Cắt DNA siêu âm

Trong quá trình cắt DNA và RNA, các phân tử DNA dài được phân mảnh thành các mảnh nhỏ hơn, một bước quan trọng trong việc chuẩn bị các mẫu để xây dựng thư viện giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS). Cắt DNA siêu âm sử dụng lực xâm thực âm thanh để phá vỡ DNA hoặc RNA thành các mảnh khác nhau, từ 100 bp đến 5 kb. Phương pháp này cho phép kiểm soát chính xác kích thước đoạn, tạo điều kiện tùy chỉnh độ dài DNA mong muốn để có kết quả giải trình tự tối ưu.

Cắt DNA bằng cách sử dụng Ultrasonication

Hielscher Ultrasonics cung cấp các giải pháp dựa trên siêu âm khác nhau để cắt DNA, RNA và nhiễm sắc. Chọn giữa một ultrasonicators loại thăm dò (ví dụ UP100H) cho sonication trực tiếp bằng cách sử dụng một microtip, hoặc sử dụng VialTweeeter hoặc cuphorn siêu âm để chuẩn bị DNA gián tiếp của các mẫu khác nhau cùng một lúc. Hielscher cung cấp thiết bị lý tưởng xem xét nhu cầu của bạn: khi bạn có 1 hoặc tối đa 10 mẫu, thể tích từ microlit đến lít thể tích – Hielscher sonicators sẽ đáp ứng yêu cầu của bạn để chuẩn bị các đoạn DNA, RNA và chromatin ở độ dài phù hợp. Khả năng tái tạo, vận hành dễ dàng và điều khiển chính xác cho phép một thư viện đáng tin cậy cho trình tự thế hệ tiếp theo.
Trái ngược với sự phân mảnh DNA enzyme, cắt siêu âm áp dụng lực cắt cơ học tinh khiết mà không cần thêm bất kỳ hóa chất nào. Bằng cách thiết lập chính xác các thông số quá trình, cắt siêu âm tạo ra các đoạn DNA trọng lượng phân tử cao (plasmid và DNA gen).
Axit nucleic tinh khiết có thể được khuếch đại trước hoặc sau bước phân mảnh.
Các thông số sonication (công suất, chu kỳ xung / nổ, thời gian và nhiệt độ) có thể được kiểm soát một cách an toàn thông qua cài đặt phần mềm.

Giao thức cắt DNA siêu âm

Đối với xét nghiệm kết tủa miễn dịch nhiễm sắc thể

Tóm lại, các tế bào được mạ trong các đĩa có đường kính 60mm (400.000 mỗi đĩa) và được truyền bằng RhoA siRNA (như mô tả); sau 72 giờ, chúng được ủ với formaldehyde (nồng độ cuối cùng, 1%) trong 10 phút ở 37 ° C để liên kết chéo protein với DNA. Phản ứng liên kết ngang được dập tắt bằng cách bổ sung một phần mười thể tích 1,25 mol / L glycine, cho nồng độ cuối cùng là 125 mmol / L. Các tế bào được rửa hai lần bằng PBS lạnh như băng, lơ lửng trong dung dịch đệm xét nghiệm miễn dịch phóng xạ [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholate, 0,1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8,0)] chứa 1 mmol / L phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 Ag / mL aprotinin và 1 Ag / mL pepstatin A, và giữ trên đá trong 30 phút. Sau đó, lysates tế bào được sonicated trên băng với một Hielscher UP200S siêu âm sonicator (3 x 40 s, biên độ 40%, chu kỳ 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) cho đến khi các nhiễm sắc thể liên kết ngang được cắt để tạo ra các đoạn DNA giữa 200 và 1.000 bp. Một phần mười toàn bộ lysate đã được sử dụng để định lượng lượng DNA có trong các mẫu khác nhau và được coi là “tổng DNA đầu vào”. Supernatants được ủ với DNA tinh trùng cá hồi / protein agarose-50% bùn để giảm nền không đặc hiệu. Kết tủa miễn dịch sau đó được thực hiện qua đêm ở 4 ° C với 5 Ag kháng NF-nB p65 (Upstate) hoặc không có kháng thể (kiểm soát âm tính). Những chất siêu nhiên này được bổ sung NaCl 5 mol / L và đun nóng qua đêm ở 65 ° C để hoàn nguyên các liên kết chéo protein-DNA. Các phức hợp miễn dịch được tiếp tục xử lý bằng proteinase K không chứa DNase và RNase, và DNA được tinh chế bằng cách chiết xuất phenol / chloroform và kết tủa ethanol. PCR được thực hiện với các mồi cụ thể tương ứng với một trình tự trong vùng khởi động của gen iNOS ở người (mồi p1: 5 ¶ -GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3 ¶; mồi p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3 ¶). (Doublier và cộng sự, 2008)

Nghiên cứu biểu hiện EGFP

Đối với các nghiên cứu biểu hiện, chủng tái tổ hợp L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Đức) với gen EGFP (Protein huỳnh quang xanh tăng cường), tích hợp ssu nhiễm sắc thể, được trồng trong các môi trường khác nhau như được mô tả trước đây và bổ sung thêm 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Đức). Trong quá trình canh tác, lấy mẫu 1 ml, ly tâm (2000 × g, 20°C, 10 phút) và rửa bằng dung dịch NaCl 0,9%. Viên nén được treo lại trong bộ đệm (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) và tan rã bằng cách sonification với bộ xử lý siêu âm UP400S (ứng dụng năng lượng ∼ 400 Ws). Các mảnh vụn tế bào được loại bỏ bằng cách ly tâm (6000 × g, 4°C, 5 phút) và được phân tích bằng điện di gel natri dodecyl sulfate – polyacrylamide (SDS-PAGE) trong điều kiện khử theo phương pháp Laemmli (1970) với gel polyacralamide 12,5%. Biểu hiện EGFP đã được kiểm tra trong nuôi cấy kích động. (Fritsche và cộng sự 2007)

kết tủa miễn dịch chromatin

Xét nghiệm kết tủa miễn dịch nhiễm sắc được thực hiện bằng ChIP-IT^™ Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với một số sửa đổi. Tóm lại, podocytes người biệt hóa được liên kết chéo với 1% formaldehyde trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Các tế bào được rửa bằng PBS lạnh và phản ứng cố định đã dừng lại bằng cách thêm 0,125 M glycine trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Các tế bào được rửa lại bằng PBS lạnh và cạo từ đĩa. Các tế bào được tạo viên bằng cách ly tâm và lơ lửng trong bộ đệm ly giải. Sau khi ly tâm, các hạt nhân dạng viên được lơ lửng trong bộ đệm cắt, ủ trên băng trong 30 phút và nhiễm sắc thể được cắt bằng sonication, ví dụ: UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Đức) ở 25% công suất 5 xung 20 giây mỗi xung trên băng thành các mảnh khoảng 200–600 bp. Chất nhiễm sắc bị cắt sau đó được ly tâm và chất siêu nhiên được thu thập. Đối với kết tủa miễn dịch, 60 μl chromatin được ủ với 1 μg Sp1 (Công nghệ sinh học Santa Cruz, Santa Cruz, CA, Hoa Kỳ), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Vương quốc Anh) hoặc kháng thể NF-κB p50 (Abcam) hoặc với IgG thỏ (Phòng thí nghiệm Zymed), như một đối chứng âm tính, qua đêm ở 4 ° C với vòng quay nhẹ nhàng. Các phức hợp miễn dịch liên kết với các hạt từ tính được thu thập bằng cách sử dụng giá đỡ từ tính, rửa sạch và các liên kết chéo protein / DNA đã được đảo ngược và DNA được làm loãng để phân tích PCR thời gian thực. (Ristola et al. 2009)

Chuẩn bị DNA EHEC để phân tích mảng chip

Sắp xếp lysates tế bào và DNA chiết xuất
Các viên vi khuẩn lơ lửng trong PBS đến nồng độ cuối cùng mong muốn được xử lý bằng siêu âm gián đoạn UP100H (Hielscher GmbH, Đức) được trang bị microtip MS1 (đường kính 1mm). Tần số hoạt động là 30 kHz và công suất đầu ra hiệu dụng là 100 W. Trong quá trình hoạt động, các mẫu được làm lạnh trong bồn nước đá, trộn và ly tâm. Các mẫu được sử dụng cho các nghiên cứu tế bào học dòng chảy, trong khi để xử lý sau này, các mẫu được xử lý nhiệt (95 ° C, 5 phút). Các lysat tế bào thô được xử lý với hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1). Một thể tích tương đương của hỗn hợp này đã được thêm vào mẫu lysate, dung dịch được xoáy mạnh trong 15 giây và ly tâm ở 15.000 x g trong 2 phút ở nhiệt độ phòng (RT) khoảng 22 ° C. Pha nước trên cùng chứa DNA bộ gen được tách ra cẩn thận và thu thập trong một ống Eppendorf vô trùng mới.
Sau đó, các mẫu được sonicated để phân mảnh DNA. Bước sonication đã được thực hiện trong các điều kiện tương tự như mô tả ở trên. Để đánh giá các hiệu ứng phân mảnh trên DNA gen, các mẫu được phân tích bằng cách sử dụng điện di gel agarose.
(…) Các mẫu được sonicated trước đó trong 2,5 phút đã được trải qua một bước chiết xuất sau khi xử lý nhiệt và ly tâm. DNA được giải phóng được chiết xuất hai lần với hỗn hợp rượu phenol: chloroform: isoamyl, và sau đó phải chịu sonication thứ hai trong 0 - 15 phút. Điện di gel Agarose được sử dụng để xác định sự phân bố kích thước của DNA chịu sự phân mảnh siêu âm sau khai thác (Hình ở trên cùng bên phải). DNA bị phân mảnh cao được thể hiện rõ ràng từ sự hiện diện của phết tế bào DNA thay vì các dải trọng lượng phân tử cao được loại bỏ khỏi các mẫu được sonicated trong 2,5 phút hoặc lâu hơn. Sonication dài hơn dần dần giảm chiều dài mảnh xuống khoảng 150 - 600 bp, và sonication trong 15 phút tiếp tục làm suy giảm các mảnh này, như có thể thấy chủ yếu bởi phần trên của vết bẩn. Do đó, kích thước đoạn DNA trung bình giảm dần theo thời gian siêu âm và điều trị 5 phút cho phép thu được kích thước của các đoạn DNA phù hợp nhất cho các xét nghiệm mảng chip. Cuối cùng, quy trình chuẩn bị phân tích DNA bao gồm 2 phút đầu tiên điều trị siêu âm, chiết xuất DNA (2×) và 5 phút sonication tiếp theo, đã được thiết lập. (Basselet và cộng sự 2008)

Kết tủa miễn dịch nhiễm sắc (ChIP)

Các tế bào HEK293 được nuôi cấy như mô tả ở trên và cố định với 2 mM disuccinimidyl-glutarate trong 45 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS. Chromatin được liên kết chéo trong 10 phút ở nhiệt độ phòng bằng cách sử dụng formaldehyde 1% (v / v) và rửa hai lần bằng PBS lạnh như đá. Phản ứng liên kết ngang đã được dừng lại bằng cách ủ với glycine ở nồng độ cuối cùng là 0,125 M trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ với trypsin, các tế bào được cạo từ đĩa nuôi cấy tế bào và rửa hai lần bằng PBS. Viên nén tế bào được tái lơ lửng trong dung dịch đệm ly giải (5 mM ống, pH 8.0, 85 mM KCl và 0.5% (v / v) Nonidet P-40), được ủ trên băng trong 10 phút và được đồng nhất hóa bằng chất đồng nhất Dounce. Sau đó, hạt nhân được ép viên bằng cách ly tâm (3500 x g, 5 phút, 4 °C) và lơ lửng trong dung dịch đệm hạt nhân (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA và 1% (w/v) SDS). Hạt nhân đã bị phá vỡ bởi sonication với ba xung 20-s trong một Máy sonicator UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) ở chu kỳ 0,5 và biên độ 30%, tạo ra các đoạn DNA bộ gen với kích thước khối 200 - 1000 bp. Đối với ChIP, 50g DNA được pha loãng gấp 4 lần trong dung dịch đệm kết tủa miễn dịch (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100 và 0,01% (w / v) SDS). (Weiske và cộng sự 2006)

Phân tích biến đổi histone bằng kết tủa miễn dịch nhiễm sắc (ChIP)

Ngắn gọn, 6 x 10⁶ Các tế bào được rửa hai lần bằng PBS và liên kết ngang trên đĩa nuôi cấy trong 15 phút ở nhiệt độ phòng với sự có mặt của 0,5% formaldehyd. Phản ứng liên kết ngang đã được dừng lại bằng cách thêm 0,125 M glycine. Tất cả các bước tiếp theo được thực hiện ở 48 ° C. Tất cả các chất đệm đều được làm lạnh trước và chứa các chất ức chế protease (Complete Mini, Roche). Các tế bào được rửa hai lần bằng PBS và sau đó cạo. Các viên thu thập được hòa tan trong dung dịch đệm ly giải 1 ml (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) và được sonicated trong bồn tắm ethanol lạnh trong 10 chu kỳ với biên độ 100% bằng cách sử dụng Máy sonicator UP50H (Hielscher, Teltow, Đức). Sự phân mảnh nhiễm sắc thể được hình dung trong gel agarose 1%. Các mảnh vỡ thu được nằm trong phạm vi 200–500pb. Nhiễm sắc thể hòa tan thu được bằng cách ly tâm các mẫu sonicated ở 14.000g trong 10 phút ở 48 ° C. Phần hòa tan được pha loãng 1/10 trong dung dịch đệm pha loãng (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) sau đó được bảo quản ở 80°C cho đến khi sử dụng. (Rodriguez và cộng sự 2008)