Cắt DNA bằng siêu âm

Trong quá trình cắt DNA và RNA, các phân tử DNA dài được phân mảnh thành những đoạn nhỏ hơn, một bước quan trọng trong chuẩn bị mẫu để xây dựng thư viện giải trình tự thế hệ mới (NGS). Cắt DNA bằng siêu âm sử dụng lực do hiện tượng xâm thực âm gây ra để phân cắt DNA hoặc RNA thành các đoạn có kích thước từ 100 bp đến 5 kb. Phương pháp này cho phép kiểm soát chính xác kích thước đoạn, tạo điều kiện điều chỉnh theo chiều dài DNA mong muốn để đạt kết quả giải trình tự tối ưu.

Cắt DNA bằng phương pháp siêu âm

Hielscher Ultrasonics cung cấp nhiều giải pháp sử dụng siêu âm để cắt DNA, RNA và chromatin. Hãy chọn máy siêu âm dạng đầu dò (ví dụ: UP100H) để xử lý siêu âm trực tiếp bằng đầu dò vi mô, hoặc sử dụng VialTweeeter hay bộ siêu âm dạng cốc để chuẩn bị DNA gián tiếp từ nhiều mẫu cùng lúc. Hielscher cung cấp thiết bị lý tưởng phù hợp với nhu cầu của bạn: dù bạn có 1 mẫu hay lên đến 10 mẫu, với thể tích từ microlít đến lít – các máy siêu âm Hielscher sẽ đáp ứng yêu cầu chuẩn bị các đoạn DNA, RNA và chromatin có chiều dài phù hợp. Khả năng tái lập, vận hành dễ dàng và kiểm soát chính xác giúp tạo ra thư viện đáng tin cậy cho giải trình tự thế hệ mới.
Khác với phân mảnh DNA bằng enzyme, cắt bằng siêu âm sử dụng lực cắt thuần túy cơ học mà không bổ sung bất kỳ hóa chất nào. Bằng cách thiết lập chính xác các thông số quá trình, phương pháp cắt bằng siêu âm tạo ra các đoạn DNA có khối lượng phân tử cao (DNA plasmid và DNA hệ gen).
Các axit nucleic đã tinh sạch có thể được khuếch đại trước hoặc sau bước phân mảnh.
Các thông số xử lý siêu âm (công suất, chu kỳ xung / các đợt phát xung, thời gian và nhiệt độ) có thể được kiểm soát an toàn thông qua các thiết lập phần mềm.

Các quy trình cắt DNA bằng siêu âm

Dành cho xét nghiệm kết tủa miễn dịch chromatin

Tóm tắt quy trình: tế bào được gieo vào các đĩa có đường kính 60mm (400.000 tế bào mỗi đĩa) và được chuyển nạp siRNA RhoA (như đã mô tả); sau 72 h, tế bào được ủ với formaldehyde (nồng độ cuối, 1%) trong 10 min ở 37°C để tạo liên kết chéo giữa protein và DNA. Phản ứng tạo liên kết chéo được dừng bằng cách bổ sung glycine 1,25 mol/L với thể tích bằng một phần mười thể tích ban đầu, đạt nồng độ cuối 125 mmol/L. Tế bào được rửa hai lần bằng PBS lạnh như nước đá, được tái huyền phù trong đệm xét nghiệm kết tủa miễn dịch phóng xạ [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholate, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] chứa 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 Ag/mL aprotinin và 1 Ag/mL pepstatin A, rồi được giữ trên đá trong 30 min. Sau đó, dịch ly giải tế bào được xử lý siêu âm trên đá bằng máy siêu âm Hielscher UP200S (3 x 40 s, biên độ 40%, chu kỳ 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) cho đến khi chromatin đã tạo liên kết chéo được cắt để thu được các đoạn DNA có kích thước từ 200 đến 1.000 bp. Một phần mười toàn bộ dịch ly giải được dùng để định lượng DNA có trong các mẫu khác nhau và được xem là “tổng DNA đầu vào”. Dịch nổi được ủ với huyền phù DNA tinh trùng cá hồi/protein agarose 50% để giảm tín hiệu nền không đặc hiệu. Sau đó, quá trình kết tủa miễn dịch được thực hiện qua đêm ở 4°C với 5 Ag kháng thể kháng NF-nB p65 (Upstate) hoặc không có kháng thể (đối chứng âm). Các dịch nổi này được bổ sung NaCl 5 mol/L và gia nhiệt qua đêm ở 65°C để đảo ngược các liên kết chéo protein–DNA. Các phức hợp miễn dịch tiếp tục được xử lý bằng proteinase K không chứa DNase và RNase, và DNA được tinh sạch bằng chiết phenol/chloroform và kết tủa bằng ethanol. PCR được thực hiện với các mồi đặc hiệu tương ứng với một trình tự trong vùng khởi động của gen iNOS ở người (mồi p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; mồi p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Các nghiên cứu biểu hiện EGFP

Trong các nghiên cứu biểu hiện, chủng tái tổ hợp L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Đức) mang gen mã hóa EGFP (protein huỳnh quang xanh lục tăng cường), được tích hợp tại vị trí ssu trên nhiễm sắc thể, được nuôi cấy trong các môi trường khác nhau như đã mô tả trước đó và được bổ sung thêm 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Đức). Trong quá trình nuôi cấy, các mẫu 1 ml được lấy, ly tâm (2000 × g, 20°C, 10 min) và rửa bằng dung dịch NaCl 0,9%. Phần cặn được tái huyền phù trong dung dịch đệm (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) và được phá vỡ bằng siêu âm với thiết bị xử lý siêu âm UP400S (năng lượng áp dụng ∼ 400 Ws). Các mảnh vụn tế bào được loại bỏ bằng ly tâm (6000 × g, 4°C, 5 min) và được phân tích bằng điện di trên gel natri dodecyl sulfat – polyacrylamide (SDS-PAGE) trong điều kiện khử theo phương pháp của Laemmli (1970) với gel polyacrylamide 12,5%. Sự biểu hiện EGFP được khảo sát trong điều kiện nuôi cấy có khuấy. (Fritsche et al. 2007)

Kết tủa miễn dịch nhiễm sắc chất

Xét nghiệm kết tủa miễn dịch nhiễm sắc chất được thực hiện bằng ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với một số điều chỉnh. Tóm tắt như sau: các tế bào có chân của người đã biệt hóa được tạo liên kết chéo bằng formaldehyde 1% trong 10 min ở nhiệt độ phòng. Tế bào được rửa bằng PBS lạnh như đá và phản ứng cố định được dừng lại bằng cách thêm glycine 0,125 M trong 5 min ở nhiệt độ phòng. Tế bào được rửa lại bằng PBS lạnh như đá và cạo khỏi đĩa. Tế bào được thu thành cặn bằng ly tâm và tái huyền phù trong dung dịch đệm ly giải. Sau khi ly tâm, phần cặn nhân tế bào được tái huyền phù trong dung dịch đệm phân mảnh, ủ trên đá trong 30 min và nhiễm sắc chất được phân mảnh bằng siêu âm, ví dụ bằng UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Đức) ở mức công suất 25% với 5 xung, mỗi xung 20 sec, trên đá để tạo thành các mảnh có kích thước khoảng 200–600 bp. Nhiễm sắc chất đã phân mảnh sau đó được ly tâm và phần dịch nổi được thu lại. Để kết tủa miễn dịch, 60 μl nhiễm sắc chất được ủ với 1 μg kháng thể kháng Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Hoa Kỳ), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Vương quốc Anh) hoặc NF-κB p50 (Abcam), hoặc với IgG thỏ (Zymed Laboratories) làm đối chứng âm, qua đêm ở 4°C với chuyển động xoay nhẹ. Các phức hợp miễn dịch gắn với hạt từ được thu bằng giá nam châm, rửa kỹ, sau đó các liên kết chéo protein/DNA được đảo ngược và DNA được rửa giải để phân tích bằng PCR thời gian thực. (Ristola et al. 2009)

Chuẩn bị DNA EHEC để phân tích bằng mảng chip

Bố trí các dịch ly giải tế bào và DNA đã chiết xuất
Các cặn vi khuẩn được huyền phù trong PBS đến nồng độ cuối mong muốn được xử lý bằng thiết bị phá vỡ bằng siêu âm UP100H (Hielscher GmbH, Đức) được trang bị đầu dò siêu nhỏ MS1 (đường kính 1mm). Tần số hoạt động là 30 kHz và công suất đầu ra hiệu dụng là 100 W. Trong quá trình vận hành, các mẫu được làm lạnh trong bể nước đá, trộn và ly tâm. Các mẫu được sử dụng cho các nghiên cứu đo tế bào dòng chảy, còn để xử lý tiếp sau đó, các mẫu được xử lý nhiệt (95°C, 5 min). Dịch ly giải tế bào thô được xử lý bằng hỗn hợp phenol:chloroform:alcohol isoamyl (25:24:1). Một thể tích hỗn hợp này bằng với thể tích mẫu dịch ly giải được thêm vào mẫu; dung dịch được trộn xoáy mạnh trong 15 s và ly tâm ở 15.000 x g trong 2 min ở nhiệt độ phòng (RT), khoảng 22°C. Pha nước phía trên chứa DNA hệ gen được tách cẩn thận và thu vào một ống Eppendorf vô trùng mới.
Sau đó, các mẫu được xử lý siêu âm để phân mảnh DNA. Bước xử lý siêu âm được thực hiện trong cùng điều kiện như mô tả ở trên. Để đánh giá tác động của việc phân mảnh lên DNA hệ gen, các mẫu được phân tích bằng điện di trên gel agarose.
(…) Các mẫu trước đó đã được xử lý siêu âm trong 2,5 min được đưa qua bước chiết sau khi xử lý nhiệt và ly tâm. DNA được giải phóng được chiết hai lần bằng hỗn hợp phenol:chloroform:alcohol isoamyl, sau đó được xử lý siêu âm lần thứ hai trong 0 – 15 min. Điện di trên gel agarose được sử dụng để xác định phân bố kích thước của DNA được phân mảnh bằng siêu âm sau khi chiết (Hình ở phía trên bên phải). DNA bị phân mảnh mạnh thể hiện rõ qua sự hiện diện của một vệt DNA kéo dài thay cho các băng có khối lượng phân tử cao, vốn không còn xuất hiện trong các mẫu được xử lý siêu âm trong 2,5 min hoặc lâu hơn. Thời gian xử lý siêu âm dài hơn làm giảm dần chiều dài các đoạn xuống khoảng 150 – 600 bp, và xử lý siêu âm trong 15 min tiếp tục phân hủy các đoạn này, như có thể thấy chủ yếu ở phần trên của vệt DNA. Do đó, kích thước trung bình của các đoạn DNA giảm dần theo thời gian xử lý siêu âm, và quá trình xử lý trong 5 min cho phép thu được các đoạn DNA có kích thước phù hợp nhất cho các xét nghiệm trên mảng chip. Cuối cùng, quy trình chuẩn bị mẫu DNA để phân tích đã được thiết lập, gồm xử lý siêu âm ban đầu trong 2 min, chiết DNA (2×), rồi xử lý siêu âm tiếp trong 5 min. (Basselet et al. 2008)

Kết tủa miễn dịch nhiễm sắc chất (ChIP)

Tế bào HEK293 được nuôi cấy như mô tả ở trên và cố định bằng disuccinimidyl-glutarate 2 mM trong 45 min ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS. Nhiễm sắc chất được tạo liên kết chéo trong 10 min ở nhiệt độ phòng bằng formaldehyde 1% (v/v) và được rửa hai lần bằng PBS lạnh như đá. Phản ứng tạo liên kết chéo được dừng bằng cách ủ với glycine ở nồng độ cuối cùng 0,125 M trong 5 min ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ với trypsin, các tế bào được cạo khỏi đĩa nuôi cấy tế bào và rửa hai lần bằng PBS. Cặn tế bào được tái huyền phù trong đệm ly giải (Pipes 5 mM, pH 8,0, KCl 85 mM và Nonidet P-40 0,5% (v/v)), ủ trên đá trong 10 min và đồng nhất hóa bằng máy đồng nhất hóa Dounce. Sau đó, các nhân tế bào được thu thành cặn bằng ly tâm (3500 x g, 5 min, 4 °C) và tái huyền phù trong đệm nhân tế bào (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, EDTA 10 mM và SDS 1% (w/v)). Các nhân tế bào được phá vỡ bằng siêu âm với ba xung, mỗi xung kéo dài 20 s, trong một máy siêu âm UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) với cài đặt chu kỳ 0,5 và biên độ 30%, tạo ra các đoạn DNA hệ gen có kích thước chủ yếu trong khoảng 200 – 1000 bp. Đối với ChIP, 50g DNA được pha loãng 4 lần trong đệm kết tủa miễn dịch (Tris-HCl 16,7 mM, pH 8,1, NaCl 167 mM, EDTA 1,2 mM, Triton X-100 1,1% (v/v) và SDS 0,01% (w/v)). (Weiske et al. 2006)

Phân tích biến đổi histone bằng kết tủa miễn dịch nhiễm sắc chất (ChIP)

Tóm tắt, 6 x 10⁶ tế bào được rửa hai lần bằng PBS và tạo liên kết chéo trên đĩa nuôi cấy trong 15 min ở nhiệt độ phòng với sự hiện diện của formaldehyde 0,5%. Phản ứng tạo liên kết chéo được dừng lại bằng cách thêm glycine 0,125 M. Tất cả các bước tiếp theo được thực hiện ở 48°C. Tất cả các dung dịch đệm đều được làm lạnh trước và chứa chất ức chế protease (Complete Mini, Roche). Tế bào được rửa hai lần bằng PBS rồi được cạo khỏi đĩa. Các phần cặn thu được được hòa tan trong 1 ml dung dịch đệm ly giải (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) và được xử lý siêu âm trong bể ethanol lạnh trong 10 chu kỳ ở biên độ 100% bằng thiết bị siêu âm UP50H (Hielscher, Teltow, Đức). Sự phân mảnh chromatin được quan sát trên gel agarose 1%. Các đoạn thu được nằm trong khoảng 200–500pb. Chromatin hòa tan được thu bằng cách ly tâm các mẫu đã xử lý siêu âm ở 14.000g trong 10 min ở 48°C. Phần hòa tan được pha loãng 1/10 trong dung dịch đệm pha loãng (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), sau đó được chia thành các phần nhỏ và bảo quản ở 80°C cho đến khi sử dụng. (Rodriguez và cộng sự, 2008)