Chuẩn bị mẫu bằng siêu âm cho xét nghiệm ELISA

Các xét nghiệm như ELISA được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán in vitro, phát hiện protein liên quan đến bệnh và kiểm soát chất lượng (ví dụ: giám sát các chất gây dị ứng trong thực phẩm). Chuẩn bị mẫu bằng siêu âm là kỹ thuật nhanh chóng, đáng tin cậy và có khả năng tái lập để ly giải tế bào và phân lập protein nội bào, DNA, RNA và các bào quan. Hielscher Ultrasonics cung cấp nhiều giải pháp siêu âm để chuẩn bị thuận tiện từng mẫu riêng lẻ, nhiều lọ mẫu cũng như mẫu trong đĩa vi chuẩn độ và đĩa 96 giếng.

ELISA – Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme

ELISA là viết tắt của xét nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme và là kỹ thuật phân tích sinh hóa được sử dụng rộng rãi thuộc nhóm xét nghiệm gắn kết phối tử. Trong ELISA, mẫu lỏng được thêm vào một pha rắn cố định có đặc tính gắn kết đặc biệt. Thông thường, pha rắn cố định được phủ lên đĩa giếng hoặc đĩa ELISA. Sau đó, các thuốc thử dạng lỏng khác nhau lần lượt được thêm vào, ủ và rửa, để cuối cùng xuất hiện một thay đổi quang học (ví dụ: sự phát triển màu do sản phẩm của phản ứng enzyme) trong chất lỏng cuối cùng trong giếng. Thay đổi quang học cho phép đo lượng chất phân tích bằng phép “đọc” định lượng. Để đọc định lượng, máy quang phổ, máy đo huỳnh quang hoặc máy đo phát quang được sử dụng để phát hiện và đo cường độ ánh sáng truyền qua. Độ nhạy phát hiện chịu ảnh hưởng của sự khuếch đại tín hiệu trong các phản ứng phân tích. Vì các phản ứng enzyme là những quá trình khuếch đại đã được nghiên cứu kỹ và đáng tin cậy, enzyme được sử dụng để tạo tín hiệu. Các enzyme được liên kết với thuốc thử phát hiện theo tỷ lệ cố định để cho phép định lượng chính xác, điều này cũng giải thích tên gọi xét nghiệm hấp phụ miễn dịch “liên kết enzyme”.
Vì các xét nghiệm ELISA được thực hiện trong đĩa vi chuẩn độ / đĩa 96 giếng, kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật xét nghiệm trên đĩa và được sử dụng, ví dụ, trong chẩn đoán in vitro lâm sàng, nghiên cứu, phát triển thuốc, v.v. để phát hiện và định lượng kháng thể, peptide, protein và hormone.
Kỹ thuật ELISA thường được sử dụng làm công cụ chẩn đoán trong y học, công nghệ sinh học, bệnh học thực vật và cũng là một phép đo kiểm soát chất lượng quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp.

Chuẩn bị mẫu bằng siêu âm trước ELISA

Trước khi có thể thực hiện xét nghiệm ELISA, mẫu cần trải qua các bước chuẩn bị như ly giải tế bào và chiết xuất protein nội bào, DNA, RNA, v.v. Ưu điểm của ly giải tế bào và phân lập protein bằng siêu âm là hiệu quả cao, độ tin cậy và khả năng tái lập. Tất cả các yếu tố này đều quan trọng để thu được kết quả chẩn đoán và nghiên cứu có chất lượng cao

Quy trình ly giải tế bào bằng siêu âm trước ELISA

• Đối với tế bào nuôi cấy: Trước khi ly giải tế bào bằng siêu âm, ly tâm tế bào trong 5 phút ở 270 x g bằng máy ly tâm vi lượng. Hút bỏ dịch nổi và tái huyền phù tế bào trong 30 – 100 μL dung dịch đệm RIPA. Sau đó, ủ cặn tế bào trên đá trong 30 phút.
• Lúc này, mẫu tế bào đã sẵn sàng để ly giải bằng siêu âm:
  Sử dụng thiết bị siêu âm dạng đầu dò (ví dụ: UP200Ht với đầu dò S26d2) hoặc thiết bị siêu âm xử lý nhiều mẫu (ví dụ: VialTweeter để xử lý siêu âm đồng thời tối đa 10 lọ hoặc UIP400MPT cho đĩa vi chuẩn độ / đĩa 96 giếng), tùy thuộc vào số lượng mẫu bạn cần chuẩn bị.
  Để xử lý siêu âm một mẫu đơn lẻ bằng đầu dò, cho tế bào vào các ống ly tâm vi lượng 1,5 mL.
• Cài đặt trước thời gian xử lý siêu âm, tổng năng lượng đầu vào, chế độ chu kỳ và/hoặc giới hạn nhiệt độ trong menu kỹ thuật số của thiết bị siêu âm. Điều này đảm bảo quá trình xử lý siêu âm có độ tin cậy cao và khả năng lặp lại.
• Đưa đầu sonotrode vào mẫu và bật thiết bị siêu âm. Nhẹ nhàng di chuyển đầu vi mô của đầu dò siêu âm trong mẫu để xử lý siêu âm mẫu một cách đồng đều.
  Đối với hầu hết các tế bào, quá trình ly giải bằng siêu âm sẽ hoàn tất sau 2–4 chu kỳ xử lý siêu âm, mỗi chu kỳ 10 giây.
• Sau khi xử lý siêu âm, lấy đầu sonotrode ra khỏi mẫu. Các mẫu nên được ủ trên đá trong 5 min. Sau đó, ly tâm ở 10.000 x g trong 20 min để thu các mảnh vụn thành cặn. Chuyển dịch nổi sang một ống ly tâm vi lượng mới. Ghi nhãn các chất phân tích và bảo quản ở -20°C.
• Có thể làm sạch đầu sonotrode siêu âm bằng cách lau kỹ bằng cồn hoặc xử lý siêu âm trong cốc có chứa cồn, ví dụ: ethanol 70%. Tất cả các đầu dò siêu âm làm từ titan đều có thể được tiệt trùng bằng nồi hấp.

• Rửa mô bằng PBS lạnh như đá (0,01M, pH=7,4) để loại bỏ triệt để lượng máu tan huyết dư thừa.
• Cân mô (thận, tim, phổi, lách, v.v.) và nghiền mô thành các mảnh nhỏ, sau đó đồng nhất hóa trong PBS. Thể tích PBS cần dùng phụ thuộc vào khối lượng mô. Theo quy tắc kinh nghiệm, 1g mô cần khoảng 9mL PBS. Nên thêm một lượng chất ức chế protease vào PBS. (Có thể thay thế bằng RIPA hoặc dung dịch đệm ly giải nhược trương có chứa hỗn hợp chất ức chế protease và phosphatase.)
• Tùy thuộc vào kích thước mô, xử lý bằng máy trộn vortex trong thời gian ngắn (khoảng 1–2 min., theo các xung 15 giây) có thể hữu ích cho việc tiền xử lý mô.
• Lắp đầu vi mô, ví dụ: S26d2, vào thiết bị siêu âm của bạn. Đặt ống mẫu chứa mô vào bể nước đá.
• Xử lý siêu âm mẫu bằng thiết bị siêu âm của bạn, ví dụ: UP200St (biên độ 80%), trong 1 min. ở chế độ xung (bật 15 giây, tạm dừng 15 giây). Giữ mẫu trong bể nước đá.
• Sau đó, các dịch đồng nhất được ly tâm để thu các phân đoạn cụ thể (bào tương, nhân, ty thể hoặc lysosome) nhằm làm giàu protein phục vụ phân tích. Dịch nổi được thu hồi bằng cách ly tâm mẫu trong 5 phút ở 5000×g.

Kiểm soát nhiệt độ đáng tin cậy trong quá trình xử lý siêu âm

Nhiệt độ là yếu tố then chốt ảnh hưởng đến quá trình, đặc biệt quan trọng khi xử lý các mẫu sinh học, ví dụ: để ngăn ngừa sự phân hủy protein do nhiệt. Giống như mọi kỹ thuật chuẩn bị mẫu bằng cơ học, xử lý siêu âm sinh ra nhiệt. Tuy nhiên, nhiệt độ mẫu có thể được kiểm soát tốt khi sử dụng các thiết bị của Hielscher Ultrasonics. Chúng tôi giới thiệu nhiều phương án để theo dõi và kiểm soát nhiệt độ mẫu trong quá trình chuẩn bị mẫu trước phân tích bằng thiết bị siêu âm dạng đầu dò hoặc VialTweeter.

1. Theo dõi nhiệt độ mẫu: Tất cả các bộ xử lý siêu âm kỹ thuật số của Hielscher đều được trang bị phần mềm thông minh và cảm biến nhiệt độ có thể cắm rời. Cắm cảm biến nhiệt độ vào thiết bị siêu âm (ví dụ: UP200Ht, UP200St, VialTweeter, thiết bị siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP) và đưa đầu cảm biến nhiệt độ vào một trong các ống mẫu. Thông qua màn hình cảm ứng màu kỹ thuật số, bạn có thể thiết lập một khoảng nhiệt độ cụ thể cho quá trình xử lý siêu âm mẫu trong menu của bộ xử lý siêu âm. Thiết bị siêu âm sẽ tự động dừng khi đạt nhiệt độ tối đa và tạm dừng cho đến khi nhiệt độ mẫu giảm xuống giá trị thấp hơn của khoảng nhiệt độ ∆ đã thiết lập. Sau đó, quá trình xử lý siêu âm tự động bắt đầu lại. Tính năng thông minh này ngăn ngừa sự phân hủy do nhiệt.
2. Đối với thiết bị siêu âm đa mẫu VialTweeter, khối titan giữ các ống mẫu có thể được làm lạnh trước. Đặt khối VialTweeter (chỉ đầu sonotrode, không kèm bộ chuyển đổi!) vào tủ lạnh hoặc tủ đông để làm lạnh trước khối titan, giúp trì hoãn sự tăng nhiệt độ trong mẫu. Nếu có thể, bản thân mẫu cũng có thể được làm lạnh trước.
3. Sử dụng bể nước đá hoặc đá khô để làm mát trong quá trình xử lý siêu âm. Đặt các ống mẫu vào bể nước đá trong quá trình xử lý siêu âm. Đối với VialTweeter, sử dụng một khay nông chứa đầy đá khô và đặt VialTweeter lên đá khô để nhiệt có thể tản đi nhanh chóng.

Khách hàng trên toàn thế giới sử dụng các thiết bị siêu âm dạng đầu dò của Hielscher cũng như các thiết bị xử lý siêu âm nhiều mẫu VialTweeter và UIP400MTP cho công việc chuẩn bị mẫu hằng ngày trong các phòng thí nghiệm sinh học, hóa sinh, y học và lâm sàng. Nhờ phần mềm thông minh và chức năng kiểm soát nhiệt độ của các thiết bị xử lý siêu âm Hielscher, nhiệt độ được kiểm soát đáng tin cậy và tránh được sự phân hủy mẫu do nhiệt. Chuẩn bị mẫu bằng siêu âm với các giải pháp siêu âm của Hielscher mang lại kết quả có độ tin cậy và khả năng tái lập cao!
Đọc thêm về xử lý siêu âm với năng suất xử lý mẫu cao bằng thiết bị siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP dùng cho các xét nghiệm!