Công nghệ siêu âm Hielscher

Chuẩn bị mẫu siêu âm cho khảo nghiệm ELISA

Các xét nghiệm như ELISA được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán trong ống nghiệm, phát hiện protein liên quan đến bệnh và kiểm soát chất lượng (ví dụ: theo dõi các chất gây dị ứng thực phẩm). Chuẩn bị mẫu siêu âm là một kỹ thuật nhanh chóng, đáng tin cậy và tái sản xuất để lyse tế bào và cô lập protein nội bào, DNA, RNA và bào quan. Hielscher Ultrasonics cung cấp các giải pháp siêu âm khác nhau để chuẩn bị thuận tiện cho các mẫu đơn, nhiều lọ cũng như cho các tấm microtiter và tấm 96 tốt.

Elisa – Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme

ELISA là viết tắt của xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme và là một kỹ thuật phân tích sinh hóa được sử dụng rộng rãi của loại xét nghiệm liên kết đơn chi. Trong ELISA, một mẫu chất lỏng được thêm vào một pha rắn cố định với các tính chất ràng buộc đặc biệt. Thông thường, pha rắn cố định được áp dụng như lớp phủ cho một tấm giếng hoặc tấm ELISA. Sau đó, các thuốc thử lỏng khác nhau được thêm vào tuần tự, ủ và rửa sạch, để cuối cùng thay đổi quang học (ví dụ: phát triển màu sắc bằng sản phẩm của phản ứng enzym) xảy ra trong chất lỏng cuối cùng trong giếng. Sự thay đổi quang học cho phép đo số lượng phân tích bằng cái gọi là định lượng “đọc sách". Đối với việc đọc định lượng, máy quang phổ, máy đo huỳnh quang hoặc máy đo độ sáng được sử dụng để phát hiện và đo cường độ của ánh sáng truyền đi. Độ nhạy phát hiện bị ảnh hưởng bởi sự khuếch đại tín hiệu trong các phản ứng phân tích. Kể từ khi phản ứng enzyme được điều tra tốt và quá trình khuếch đại đáng tin cậy, enzyme được sử dụng để tạo ra các tín hiệu. Các enzym được liên kết với các thuốc thử phát hiện theo tỷ lệ cố định để cho phép định lượng chính xác, điều này cũng giải thích tên "xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme".
Khi xét nghiệm ELISA được thực hiện trong các tấm microtiter / tấm 96 giếng, nó được gọi là kỹ thuật khảo nghiệm dựa trên tấm và được sử dụng ví dụ như trong chẩn đoán lâm sàng trong ống nghiệm, nghiên cứu, phát triển thuốc vv để phát hiện và định lượng kháng thể, peptide, protein, và kích thích tố.
Kỹ thuật ELISA thường được sử dụng như một công cụ chẩn đoán trong y học, công nghệ sinh học, bệnh lý thực vật và cũng là một phép đo kiểm soát chất lượng quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp.

Hoàn thành thiết lập VialTweeter: VialTweeter sonotrode tại bộ xử lý siêu âm UP200St

Đơn vị chuẩn bị mẫu siêu âm VialTweeter được sử dụng để lysis tế bào và chiết xuất protein trước khi xét nghiệm ELISA

Yêu cầu thông tin




Lưu ý của chúng tôi Chính sách bảo mật.


Chuẩn bị mẫu siêu âm trước ELISA

Trước khi xét nghiệm ELISA có thể được thực hiện, các mẫu yêu cầu các bước chuẩn bị như lysis tế bào và chiết xuất protein nội bào, DNA, RNA, v.v. Ưu điểm của lysis tế bào siêu âm và cách ly protein là hiệu quả cao, độ tin cậy và khả năng tái tạo của nó. Tất cả những yếu tố này rất quan trọng để có được chẩn đoán và kết quả nghiên cứu chất lượng cao

Ưu điểm của siêu âm Lysis trước ELISA

  • Điều trị mẫu đồng nhất
  • Hoàn thành công việc
  • Chiết xuất protein hoàn chỉnh (ví dụ: kháng thể, DNA)
  • Thích ứng tối ưu với loại tế bào
  • Đối với bất kỳ kích thước mẫu nào
  • tái sản xuất
  • Kiểm soát nhiệt độ
  • Giao thức dữ liệu tự động trên thẻ SD

Giao thức cho Pre-ELISA Siêu âm Cell Lysis

Probe-loại insonifier UP200St cho lysis

  • Đối với nuôi cấy tế bào: Trước khi lysis tế bào siêu âm, các tế bào ly tâm trong 5 phút ở 270 x g trong một microcentrifuge. Loại bỏ các supernatant bởi hít sặc và resuspend tế bào trong 30 – 100 μL của RIPA đệm. Sau đó, ủ viên tế bào trên băng trong 30 phút.
  • Bây giờ, mẫu tế bào đã sẵn sàng cho siêu âm lysis:
    Sử dụng ultrasonicator loại đầu dò (ví dụ: UP200Ht với đầu dò S26d2) hoặc một thiết bị đa mẫu siêu âm (ví dụ: VialTweeter cho sonication đồng thời lên đến 10 lọ hoặc UIP400MPT cho tấm microtiter / tấm 96 giếng) tùy thuộc vào số lượng mẫu bạn cần chuẩn bị.
    Đối với sonication loại đầu dò của một mẫu duy nhất, đặt các tế bào trong ống microcentrifuge 1,5 mL.
  • Đặt trước thời gian siêu âm của bạn, tổng năng lượng đầu vào, chế độ chu kỳ và / hoặc giới hạn nhiệt độ trong menu kỹ thuật số của ultrasonicator. Điều này đảm bảo sonication có độ tin cậy cao và khả năng lặp lại.
  • Inset sonotrode và chuyển đổi các thiết bị siêu âm trên. Nhẹ nhàng di chuyển đầu siêu nhỏ của đầu dò siêu âm qua mẫu để sonicate mẫu thống nhất.
    Đối với hầu hết các tế bào, siêu âm lysis sẽ được hoàn thành sau 2 -4 chu kỳ 10 giây sonication.
  • Sau khi sonication, loại bỏ sonotrode từ mẫu. Các mẫu nên được ủ trên băng trong 5 phút. Sau đó, máy ly tâm ở 10.000 x g trong 20 phút để viên các mảnh vụn. Chuyển các supernatants vào một ống microcentrifuge mới. Dán nhãn các phân tích và lưu trữ ở -20 °C.
  • Sonotrode siêu âm có thể được làm sạch bằng cách lau nó đúng cách bằng rượu hoặc sonicate trong cốc chứa đầy rượu, ví dụ như 70% ethanol. Tất cả các đầu dò siêu âm làm từ titan đều có thể hấp được.

Đối với mô Homogenates:

  • Rửa sạch mô bằng PBS lạnh (0,01M, pH = 7,4) để loại bỏ máu tan máu dư thừa triệt để.
  • Cân mô (thận, tim, phổi, lá lách, vv) và macerate nó thành miếng nhỏ, được đồng nhất trong PBS. Thể tích PBS cần thiết có liên quan đến trọng lượng của mô. Như một quy luật của ngón tay cái, 1g mô đòi hỏi khoảng 9mL PBS. Đó là khuyến cáo để thêm một số chất ức chế protease để PBS. (RIPA hoặc bộ đệm lysis hypotonic có chứa protease và cocktail ức chế phosphatase có thể được sử dụng cách khác.)
  • Tùy thuộc vào kích thước mô, một điều trị xoáy ngắn (khoảng 1-2 phút trong 15 giây xung) có thể hữu ích để điều trị trước mô.
  • Gắn kết một micro-tip, ví dụ như S26d2, để ultrasonicator của bạn. Đặt ống mẫu với các mô trong một bồn tắm nước đá.
  • Sonicate mẫu với ultrasonicator của bạn, ví dụ như UP200St (80% biên độ) cho 1 phút trong chế độ xung (15sec trên, 15sec tạm dừng). Giữ mẫu trong bồn nước đá.
  • Các homogenates sau đó được ly tâm để có được hồ bơi cụ thể (cytosolic, hạt nhân, ti thể hoặc lysosomal) để làm phong phú thêm protein để phân tích. Bằng cách ly tâm mẫu trong 5 phút ở 5000×g, siêu nhiên được lấy ra.
Sonotrode MTP-24-8-96 có tám đầu dò siêu âm cho sonication của các giếng của tấm microtiter.

Sonotrode MTP-24-8-96 có tám đầu dò siêu âm cho sonication của các giếng của tấm microtiter.

Kiểm soát nhiệt độ đáng tin cậy trong sonication

Nhiệt độ là một yếu tố ảnh hưởng đến quá trình quan trọng đặc biệt quan trọng để điều trị các mẫu sinh học, ví dụ như để ngăn chặn sự suy thoái nhiệt của protein. Như tất cả các kỹ thuật chuẩn bị mẫu cơ khí, sonication tạo ra nhiệt. Tuy nhiên, nhiệt độ của các mẫu có thể được kiểm soát tốt khi sử dụng các thiết bị Hielscher Ultrasonics. Chúng tôi trình bày cho bạn các tùy chọn khác nhau để theo dõi và kiểm soát nhiệt độ của các mẫu của bạn trong khi chuẩn bị chúng với một ultrasonicator loại đầu dò hoặc VialTweeter trước khi phân tích.

  1. Theo dõi nhiệt độ mẫu: Tất cả các bộ vi xử lý siêu âm kỹ thuật số Hielscher được trang bị một phần mềm thông minh và cảm biến nhiệt độ có thể cắm. Cắm cảm biến nhiệt độ vào thiết bị siêu âm (ví dụ: UP200Ht, UP200ST, VialTweeter, UIP400MTP) và lắp đầu cảm biến nhiệt độ vào một trong các ống mẫu. Thông qua màn hình cảm ứng màu kỹ thuật số, bạn có thể đặt trong menu của bộ xử lý siêu âm một phạm vi nhiệt độ cụ thể cho sonication mẫu của bạn. Ultrasonicator sẽ tự động dừng lại khi nhiệt độ tối đa đạt đến và tạm dừng cho đến khi nhiệt độ mẫu xuống đến giá trị thấp hơn của nhiệt độ thiết lập ∆. Sau đó, sonication bắt đầu tự động một lần nữa. Tính năng thông minh này ngăn ngừa suy thoái do nhiệt gây ra.
  2. Về đơn vị đa mẫu siêu âm VialTweeter, khối titan, giữ các ống mẫu, có thể được làm mát trước. Đặt khối VialTweeter (chỉ sonotrode mà không cần đầu dò!) vào tủ lạnh hoặc tủ đông để làm mát trước khối titan giúp trì hoãn sự gia tăng nhiệt độ trong mẫu. Nếu có thể, bản thân mẫu cũng có thể được làm mát trước.
  3. Sử dụng một bồn tắm nước đá hoặc đá khô để làm mát trong sonication. Đặt (các) ống mẫu của bạn trong khi sonication vào một bồn tắm nước đá. Đối với VialTweeter, sử dụng một khay nông chứa đầy đá khô và đặt VialTweeter trên băng khô để nhiệt có thể nhanh chóng tiêu tan.

Khách hàng trên toàn thế giới sử dụng đầu dò Hielscher-ultrasonicators cũng như các đơn vị sonication đa mẫu VialTweeter và UIP400MTP cho công việc chuẩn bị mẫu hàng ngày của họ trong các phòng thí nghiệm sinh học, sinh hóa, y tế và lâm sàng. Các phần mềm thông minh và kiểm soát nhiệt độ của bộ vi xử lý Hielscher, nhiệt độ được kiểm soát đáng tin cậy và nhiệt gây ra suy thoái mẫu tránh. Chuẩn bị mẫu siêu âm với các giải pháp siêu âm Hielscher mang lại kết quả có độ tin cậy cao và có thể tái sản xuất!

Liên hệ chúng tôi! / Hỏi chúng tôi!

Yêu cầu thêm thông tin

Vui lòng sử dụng mẫu dưới đây để yêu cầu thêm thông tin về bộ vi xử lý siêu âm, ứng dụng và giá cả. Chúng tôi sẽ vui mừng để thảo luận về quá trình của bạn với bạn và để cung cấp cho bạn một hệ thống siêu âm đáp ứng yêu cầu của bạn!










Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

Hielscher Ultrasonics sản xuất hiệu suất cao siêu âm homogenizers cho các ứng dụng trộn, phân tán, nhũ tương và khai thác trên phòng thí nghiệm, thí điểm và quy mô công nghiệp.

Văn học/tài liệu tham khảo



Sự kiện đáng biết

Các loại ELISA

Có một số loại ELISA, được phân biệt theo nguyên tắc hoạt động của chúng. Họ được gọi là ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, sandwich ELISA, ELISA cạnh tranh và ELISA đảo ngược. Dưới đây, chúng tôi trình bày cho bạn một cái nhìn tổng quan về các loại ELISA khác nhau và các đặc điểm và sự khác biệt chính của chúng.
ELISA có thể được chạy ở định dạng định tính hoặc định lượng. Kết quả định tính cung cấp một kết quả dương tính hoặc âm đơn giản, trong khi trong định lượng ELISA mật độ quang học (OD) của mẫu được so sánh với một đường cong tiêu chuẩn, mà thường là một pha loãng nối tiếp của một giải pháp được biết đến nồng độ của các phân tử mục tiêu.

ELISA trực tiếp

ELISA trực tiếp là dạng xét nghiệm đơn giản nhất của Elisa, nơi chỉ sử dụng kháng thể nguyên phát có nhãn enzyme và không cần kháng thể thứ phát. Kháng thể chính được dán nhãn enzyme liên kết trực tiếp với mục tiêu, tức là kháng nguyên. Dung dịch kháng nguyên đệm được thêm vào mỗi giếng của một tấm microtiter (thường là các tấm 96 giếng, tấm ELISA), nơi bám dính vào bề mặt nhựa thông qua các tương tác điện tích. Khi enzyme liên kết với kháng thể chính phản ứng với chất nền của nó, nó tạo ra một tín hiệu có thể nhìn thấy có thể được đo thông qua quang phổ kế, fluorometer hoặc luminometer.

ELISA gián tiếp

Đối với xét nghiệm ELISA gián tiếp, cần có cả kháng thể nguyên phát và kháng thể thứ phát. Tuy nhiên, trái ngược với ELISA trực tiếp, không phải là kháng thể chính, mà là kháng thể thứ cấp được dán nhãn bằng enzyme. Kháng nguyên được cố định vào tấm giếng và bị ràng buộc bởi kháng thể chính. Sau đó, kháng thể thứ cấp có nhãn enzyme liên kết với kháng thể chính. Cuối cùng, enzyme liên kết với kháng thể thứ cấp phản ứng với chất nền của nó để tạo ra một tín hiệu có thể nhìn thấy có thể được phát hiện.

Sandwich ELISA

Trong khi trong các xét nghiệm ELISA trực tiếp và gián tiếp, kháng nguyên được cố định và phủ lên bề mặt của tấm giếng, trong bánh sandwich ELISA kháng thể được cố định vào bề mặt nhựa của tấm ELISA. Các kháng thể cố định trong bánh sandwich ELISA được gọi là kháng thể chụp. Ngoài các kháng thể chụp, trong bánh sandwich ELISA cũng được gọi là kháng thể phát hiện được yêu cầu. Kháng thể phát hiện bao gồm kháng thể phát hiện chính không có nhãn mác và kháng thể phát hiện thứ cấp có nhãn enzyme.
Stepwise, kháng nguyên quan tâm liên kết với kháng thể chụp bất động với tấm. Sau đó, kháng thể phát hiện chính liên kết với kháng nguyên. Sau đó, kháng thể phát hiện thứ cấp liên kết với kháng thể phát hiện chính. Trong bước phản ứng cuối cùng, enzyme phản ứng với chất nền của nó để tạo ra một tín hiệu có thể nhìn thấy có thể được phát hiện bằng quang học.

ELISA cạnh tranh

ELISA cạnh tranh, còn được gọi là ức chế ELISA, là loại ELISA phức tạp nhất vì nó liên quan đến việc sử dụng kháng nguyên ức chế. Mỗi định dạng trong ba định dạng, trực tiếp, gián tiếp và sandwich ELISA, có thể được điều chỉnh theo định dạng ELISA cạnh tranh. Trong ELISA cạnh tranh, kháng nguyên ức chế và kháng nguyên quan tâm cạnh tranh để liên kết với kháng thể chính.
Đối với ELISA cạnh tranh, kháng thể không có nhãn được ủ trong sự hiện diện của kháng nguyên của nó, tức là mẫu. Các phức hợp kháng thể/kháng nguyên liên kết này sau đó được thêm vào giếng phủ kháng nguyên.
Tấm được rửa sạch, để các kháng thể không bị ràng buộc được loại bỏ. ELISA cạnh tranh có tên của nó do thực tế là càng có nhiều kháng nguyên trong mẫu, càng có nhiều phức hợp kháng nguyên-kháng thể được hình thành. Điều này có nghĩa là, có ít kháng thể không ràng buộc có sẵn để liên kết với kháng nguyên trong giếng và các kháng nguyên phải cạnh tranh cho một kháng thể có sẵn. Một kháng thể thứ cấp, phù hợp với kháng thể chính, được thêm vào. Kháng thể thứ hai này được liên kết với enzyme. Khi chất nền được thêm vào, các enzym còn lại tạo ra tín hiệu cromogenic hoặc huỳnh quang.
Tại thời điểm này, phản ứng được dừng lại để tránh độ bão hòa cuối cùng của tín hiệu.
Một số bộ dụng cụ ELISA cạnh tranh bao gồm kháng nguyên liên kết với enzyme thay vì kháng thể liên kết với enzyme. Kháng nguyên có nhãn cạnh tranh cho các vị trí liên kết kháng thể chính với kháng nguyên mẫu (không có nhãn). Càng ít kháng nguyên trong mẫu, kháng nguyên càng được dán nhãn được giữ lại trong giếng và tín hiệu càng mạnh.

Đảo ngược ELISA

Reverse ELISA không sử dụng các tấm tốt, nhưng để lại các kháng nguyên lơ lửng trong chất lỏng thử nghiệm. Xét nghiệm ELISA ngược đo lượng kháng thể bị ràng buộc thông qua kháng nguyên. Nó được phát triển đặc biệt để phát hiện và điều tra protein phong bì virus West Nile và làm thế nào nó có thể tìm thấy kháng thể đặc hiệu với virus.

Dấu hiệu enzym được sử dụng cho ELISA

Danh sách dưới đây cho các dấu hiệu enzym phổ biến nhất được sử dụng trong các xét nghiệm ELISA, cho phép các kết quả của các khảo nghiệm được đo sau khi hoàn thành.

  • OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) biến hổ phách để phát hiện HRP (Horseradish Peroxidase), thường được sử dụng như một protein liên hợp.
  • TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine) chuyển sang màu xanh khi phát hiện HRP và chuyển sang màu vàng sau khi bổ sung axit sulfuric hoặc phosphoric.
  • ABTS (2,2′-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium muối) chuyển sang màu xanh lá cây khi phát hiện HRP.
  • PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt) chuyển sang màu vàng khi phát hiện phosphatase kiềm.