khi kết tủa miễn dịch chất nhiễm sắc (ChIP). Có thể phân mảnh DNA và RNA một cách đáng tin cậy bằng cách dùng lực vật lý để phá vỡ các liên kết cộng hóa trị giữ DNA liền mạch. Khi sử dụng lực cắt vật lý như siêu âm, trước tiên các sợi DNA bị đứt, sau đó DNA được phân mảnh thành các đoạn nhỏ hơn.
Phân mảnh DNA bằng siêu âm là phương pháp đáng tin cậy và hiệu quả để cắt DNA đến chiều dài mục tiêu, ví dụ: 500bp (cặp bazơ). Những ưu điểm chính của việc phân mảnh DNA bằng siêu âm bao gồm khả năng kiểm soát chính xác các thông số và cường độ của quá trình siêu âm. Có thể điều chỉnh các thông số của quá trình siêu âm bằng cách tinh chỉnh chính xác cường độ, chu kỳ và thời gian siêu âm. Điều này cho phép tạo ra DNA có kích thước mong muốn, đồng thời tạo ra và tái tạo DNA có chiều dài mục tiêu một cách đáng tin cậy. Cắt DNA bằng siêu âm cũng là phương pháp lý tưởng để tạo ra các đoạn DNA có khối lượng phân tử cao.

Các quy trình ly giải Drosophila melanogaster bằng siêu âm

Dưới đây là các quy trình khác nhau để ly giải, chiết xuất protein và phân mảnh DNA hoặc chất nhiễm sắc của mẫu Drosophila với sự hỗ trợ của siêu âm.

Ly giải bằng siêu âm cho xét nghiệm kết tủa miễn dịch liên kết chéo (CLIP)

Xét nghiệm CLIP được thực hiện như đã báo cáo trước đây với một số điều chỉnh. Khoảng 20 mg buồng trứng lấy từ ruồi cái kiểu dại 0–1 ngày tuổi được tạo liên kết chéo bằng tia UV (3 × 2000 μJ/cm2), đồng nhất hóa trên đá trong 1 mL dung dịch đệm RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1× chất ức chế protease Complete không chứa EDTA, 1 mM PMSF) có bổ sung 300 U RNAseOUT và đặt trên đá trong 30 min. Dịch đồng nhất được xử lý siêu âm trên đá ở mức công suất 80%, năm lần, mỗi lần 20 s với khoảng nghỉ 60 s giữa các lần, bằng thiết bị xử lý siêu âm Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) và ly tâm (16.000 × g trong 5 min ở 4°C). Dịch chiết hòa tan được làm sạch sơ bộ bằng 20 μl hạt Dynabeads Protein-G trong 20 min ở 4°C. Sau khi lấy các phần mẫu để thực hiện immunoblot và định lượng RNA đầu vào (1%), HP1 được kết tủa miễn dịch bằng kháng thể kháng HP1 9A9 từ 450 μl dịch chiết đã làm sạch sơ bộ bằng cách ủ trong 4 h với 50 μl hạt Dynabeads Protein-G. Các kết tủa miễn dịch được rửa 4 lần bằng RCB. Để rửa giải các RNA đã được kết tủa miễn dịch, các hạt đã lắng được đun sôi trong 100 μL nước UltraPure đã xử lý bằng DEPC trong 5 min. 900 μL thuốc thử Qiazol được thêm vào dịch nổi thu hồi để chuẩn bị RNA. RNA đã tinh sạch được dùng làm khuôn để tổng hợp cDNA bằng oligo dT, các đoạn mồi hexamer ngẫu nhiên và enzyme phiên mã ngược SuperScript III theo quy trình của nhà sản xuất.
(Cassale et al. 2019)

Ly giải bằng siêu âm cho xét nghiệm kết tủa miễn dịch chromatin

Quá trình kết tủa miễn dịch chromatin được thực hiện theo phương pháp do Menet mô tả với một số điều chỉnh nhỏ. Khoảng 20 mg buồng trứng của ruồi cái kiểu dại từ 0 đến 1 ngày tuổi được đồng nhất hóa trong 1 mL đệm NEB (10 mM HEPES-Na ở pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na ở pH 8, 0,5 mM EDTA-Na ở pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidine, 0,15 mM spermine, chất ức chế protease Complete không chứa EDTA 1×) bằng máy đồng nhất hóa / máy phân tán nhúng trong 1 min (ở 3000 rpm). Dịch đồng nhất được chuyển sang dụng cụ đồng nhất hóa Dounce bằng thủy tinh đã làm lạnh trước và được nghiền bằng 15 hành trình đầy đủ với chày khít. Sau đó, các nhân tự do được ly tâm ở 6000xg trong 10 min ở 4°C. Các phần cặn chứa nhân được huyền phù lại trong 1 mL NEB và ly tâm ở 20.000 × g trong 20 min trên gradient sucrose (0,65 mL sucrose 1,6 M trong NEB, 0,35 mL sucrose 0,8 M trong NEB). Phần cặn được huyền phù lại trong 1 mL NEB và formaldehyde đến nồng độ cuối cùng là 1%. Các nhân được tạo liên kết chéo trong 10 min ở nhiệt độ phòng và phản ứng được dừng bằng cách thêm glycine 1,375 M với thể tích bằng 1/10 thể tích mẫu. Các nhân được thu bằng cách ly tâm ở 6000 × g trong 5 min. Các nhân được rửa hai lần trong 1 mL NEB và huyền phù lại trong 1 mL đệm ly giải (15 mM HEPES-Na ở pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA ở pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine và chất ức chế protease Complete không chứa EDTA 1×). Các nhân được xử lý siêu âm bằng máy xử lý siêu âm Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) sáu lần, mỗi lần bật siêu âm trong 20 s và đặt trên đá trong 1 min. Các nhân đã xử lý siêu âm được ly tâm ở 13.000 × g trong 4 min ở 4°C. Phần lớn chromatin đã xử lý siêu âm có chiều dài từ 500 đến 1000 cặp bazơ (bp). Đối với mỗi lần kết tủa miễn dịch, 15 μg chromatin được ủ với sự hiện diện của 10 μg kháng thể đơn dòng HP1 9A9 (3 h ở 4°C trên bánh xe quay). Sau đó, 50 μl hạt Dynabeads protein G được thêm vào và quá trình ủ được tiếp tục qua đêm ở 4°C. Các dịch nổi được loại bỏ và mẫu được rửa hai lần trong đệm ly giải (mỗi lần rửa trong 15 min ở 4 °C) và hai lần trong đệm TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl ở pH 8). Chromatin được rửa giải khỏi các hạt qua hai bước; trước tiên trong 100 μl đệm rửa giải 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl ở pH 8) ở 65°C trong 15 min, sau đó ly tâm và thu hồi dịch nổi. Vật liệu trên hạt được chiết lại trong 100 μl TE + 0,67% SDS. Dịch rửa giải gộp (200 μl) được ủ qua đêm ở 65°C để phá bỏ các liên kết chéo và được xử lý bằng RNaseA 50 μg/ml trong 15 min ở 65°C và bằng Proteinase K 500 μg/ml trong 3 h ở 65°C. Các mẫu được chiết bằng phenol–chloroform và kết tủa bằng ethanol. DNA được huyền phù lại trong 25 μl nước. Để tối đa hóa các phân tích phân tử với DNA đã kết tủa miễn dịch, các gen ứng viên được khuếch đại theo cặp bằng quy trình duplex-PCR đã tối ưu hóa, sử dụng hai bộ mồi khác nhau có nhiệt độ nóng chảy tương tự trong cùng một phản ứng.
(Casale et al. 2019)
 

Máy phá vỡ tế bào bằng siêu âm hiệu suất cao cho mẫu sinh học

Hielscher Ultrasonics là đối tác giàu kinh nghiệm của bạn về các thiết bị siêu âm hiệu năng cao dùng để phá vỡ tế bào, ly giải, chiết xuất protein, phân mảnh DNA, RNA và chromatin cũng như thực hiện các bước chuẩn bị mẫu trước phân tích khác. Với danh mục toàn diện gồm các máy đồng nhất siêu âm dùng trong phòng thí nghiệm và các thiết bị chuẩn bị mẫu, Hielscher có thiết bị siêu âm lý tưởng cho ứng dụng sinh học và yêu cầu của bạn.
Các thiết bị siêu âm kiểu đầu dò truyền thống có đầu vi mô như UP200St (200W; xem hình bên trái) hoặc một trong các thiết bị chuẩn bị mẫu bằng siêu âm VialTweeter hoặc UP200ST_TD_CupHorn kết hợp với VialHolder là những mẫu thiết bị được ưa chuộng trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu và phân tích. Đầu dò siêu âm truyền thống là lựa chọn lý tưởng khi cần ly giải, chiết xuất hoặc phân mảnh số lượng mẫu ít hơn. Các thiết bị chuẩn bị mẫu VialTweeter và UP200St_TD_CupHorn cho phép xử lý siêu âm đồng thời tối đa lần lượt là 10 hoặc 5 lọ.
Nếu cần xử lý số lượng mẫu lớn (ví dụ: đĩa 96 giếng, đĩa vi chuẩn độ, v.v.), thì UIP400MTP là hệ thống xử lý siêu âm lý tưởng. UIP400MTP hoạt động như một đầu siêu âm dạng cốc lớn hơn, được đổ đầy nước và có đủ không gian để chứa các đĩa vi giếng. Được dẫn động bởi bộ xử lý siêu âm mạnh mẽ có công suất 400 oát, UIP400MTP xử lý siêu âm các đĩa đa giếng một cách rất đồng đều và mạnh mẽ để phá vỡ tế bào, ly giải mẫu, hòa tan cặn lắng, chiết xuất protein hoặc cắt DNA bằng lực cắt.

Kiểm soát chính xác bằng phần mềm thông minh

Tất cả các giải pháp xử lý siêu âm của Hielscher từ 200 oát trở lên đều được trang bị màn hình cảm ứng màu kỹ thuật số và phần mềm thông minh. Nhờ chức năng ghi dữ liệu thông minh, tất cả các thông số của quá trình siêu âm được tự động lưu dưới dạng tệp CSV trên thẻ SD tích hợp ngay khi thiết bị siêu âm được khởi động. Điều này giúp việc nghiên cứu và ghi chép thuận tiện hơn nhiều. Sau các thử nghiệm siêu âm hoặc quá trình chuẩn bị mẫu, bạn có thể dễ dàng xem lại và so sánh các thông số của từng lần xử lý siêu âm.
Thông qua menu trực quan, có thể cài đặt trước nhiều thông số trước khi xử lý siêu âm: Ví dụ, để kiểm soát nhiệt độ trong mẫu và ngăn mẫu bị phân hủy do nhiệt, có thể đặt giới hạn trên cho nhiệt độ mẫu. Cảm biến nhiệt độ dạng cắm, được cung cấp kèm thiết bị siêu âm, phản hồi cho bộ xử lý siêu âm về nhiệt độ thực tế trong quá trình xử lý. Khi đạt giới hạn nhiệt độ trên, thiết bị siêu âm tạm dừng cho đến khi đạt giới hạn dưới của khoảng ∆T đã cài đặt, sau đó tự động tiếp tục xử lý siêu âm.
Nếu cần xử lý siêu âm với một mức năng lượng đầu vào cụ thể, bạn có thể cài đặt trước tổng năng lượng siêu âm cuối cùng của lần xử lý. Tất nhiên, cũng có thể cài đặt riêng chế độ phát xung và chế độ chu kỳ siêu âm.
Để sử dụng lại các thông số siêu âm mang lại kết quả tốt nhất, bạn có thể lưu các chế độ xử lý siêu âm khác nhau (ví dụ: thời gian siêu âm, cường độ, chế độ chu kỳ, v.v.) thành các chế độ cài đặt sẵn để có thể dễ dàng và nhanh chóng khởi động lại.
Để vận hành thuận tiện hơn, tất cả các thiết bị siêu âm kỹ thuật số đều có thể được điều khiển từ xa qua bất kỳ trình duyệt thông dụng nào (ví dụ: InternetExplorer, Safari, Chrome, v.v.). Kết nối LAN được thiết lập đơn giản theo kiểu cắm là chạy và không yêu cầu cài đặt thêm phần mềm.
Tại Hielscher, chúng tôi hiểu rằng việc xử lý siêu âm thành công các mẫu sinh học đòi hỏi độ chính xác và khả năng lặp lại. Vì vậy, chúng tôi đã thiết kế các thiết bị siêu âm của mình thành những thiết bị thông minh với đầy đủ các tính năng cho phép chuẩn bị mẫu hiệu quả, đáng tin cậy, có khả năng tái lập và thuận tiện.

Bảng dưới đây cho biết năng lực xử lý gần đúng của các hệ thống siêu âm của chúng tôi, từ các đầu siêu âm vi mô và máy đồng nhất siêu âm truyền thống đến các thiết bị siêu âm MultiSample để chuẩn bị nhiều mẫu một cách thuận tiện và đáng tin cậy: