Siêu âm ly giải các mẫu Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm như là sinh vật mẫu. Do đó, các bước chuẩn bị trước khi phân tích như ly giải, phá vỡ tế bào, chiết xuất protein và cắt DNA của các mẫu Drosophila melanogaster phải được thực hiện thường xuyên. Máy khử siêu âm là đáng tin cậy và hiệu quả và có thể được sử dụng để thực hiện các nhiệm vụ khác nhau như ly giải, khai thác protein hoặc phân mảnh DNA một cách dễ dàng bằng cách chỉ điều chỉnh các thông số quá trình siêu âm. Siêu âm homogenizers do đó là công cụ linh hoạt với một loạt các ứng dụng.

Siêu âm ly giải và khai thác protein

Lysis, hòa tan tế bào, đồng nhất hóa mô và khai thác protein là những nhiệm vụ điển hình cho máy khử siêu âm trong phòng thí nghiệm sinh học. Chất khử trùng siêu âm và chất gây rối loạn tế bào rất phù hợp để đồng nhất hóa các mô động vật, côn trùng (ví dụ, Drosophila melanogaster, C. elegans) hoặc mẫu vật thực vật. Các ứng dụng tiếp theo của ultrasonication là ly giải huyền phù tế bào và viên cũng như khai thác protein nội bào.
Ly giải siêu âm và khai thác protein là các quá trình có độ tin cậy cao và tái sản xuất, có thể được thực hiện trên cơ sở các giao thức được thiết lập. Vì cường độ quá trình siêu âm có thể được điều chỉnh chính xác thông qua các thông số sonication như biên độ, chế độ chu kỳ / xung, nhiệt độ và khối lượng mẫu, một khi các giao thức đã được chứng minh có thể được lặp lại với cùng một kết quả lặp đi lặp lại.

Siêu âm DNA và RNA phân mảnh

Sau khi ly giải tế bào và chiết xuất protein, một bước bắt buộc phổ biến trong việc chuẩn bị mẫu là cắt và phân mảnh DNA, RNA và nhiễm sắc, ví dụ như trước khi kết tủa miễn dịch nhiễm sắc thể (ChIP). Sự phân mảnh DNA và RNA có thể đạt được một cách đáng tin cậy bằng cách phá vỡ các liên kết cộng hóa trị giữ DNA lại với nhau bằng các lực vật lý. Sử dụng cắt vật lý như sonication, lúc đầu các sợi DNA bị phá vỡ, sau đó DNA bị phân mảnh thành các mảnh nhỏ hơn.
Phân mảnh DNA siêu âm là đáng tin cậy và hiệu quả trong việc cắt DNA đến một chiều dài mục tiêu, ví dụ như 500bp (cặp cơ sở). Những ưu điểm chính của phân mảnh DNA siêu âm bao gồm kiểm soát chính xác các thông số và cường độ quá trình siêu âm. Các thông số quá trình siêu âm có thể được điều chỉnh bằng cách điều chỉnh cường độ sonication, chu kỳ và thời gian chính xác. Điều này làm cho nó có thể tạo ra kích thước DNA mong muốn và chiều dài DNA mục tiêu có thể được sản xuất cũng như tái tạo một cách đáng tin cậy. Cắt DNA siêu âm cũng là lý tưởng để tạo ra các đoạn DNA trọng lượng phân tử cao.

Giao thức cho ly giải siêu âm của Drosophila melanogaster

Dưới đây bạn có thể tìm thấy các giao thức khác nhau cho ly giải hỗ trợ siêu âm, chiết xuất protein và phân mảnh DNA hoặc nhiễm sắc thể của các mẫu Drosophila.

Siêu âm ly giải cho kết tủa miễn dịch liên kết ngang (CLIP)

Xét nghiệm CLIP đã được thực hiện như báo cáo trước đó với một số sửa đổi. Khoảng 20 mg buồng trứng từ 0 đến 1 ngày tuổi là con cái hoang dã được liên kết ngang UV (3 × 2000 μJ / cm2), đồng nhất trên băng trong dung dịch đệm RCB 1 mL (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1× Chất ức chế Protease hoàn chỉnh không chứa EDTA, 1 mM PMSF) bổ sung 300 U RNAseOUT và đặt trên đá trong 30 phút. Homogenate được sonicated trên băng, ở mức 80% năng lượng, năm lần trong 20 s bursts với phần còn lại 60 s ở giữa bằng cách sử dụng Bộ xử lý siêu âm Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) và ly tâm (16000 × g trong 5 phút ở 4 ° C). Chiết xuất hòa tan đã được làm sạch trước bằng 20 μl Protein-G dynabead trong 20 phút ở 4 ° C. Sau khi loại bỏ các mẫu để làm mờ miễn dịch và định lượng đầu vào RNA (1%), HP1 được kết tủa miễn dịch với kháng thể kháng HP1 9A9 từ chiết xuất được làm sạch trước 450 μl bằng cách ủ trong 4 giờ với dynabead Protein-G 50 μl. Kết tủa miễn dịch được rửa 4 lần bằng RCB. Để pha loãng các RNA kết tủa miễn dịch, các hạt dạng viên được đun sôi trong 100 μL nước được xử lý UltraPure DEPC trong 5 phút. Thuốc thử Qiazol 900 μL đã được thêm vào chất siêu nhiên được thu hồi để điều chế RNA. RNA được tinh chế được sử dụng như một khuôn mẫu để tổng hợp cDNA bằng cách sử dụng oligo dT, hexamers ngẫu nhiên và SuperScript reverse transcriptase III theo giao thức của nhà sản xuất.
(Cassale và cộng sự 2019)

Siêu âm ly giải cho xét nghiệm kết tủa miễn dịch Chromatin

Kết tủa miễn dịch nhiễm sắc thể được thực hiện theo phương pháp được mô tả bởi Menet với những sửa đổi nhỏ. Khoảng 20 mg buồng trứng từ 0 đến 1 ngày tuổi con cái hoang dã được đồng nhất trong 1 ml dung dịch đệm NEB (10 mM HEPES-Na ở pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na ở pH 8, 0,5 mM EDTA-Na ở pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidine, 0,15 mM Spermine, 1× chất ức chế Protease hoàn chỉnh không có EDTA) với bộ phân tán đồng nhất / ngâm 1 phút (ở 3000 vòng / phút). Homogenate đã được chuyển sang một dounce thủy tinh được làm lạnh trước và 15 nét đầy đủ được áp dụng với một cái chày chặt. Hạt nhân tự do sau đó được ly tâm ở 6000xg trong 10 phút ở 4 ° C. Các viên chứa hạt nhân được lơ lửng trong 1 ml NEB và ly tâm ở 20000 × g trong 20 phút trên gradient sucrose (0,65 mL sucrose 1,6 M trong NEB, 0,35 mL 0,8 M sucrose trong NEB). Viên nén được treo lại trong 1 ml NEB và formaldehyd đến nồng độ cuối cùng là 1%. Các hạt nhân được liên kết chéo trong 10 phút ở nhiệt độ phòng và được làm nguội bằng cách thêm 1/10 vol glycine 1,375 M. Các hạt nhân được thu thập bằng cách ly tâm ở 6000 × g trong 5 phút. Hạt nhân được rửa hai lần trong 1 ml NEB và lơ lửng trong 1 ml dung dịch đệm ly giải (15 mM HEPES-Na ở pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA ở pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine và 1× Chất ức chế Protease hoàn chỉnh không chứa EDTA). Hạt nhân được sonicated bằng cách sử dụng bộ xử lý siêu âm Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) sáu lần trong 20 giây trên và 1 phút trên băng. Hạt nhân sonicated được ly tâm ở 13000 × g trong 4 phút ở 4 ° C. Phần lớn nhiễm sắc thể sonicated có chiều dài từ 500 đến 1000 cặp base (bp). Đối với mỗi lần kết tủa miễn dịch, 15 μg chromatin được ủ với sự có mặt của 10 μg kháng thể đơn dòng HP1 9A9 (3 giờ ở 4 ° C trong bánh xe quay). Sau đó, 50 μl protein dynabead G đã được thêm vào và quá trình ủ được tiếp tục qua đêm ở 4 ° C. Các chất siêu nhiên đã được loại bỏ và các mẫu được rửa hai lần trong Lysis Buffer (mỗi lần rửa 15 phút ở 4 ° C) và hai lần trong TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl ở pH 8). Chromatin được pha loãng từ hạt theo hai bước; đầu tiên trong 100 μl Dung dịch đệm Eluition 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl ở pH 8) ở 65 ° C trong 15 phút, sau đó ly tâm và thu hồi chất siêu nhiên. Vật liệu hạt được chiết xuất lại trong 100 μl TE + 0,67% SDS. Eluate kết hợp (200 μl) được ủ qua đêm ở 65 ° C để đảo ngược các liên kết ngang và được xử lý bằng 50 μg / ml RNaseA trong 15 phút ở 65 ° C và 500 μg / ml Proteinase K trong 3 giờ ở 65 ° C. Các mẫu được chiết xuất phenol-chloroform và ethanol kết tủa. DNA được treo lại trong 25 μl nước. Để tối đa hóa các phân tích phân tử với kết tủa miễn dịch DNA, các gen ứng cử viên đã được khuếch đại theo cặp thông qua giao thức PCR song công được tối ưu hóa bằng cách sử dụng hai bộ mồi khác nhau có nhiệt độ nóng chảy tương tự trong một phản ứng duy nhất.
(Casale và cộng sự 2019)
 

Chất gây rối loạn tế bào siêu âm hiệu suất cao cho các mẫu sinh học

Hielscher Ultrasonics là đối tác lâu năm có kinh nghiệm của bạn khi nói đến ultrasonicators hiệu suất cao cho sự gián đoạn tế bào, lysis, khai thác protein, DNA, RNA, và phân mảnh chromatin cũng như các bước chuẩn bị mẫu tiền phân tích khác. Cung cấp một danh mục đầu tư toàn diện của homogenizers phòng thí nghiệm siêu âm và các đơn vị chuẩn bị mẫu, Hielscher có các thiết bị siêu âm lý tưởng cho các ứng dụng sinh học và yêu cầu của bạn.
Ultrasonicator loại thăm dò cổ điển với micro-tip chẳng hạn như UP200St (200W; xem hình bên trái) hoặc một trong các đơn vị chuẩn bị mẫu siêu âm LọTweeter hoặc UP200St_TD_CupHorn với VialHolder là những mô hình được yêu thích trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu và phân tích. Đầu dò siêu âm cổ điển là lý tưởng, khi chuẩn bị ít mẫu phải được lysed, chiết xuất hoặc phân mảnh. Các đơn vị chuẩn bị mẫu VialTweeter và UP200St_TD_CupHorn cho phép sonication đồng thời lên đến 10 hoặc 5 lọ, tương ứng.
Nếu số mẫu cao (ví dụ: tấm 96 giếng, tấm microtiter, v.v.) phải được xử lý, UIP400MTP là thiết lập sonication lý tưởng. Các UIP400MTP hoạt động giống như một cuphorn lớn hơn, chứa đầy nước và có đủ không gian để chứa các tấm giếng siêu nhỏ. Được hỗ trợ bởi một bộ xử lý siêu âm mạnh mẽ 400 watt, UIP400MTP cung cấp một sonication rất đồng đều và dữ dội của các tấm đa giếng để phá vỡ các tế bào, mẫu lyse, hòa tan viên, chiết xuất protein hoặc cắt DNA.

Điều khiển chính xác thông qua phần mềm thông minh

Tất cả các giải pháp sonication Hielscher từ 200 watt trở lên đều được trang bị màn hình cảm ứng màu kỹ thuật số và phần mềm thông minh. Thông qua giao thức dữ liệu thông minh, tất cả các thông số quá trình siêu âm được tự động lưu dưới dạng tệp CSV trên thẻ SD tích hợp ngay khi ultrasonicator được khởi động. Điều này làm cho nghiên cứu và giao thức thuận tiện hơn rất nhiều. Sau khi thử nghiệm sonication hoặc chuẩn bị mẫu, bạn chỉ cần xem lại các thông số sonication của mỗi lần chạy sonication và so sánh chúng.
Thông qua menu trực quan, nhiều thông số có thể được đặt trước trước khi sonication: Ví dụ, để kiểm soát nhiệt độ trong mẫu và để ngăn chặn sự suy thoái nhiệt của nó, có thể đặt giới hạn trên của nhiệt độ mẫu. Một cảm biến nhiệt độ có thể cắm được, đi kèm với đơn vị siêu âm, cung cấp cho bộ xử lý siêu âm phản hồi về nhiệt độ sonication thực tế. Khi đạt đến giới hạn nhiệt độ trên, thiết bị siêu âm tạm dừng cho đến khi đạt đến giới hạn dưới của cài đặt ∆T và bắt đầu sau đó tự động âm thanh trở lại.
Nếu sonication với một đầu vào năng lượng cụ thể là cần thiết, bạn có thể đặt trước năng lượng siêu âm cuối cùng của sonication chạy. Tất nhiên, xung siêu âm và chế độ chu kỳ cũng có thể được thiết lập riêng lẻ.
Để sử dụng lại các thông số sonication thành công nhất của bạn, bạn có thể lưu các chế độ sonication khác nhau (ví dụ: thời gian sonication, cường độ, chế độ chu kỳ, v.v.) làm chế độ cài đặt sẵn, để chúng có thể dễ dàng và nhanh chóng bắt đầu lại.
Để thuận tiện hơn cho hoạt động, tất cả các đơn vị siêu âm kỹ thuật số có thể được vận hành thông qua điều khiển từ xa của trình duyệt trong bất kỳ trình duyệt phổ biến nào (ví dụ: InternetExplorer, Safari, Chrome, v.v.). Kết nối mạng LAN là một thiết lập plug-n-play đơn giản và không yêu cầu cài đặt phần mềm bổ sung.
Chúng tôi tại Hielscher biết rằng việc sonication thành công các mẫu sinh học đòi hỏi độ chính xác và độ lặp lại. Do đó, chúng tôi thiết kế ultrasonicators của chúng tôi như là thiết bị thông minh với tất cả các tính năng cho phép chuẩn bị mẫu hiệu quả, đáng tin cậy, tái tạo và thuận tiện.

Bảng dưới đây cung cấp cho bạn một dấu hiệu về khả năng xử lý gần đúng của các hệ thống siêu âm của chúng tôi từ micro-tips siêu âm và homogenizers siêu âm cổ điển để ultrasonicators MultiSample để chuẩn bị thuận tiện, đáng tin cậy của nhiều mẫu: