Chuẩn bị mẫu siêu âm cho các xét nghiệm ELISA
Các xét nghiệm như ELISA được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán trong ống nghiệm, phát hiện protein liên quan đến bệnh và kiểm soát chất lượng (ví dụ: theo dõi các chất gây dị ứng thực phẩm). Chuẩn bị mẫu siêu âm là một kỹ thuật nhanh chóng, đáng tin cậy và có thể tái tạo để lyse tế bào và cô lập protein nội bào, DNA, RNA và bào quan. Hielscher Ultrasonics cung cấp các giải pháp siêu âm khác nhau để chuẩn bị thuận tiện cho các mẫu đơn, nhiều lọ cũng như cho các tấm microtiter và tấm 96 giếng.
ELISA – Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme
ELISA là viết tắt của xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme và là một kỹ thuật phân tích sinh hóa được sử dụng rộng rãi thuộc loại xét nghiệm liên kết phối tử. Trong ELISA, một mẫu chất lỏng được thêm vào pha rắn đứng yên với các đặc tính liên kết đặc biệt. Thông thường, pha rắn tĩnh được áp dụng làm lớp phủ cho tấm giếng hoặc tấm ELISA. Sau đó, các thuốc thử lỏng khác nhau được thêm vào tuần tự, ủ và rửa sạch, để cuối cùng sự thay đổi quang học (ví dụ: phát triển màu sắc bởi sản phẩm của phản ứng enzyme) xảy ra trong chất lỏng cuối cùng trong giếng. Sự thay đổi quang học cho phép đo số lượng chất phân tích bằng cái gọi là định lượng “đọc sách". Để đọc định lượng, máy đo quang phổ, huỳnh quang kế hoặc máy đo độ sáng được sử dụng để phát hiện và đo cường độ của ánh sáng truyền qua. Độ nhạy phát hiện bị ảnh hưởng bởi sự khuếch đại tín hiệu trong các phản ứng phân tích. Vì các phản ứng enzyme được nghiên cứu kỹ lưỡng và các quá trình khuếch đại đáng tin cậy, các enzyme được sử dụng để tạo ra tín hiệu. Các enzyme được liên kết với các thuốc thử phát hiện theo tỷ lệ cố định để cho phép định lượng chính xác, điều này cũng giải thích tên xét nghiệm hấp thụ miễn dịch "liên kết enzyme".
Vì các xét nghiệm ELISA được thực hiện trong các tấm microtiter / tấm 96 giếng, nó được gọi là kỹ thuật xét nghiệm dựa trên tấm và được sử dụng ví dụ như trong chẩn đoán lâm sàng trong ống nghiệm, nghiên cứu, phát triển thuốc, v.v. để phát hiện và định lượng kháng thể, peptide, protein và hormone.
Kỹ thuật ELISA thường được sử dụng như một công cụ chẩn đoán trong y học, công nghệ sinh học, bệnh lý thực vật và cũng là một biện pháp kiểm soát chất lượng quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp.
Các đơn vị chuẩn bị mẫu siêu âm VialTweeter được sử dụng để ly giải tế bào và chiết xuất protein trước khi xét nghiệm ELISA
Chuẩn bị mẫu siêu âm trước khi ELISA
Trước khi xét nghiệm ELISA có thể được thực hiện, các mẫu yêu cầu các bước chuẩn bị như ly giải tế bào và chiết xuất protein nội bào, DNA, RNA, v.v. Ưu điểm của ly giải tế bào siêu âm và phân lập protein là hiệu quả cao, độ tin cậy và khả năng tái tạo. Tất cả những yếu tố này đều quan trọng để có được kết quả chẩn đoán và nghiên cứu chất lượng cao
- Xử lý mẫu đồng nhất
- Ly giải hoàn toàn
- Chiết xuất protein hoàn chỉnh (ví dụ: kháng thể, DNA)
- Thích nghi tối ưu với loại tế bào
- Đối với bất kỳ kích thước mẫu nào
- có thể tái sản xuất
- Kiểm soát nhiệt độ
- Giao thức dữ liệu tự động trên thẻ SD
Giao thức ly giải tế bào siêu âm Pre-ELISA
- Đối với nuôi cấy tế bào: Trước khi ly giải tế bào siêu âm, các tế bào ly tâm trong 5 phút ở 270 x g trong máy ly tâm. Loại bỏ chất siêu sinh bằng cách hút và đình chỉ các tế bào trong 30 - 100 μL dung dịch đệm RIMA. Sau đó, ủ viên tế bào trên đá trong 30 phút.
- Bây giờ, mẫu tế bào đã sẵn sàng để ly giải siêu âm:
Sử dụng ultrasonicator loại đầu dò (ví dụ: UP200Ht với đầu dò S26d2) hoặc thiết bị đa mẫu siêu âm (ví dụ: VialTweeter để sonication đồng thời lên đến 10 lọ hoặc UIP400MPT cho tấm microtiter / tấm 96 giếng) tùy thuộc vào số lượng mẫu bạn cần chuẩn bị.
Đối với sonication kiểu đầu dò của một mẫu duy nhất, đặt các tế bào trong ống vi ly tâm 1,5 mL. - Đặt trước thời gian siêu âm của bạn, tổng năng lượng đầu vào, chế độ chu kỳ và / hoặc giới hạn nhiệt độ trong menu kỹ thuật số của ultrasonicator. Điều này đảm bảo sonication có độ tin cậy cao và lặp lại.
- Inset sonotrode và bật thiết bị siêu âm. Nhẹ nhàng di chuyển đầu siêu âm của đầu dò siêu âm qua mẫu để sonicate mẫu đồng đều.
Đối với hầu hết các tế bào, ly giải siêu âm sẽ được hoàn thành sau 2 -4 chu kỳ sonication 10 giây. - Sau khi sonication, loại bỏ sonotrode từ mẫu. Các mẫu nên được ủ trên đá trong 5 phút. Sau đó, ly tâm ở 10.000 x g trong 20 phút để tạo viên cho các mảnh vụn. Chuyển các chất siêu nhiên sang một ống vi ly tâm mới. Dán nhãn các chất phân tích và bảo quản ở -20 ° C.
- Sonotrode siêu âm có thể được làm sạch bằng cách lau nó đúng cách bằng cồn hoặc sonicate trong cốc chứa đầy cồn, ví dụ như ethanol 70%. Tất cả các đầu dò siêu âm làm từ titan đều có thể hấp tiệt trùng.
Chiết xuất protein từ tế bào E.coli với đầu dò siêu âm UP200St
- Rửa sạch mô bằng PBS lạnh (0,01M, pH = 7,4) để loại bỏ máu tán huyết dư thừa kỹ lưỡng.
- Cân các mô (thận, tim, phổi, lá lách, v.v.) và nghiền nó thành những mảnh nhỏ, được đồng nhất hóa trong PBS. Khối lượng PBS cần thiết có liên quan đến trọng lượng của mô. Theo nguyên tắc thông thường, 1g mô cần khoảng 9mL PBS. Nên thêm một số chất ức chế protease vào PBS. (RIPA hoặc chất đệm ly giải hypotonic có chứa protease và cocktail ức chế phosphatase có thể được sử dụng thay thế.)
- Tùy thuộc vào kích thước mô, điều trị xoáy ngắn (khoảng 1-2 phút trong xung 15 giây) có thể hữu ích để điều trị trước mô.
- Gắn một micro-tip, ví dụ như S26d2, để siêu âm của bạn. Đặt ống mẫu với khăn giấy vào bồn nước đá.
- Sonicate mẫu với ultrasonicator của bạn, ví dụ UP200St (biên độ 80%) cho 1 phút trong chế độ xung (15 giây trên, 15 giây tạm dừng). Giữ mẫu trong bồn nước đá.
- Các homogenat sau đó được ly tâm để thu được các nhóm cụ thể (cytosolic, nuclear, ty thể hoặc lysosomal) để làm giàu protein để phân tích. Bằng cách ly tâm mẫu trong 5 phút ở 5000×g, supernatant được lấy ra.
Sonotrode MTP-24-8-96 có tám đầu dò siêu âm để sonication các giếng của các tấm microtiter.
Kiểm soát nhiệt độ đáng tin cậy trong quá trình Sonication
Nhiệt độ là một yếu tố ảnh hưởng đến quá trình quan trọng đặc biệt quan trọng đối với việc xử lý các mẫu sinh học, ví dụ như để ngăn chặn sự thoái hóa nhiệt của protein. Như tất cả các kỹ thuật chuẩn bị mẫu cơ học, sonication tạo ra nhiệt. Tuy nhiên, nhiệt độ của các mẫu có thể được kiểm soát tốt khi sử dụng các thiết bị siêu âm Hielscher. Chúng tôi trình bày cho bạn các tùy chọn khác nhau để theo dõi và kiểm soát nhiệt độ của các mẫu của bạn trong khi chuẩn bị chúng với một ultrasonicator loại thăm dò hoặc VialTweeter trước khi phân tích.
- Theo dõi nhiệt độ mẫu: Tất cả các bộ vi xử lý siêu âm kỹ thuật số Hielscher đều được trang bị phần mềm thông minh và cảm biến nhiệt độ có thể cắm được. Cắm cảm biến nhiệt độ vào thiết bị siêu âm (ví dụ: UP200Ht, UP200St, LọTweeter, Sonicator tấm đa giếng UIP400MTP) và chèn đầu của cảm biến nhiệt độ vào một trong các ống mẫu. Thông qua màn hình cảm ứng màu kỹ thuật số, bạn có thể đặt trong menu của bộ xử lý siêu âm một phạm vi nhiệt độ cụ thể cho sonication mẫu của bạn. Ultrasonicator sẽ tự động dừng khi đạt đến nhiệt độ tối đa và tạm dừng cho đến khi nhiệt độ mẫu giảm xuống giá trị thấp hơn của ∆ nhiệt độ cài đặt. Sau đó, sonication bắt đầu tự động một lần nữa. Tính năng thông minh này ngăn chặn sự xuống cấp do nhiệt.
- Về đơn vị đa mẫu siêu âm VialTweeter, khối titan, giữ các ống mẫu, có thể được làm mát trước. Đặt khối VialTweeter (chỉ sonotrode mà không có đầu dò!) vào tủ lạnh hoặc tủ đông để làm mát trước khối titan giúp trì hoãn sự gia tăng nhiệt độ trong mẫu. Nếu có thể, bản thân mẫu cũng có thể được làm lạnh trước.
- Sử dụng bồn nước đá hoặc đá khô để làm mát trong quá trình sonication. Đặt (các) ống mẫu của bạn trong quá trình sonication vào bồn nước đá. Đối với VialTweeter, sử dụng một khay nông chứa đầy đá khô và đặt VialTweeter lên đá khô để nhiệt có thể nhanh chóng tiêu tan.
Khách hàng trên toàn thế giới sử dụng máy siêu âm loại thăm dò Hielscher cũng như các đơn vị sonication đa mẫu VialTweeter và UIP400MTP cho công việc chuẩn bị mẫu hàng ngày của họ trong các phòng thí nghiệm sinh học, sinh hóa, y tế và lâm sàng. Phần mềm thông minh và kiểm soát nhiệt độ của bộ xử lý Hielscher, nhiệt độ được kiểm soát đáng tin cậy và tránh suy thoái mẫu do nhiệt. Chuẩn bị mẫu siêu âm với các giải pháp siêu âm Hielscher mang lại kết quả có độ tin cậy cao và tái tạo!
Đọc thêm về sonication thông lượng cao bằng cách sử dụng UIP400MTP sonicator tấm đa giếng cho các xét nghiệm!
Liên hệ với chúng tôi! / Hãy hỏi chúng tôi!
Hielscher Ultrasonics sản xuất homogenizers siêu âm hiệu suất cao cho các ứng dụng trộn, phân tán, nhũ tương hóa và khai thác trên phòng thí nghiệm, thí điểm và quy mô công nghiệp.
Văn học / Tài liệu tham khảo
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Sự thật đáng biết
Có những loại ELISA nào?
Có một số loại ELISA, được phân biệt bởi nguyên tắc hoạt động của chúng. Chúng được gọi là ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, ELISA sandwich, ELISA cạnh tranh và ELISA ngược. Dưới đây, chúng tôi trình bày cho bạn một cái nhìn tổng quan về các loại ELISA khác nhau và các đặc điểm và sự khác biệt chính của chúng.
ELISA có thể được chạy ở định dạng định tính hoặc định lượng. Kết quả định tính cung cấp kết quả dương tính hoặc âm tính đơn giản, trong khi trong ELISA định lượng, mật độ quang học (OD) của mẫu được so sánh với đường cong chuẩn, thường là pha loãng nối tiếp dung dịch nồng độ đã biết của phân tử đích.
ELISA trực tiếp
ELISA trực tiếp là dạng xét nghiệm đơn giản nhất của Elisa, trong đó chỉ sử dụng kháng thể chính có nhãn enzyme và không cần kháng thể thứ cấp. Kháng thể chính được dán nhãn enzyme liên kết trực tiếp với mục tiêu, tức là kháng nguyên. Dung dịch kháng nguyên đệm được thêm vào mỗi giếng của tấm microtiter (thường là tấm 96 giếng, tấm ELISA), nơi bám dính vào bề mặt nhựa thông qua các tương tác điện tích. Khi enzyme liên kết với kháng thể chính phản ứng với chất nền của nó, nó tạo ra tín hiệu nhìn thấy được có thể đo được thông qua máy đo quang phổ, huỳnh quang kế hoặc máy đo độ sáng.
ELISA gián tiếp
Đối với xét nghiệm ELISA gián tiếp, cần có cả kháng thể chính và kháng thể phụ. Tuy nhiên, trái ngược với ELISA trực tiếp, không phải kháng thể chính, mà là kháng thể thứ cấp được dán nhãn bằng enzyme. Kháng nguyên được cố định vào tấm giếng và liên kết bởi kháng thể chính. Sau đó, kháng thể thứ cấp được dán nhãn enzyme liên kết với kháng thể chính. Cuối cùng, enzyme liên kết với kháng thể thứ cấp phản ứng với chất nền của nó để tạo ra tín hiệu nhìn thấy có thể phát hiện được.
Sandwich ELISA
Trong khi trong các xét nghiệm ELISA trực tiếp và gián tiếp, kháng nguyên được cố định và phủ lên bề mặt của tấm giếng, trong bánh sandwich ELISA, kháng thể được cố định vào bề mặt nhựa của tấm ELISA. Các kháng thể cố định trong ELISA được gọi là kháng thể bắt. Ngoài các kháng thể bắt giữ, trong bánh sandwich ELISA còn được gọi là kháng thể phát hiện được yêu cầu. Các kháng thể phát hiện bao gồm một kháng thể phát hiện chính không được dán nhãn và một kháng thể phát hiện thứ cấp được dán nhãn enzyme.
Theo từng bước, kháng nguyên quan tâm liên kết với kháng thể bắt giữ cố định vào đĩa. Sau đó, kháng thể phát hiện chính liên kết với kháng nguyên. Sau đó, kháng thể phát hiện thứ cấp liên kết với kháng thể phát hiện chính. Trong bước phản ứng cuối cùng, enzyme phản ứng với chất nền của nó để tạo ra tín hiệu có thể nhìn thấy có thể được phát hiện bằng quang học.
ELISA cạnh tranh
ELISA cạnh tranh, còn được gọi là ELISA ức chế, là loại ELISA phức tạp nhất vì nó liên quan đến việc sử dụng kháng nguyên ức chế. Mỗi định dạng trong số ba định dạng, trực tiếp, gián tiếp và sandwich ELISA, có thể được điều chỉnh theo định dạng ELISA cạnh tranh. Trong ELISA cạnh tranh, kháng nguyên ức chế và kháng nguyên quan tâm cạnh tranh để liên kết với kháng thể chính.
Đối với ELISA cạnh tranh, kháng thể không được dán nhãn được ủ với sự có mặt của kháng nguyên của nó, tức là mẫu. Những phức hợp kháng thể / kháng nguyên liên kết này sau đó được thêm vào giếng phủ kháng nguyên.
Tấm được rửa sạch, để các kháng thể không liên kết được loại bỏ. ELISA cạnh tranh có tên của nó do thực tế là càng nhiều kháng nguyên trong mẫu, càng có nhiều phức hợp kháng nguyên-kháng thể được hình thành. Điều này có nghĩa là, có ít kháng thể không liên kết có sẵn để liên kết với kháng nguyên trong giếng và các kháng nguyên phải cạnh tranh cho một kháng thể có sẵn. Một kháng thể thứ cấp, phù hợp với kháng thể chính, được thêm vào. Kháng thể thứ hai này được liên kết với enzyme. Khi chất nền được thêm vào, các enzyme còn lại tạo ra tín hiệu nhiễm sắc thể hoặc huỳnh quang.
Tại thời điểm này, phản ứng được dừng lại để tránh sự bão hòa cuối cùng của tín hiệu.
Một số bộ dụng cụ ELISA cạnh tranh bao gồm kháng nguyên liên kết enzyme thay vì kháng thể liên kết enzyme. Kháng nguyên được dán nhãn cạnh tranh cho các vị trí liên kết kháng thể chính với kháng nguyên mẫu (không được dán nhãn). Càng ít kháng nguyên trong mẫu, càng giữ lại nhiều kháng nguyên được dán nhãn trong giếng và tín hiệu càng mạnh.
Đảo ngược ELISA
ELISA ngược không sử dụng các tấm tốt, nhưng để lại các kháng nguyên lơ lửng trong chất lỏng thử nghiệm. Xét nghiệm ELISA ngược đo lượng kháng thể liên kết thông qua kháng nguyên. Nó được phát triển đặc biệt để phát hiện và điều tra protein bao bọc virus West Nile và cách nó có thể tìm thấy các kháng thể đặc hiệu của virus.
Những dấu hiệu enzyme nào được sử dụng cho ELISA?
Danh sách dưới đây cung cấp các dấu hiệu enzyme phổ biến nhất được sử dụng trong các xét nghiệm ELISA, cho phép đo kết quả xét nghiệm sau khi hoàn thành.
- OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) biến hổ phách để phát hiện HRP (Horseradish Peroxidase), thường được sử dụng như một protein liên hợp.
- TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine) chuyển sang màu xanh khi phát hiện HRP và chuyển sang màu vàng sau khi bổ sung axit sulfuric hoặc phosphoric.
- ABTS (2,2′-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-muối diammonium) chuyển sang màu xanh lá cây khi phát hiện HRP.
- PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt) chuyển sang màu vàng khi phát hiện phosphatase kiềm.