Chuẩn bị mẫu siêu âm cho khảo nghiệm ELISA

Elisa – Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme

ELISA là viết tắt của xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme và là một kỹ thuật phân tích sinh hóa được sử dụng rộng rãi của loại xét nghiệm liên kết đơn chi. Trong ELISA, một mẫu chất lỏng được thêm vào một pha rắn cố định với các tính chất ràng buộc đặc biệt. Thông thường, pha rắn cố định được áp dụng như lớp phủ cho một tấm giếng hoặc tấm ELISA. Sau đó, các thuốc thử lỏng khác nhau được thêm vào tuần tự, ủ và rửa sạch, để cuối cùng thay đổi quang học (ví dụ: phát triển màu sắc bằng sản phẩm của phản ứng enzym) xảy ra trong chất lỏng cuối cùng trong giếng. Sự thay đổi quang học cho phép đo số lượng phân tích bằng cái gọi là định lượng “đọc sách". Đối với việc đọc định lượng, máy quang phổ, máy đo huỳnh quang hoặc máy đo độ sáng được sử dụng để phát hiện và đo cường độ của ánh sáng truyền đi. Độ nhạy phát hiện bị ảnh hưởng bởi sự khuếch đại tín hiệu trong các phản ứng phân tích. Kể từ khi phản ứng enzyme được điều tra tốt và quá trình khuếch đại đáng tin cậy, enzyme được sử dụng để tạo ra các tín hiệu. Các enzym được liên kết với các thuốc thử phát hiện theo tỷ lệ cố định để cho phép định lượng chính xác, điều này cũng giải thích tên "xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme".
Khi xét nghiệm ELISA được thực hiện trong các tấm microtiter / tấm 96 giếng, nó được gọi là kỹ thuật khảo nghiệm dựa trên tấm và được sử dụng ví dụ như trong chẩn đoán lâm sàng trong ống nghiệm, nghiên cứu, phát triển thuốc vv để phát hiện và định lượng kháng thể, peptide, protein, và kích thích tố.
Kỹ thuật ELISA thường được sử dụng như một công cụ chẩn đoán trong y học, công nghệ sinh học, bệnh lý thực vật và cũng là một phép đo kiểm soát chất lượng quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp.

Chuẩn bị mẫu siêu âm trước ELISA

Trước khi xét nghiệm ELISA có thể được thực hiện, các mẫu yêu cầu các bước chuẩn bị như lysis tế bào và chiết xuất protein nội bào, DNA, RNA, v.v. Ưu điểm của lysis tế bào siêu âm và cách ly protein là hiệu quả cao, độ tin cậy và khả năng tái tạo của nó. Tất cả những yếu tố này rất quan trọng để có được chẩn đoán và kết quả nghiên cứu chất lượng cao

Giao thức cho Pre-ELISA Siêu âm Cell Lysis

• Đối với nuôi cấy tế bào: Trước khi lysis tế bào siêu âm, các tế bào ly tâm trong 5 phút ở 270 x g trong một microcentrifuge. Loại bỏ các supernatant bởi hít sặc và resuspend tế bào trong 30 – 100 μL của RIPA đệm. Sau đó, ủ viên tế bào trên băng trong 30 phút.
• Bây giờ, mẫu tế bào đã sẵn sàng cho siêu âm lysis:
  Sử dụng ultrasonicator loại đầu dò (ví dụ: UP200Ht với đầu dò S26d2) hoặc một thiết bị đa mẫu siêu âm (ví dụ: VialTweeter cho sonication đồng thời lên đến 10 lọ hoặc UIP400MPT cho tấm microtiter / tấm 96 giếng) tùy thuộc vào số lượng mẫu bạn cần chuẩn bị.
  Đối với sonication loại đầu dò của một mẫu duy nhất, đặt các tế bào trong ống microcentrifuge 1,5 mL.
• Đặt trước thời gian siêu âm của bạn, tổng năng lượng đầu vào, chế độ chu kỳ và / hoặc giới hạn nhiệt độ trong menu kỹ thuật số của ultrasonicator. Điều này đảm bảo sonication có độ tin cậy cao và khả năng lặp lại.
• Inset sonotrode và chuyển đổi các thiết bị siêu âm trên. Nhẹ nhàng di chuyển đầu siêu nhỏ của đầu dò siêu âm qua mẫu để sonicate mẫu thống nhất.
  Đối với hầu hết các tế bào, siêu âm lysis sẽ được hoàn thành sau 2 -4 chu kỳ 10 giây sonication.
• Sau khi sonication, loại bỏ sonotrode từ mẫu. Các mẫu nên được ủ trên băng trong 5 phút. Sau đó, máy ly tâm ở 10.000 x g trong 20 phút để viên các mảnh vụn. Chuyển các supernatants vào một ống microcentrifuge mới. Dán nhãn các phân tích và lưu trữ ở -20 °C.
• Sonotrode siêu âm có thể được làm sạch bằng cách lau nó đúng cách bằng rượu hoặc sonicate trong cốc chứa đầy rượu, ví dụ như 70% ethanol. Tất cả các đầu dò siêu âm làm từ titan đều có thể hấp được.

Đối với mô Homogenates:

• Rửa sạch mô bằng PBS lạnh (0,01M, pH = 7,4) để loại bỏ máu tan máu dư thừa triệt để.
• Cân mô (thận, tim, phổi, lá lách, vv) và macerate nó thành miếng nhỏ, được đồng nhất trong PBS. Thể tích PBS cần thiết có liên quan đến trọng lượng của mô. Như một quy luật của ngón tay cái, 1g mô đòi hỏi khoảng 9mL PBS. Đó là khuyến cáo để thêm một số chất ức chế protease để PBS. (RIPA hoặc bộ đệm lysis hypotonic có chứa protease và cocktail ức chế phosphatase có thể được sử dụng cách khác.)
• Tùy thuộc vào kích thước mô, một điều trị xoáy ngắn (khoảng 1-2 phút trong 15 giây xung) có thể hữu ích để điều trị trước mô.
• Gắn kết một micro-tip, ví dụ như S26d2, để ultrasonicator của bạn. Đặt ống mẫu với các mô trong một bồn tắm nước đá.
• Sonicate mẫu với ultrasonicator của bạn, ví dụ như UP200St (80% biên độ) cho 1 phút trong chế độ xung (15sec trên, 15sec tạm dừng). Giữ mẫu trong bồn nước đá.
• Các homogenates sau đó được ly tâm để có được hồ bơi cụ thể (cytosolic, hạt nhân, ti thể hoặc lysosomal) để làm phong phú thêm protein để phân tích. Bằng cách ly tâm mẫu trong 5 phút ở 5000×g, siêu nhiên được lấy ra.

Kiểm soát nhiệt độ đáng tin cậy trong sonication

Nhiệt độ là một yếu tố ảnh hưởng đến quá trình quan trọng đặc biệt quan trọng để điều trị các mẫu sinh học, ví dụ như để ngăn chặn sự suy thoái nhiệt của protein. Như tất cả các kỹ thuật chuẩn bị mẫu cơ khí, sonication tạo ra nhiệt. Tuy nhiên, nhiệt độ của các mẫu có thể được kiểm soát tốt khi sử dụng các thiết bị Hielscher Ultrasonics. Chúng tôi trình bày cho bạn các tùy chọn khác nhau để theo dõi và kiểm soát nhiệt độ của các mẫu của bạn trong khi chuẩn bị chúng với một ultrasonicator loại đầu dò hoặc VialTweeter trước khi phân tích.

1. Theo dõi nhiệt độ mẫu: Tất cả các bộ vi xử lý siêu âm kỹ thuật số Hielscher được trang bị một phần mềm thông minh và cảm biến nhiệt độ có thể cắm. Cắm cảm biến nhiệt độ vào thiết bị siêu âm (ví dụ: UP200Ht, UP200ST, VialTweeter, UIP400MTP) và lắp đầu cảm biến nhiệt độ vào một trong các ống mẫu. Thông qua màn hình cảm ứng màu kỹ thuật số, bạn có thể đặt trong menu của bộ xử lý siêu âm một phạm vi nhiệt độ cụ thể cho sonication mẫu của bạn. Ultrasonicator sẽ tự động dừng lại khi nhiệt độ tối đa đạt đến và tạm dừng cho đến khi nhiệt độ mẫu xuống đến giá trị thấp hơn của nhiệt độ thiết lập ∆. Sau đó, sonication bắt đầu tự động một lần nữa. Tính năng thông minh này ngăn ngừa suy thoái do nhiệt gây ra.
2. Về đơn vị đa mẫu siêu âm VialTweeter, khối titan, giữ các ống mẫu, có thể được làm mát trước. Đặt khối VialTweeter (chỉ sonotrode mà không cần đầu dò!) vào tủ lạnh hoặc tủ đông để làm mát trước khối titan giúp trì hoãn sự gia tăng nhiệt độ trong mẫu. Nếu có thể, bản thân mẫu cũng có thể được làm mát trước.
3. Sử dụng một bồn tắm nước đá hoặc đá khô để làm mát trong sonication. Đặt (các) ống mẫu của bạn trong khi sonication vào một bồn tắm nước đá. Đối với VialTweeter, sử dụng một khay nông chứa đầy đá khô và đặt VialTweeter trên băng khô để nhiệt có thể nhanh chóng tiêu tan.

Khách hàng trên toàn thế giới sử dụng đầu dò Hielscher-ultrasonicators cũng như các đơn vị sonication đa mẫu VialTweeter và UIP400MTP cho công việc chuẩn bị mẫu hàng ngày của họ trong các phòng thí nghiệm sinh học, sinh hóa, y tế và lâm sàng. Các phần mềm thông minh và kiểm soát nhiệt độ của bộ vi xử lý Hielscher, nhiệt độ được kiểm soát đáng tin cậy và nhiệt gây ra suy thoái mẫu tránh. Chuẩn bị mẫu siêu âm với các giải pháp siêu âm Hielscher mang lại kết quả có độ tin cậy cao và có thể tái sản xuất!