• Trong quá trình cắt DNA và RNA, các phân tử DNA được chia thành các mảnh nhỏ hơn. Phân mảnh DNA / RNA là một trong những bước chuẩn bị mẫu quan trọng cần thiết để tạo thư viện cho giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS).
• Siêu âm DNA cắt sử dụng các lực lượng của cavitation âm thanh để phá vỡ DNA hoặc RNA thành miếng của 100 – 5kb BP.
• Siêu âm cắt cho phép phân mảnh DNA chính xác và thích ứng với chiều dài DNA mong muốn.

Cắt DNA bằng cách sử dụng siêu âm

Hielscher Ultrasonics cung cấp các giải pháp siêu âm khác nhau cho DNA, RNA và cắt nhiễm sắc. Lựa chọn giữa máy siêu âm loại đầu dò (ví dụ: UP100H) cho sonication trực tiếp bằng cách sử dụng microtip, hoặc sử dụng VialTweeeter hoặc cuphorn siêu âm để chuẩn bị DNA gián tiếp của các mẫu khác nhau cùng một lúc. Hielscher cung cấp các thiết bị lý tưởng xem xét nhu cầu của bạn: thời tiết bạn có 1 hoặc lên đến 10 mẫu, khối lượng từ microliter đến khối lượng lít – Bộ vi xử lý siêu âm Hielscher có sẵn để đáp ứng các yêu cầu của bạn để chuẩn bị các mảnh DNA, RNA và nhiễm sắc ở độ dài bên phải. Khả năng tái tạo, vận hành dễ dàng và kiểm soát chính xác cho phép một thư viện đáng tin cậy để sắp xếp thứ tự thế hệ tiếp theo.
Ngược lại với phân mảnh DNA của enzym, việc cắt siêu âm áp dụng lực cắt cơ học thuần túy mà không cần thêm bất kỳ hóa chất nào. Bằng cách thiết lập chính xác các thông số quá trình, việc cắt siêu âm tạo ra các đoạn DNA có trọng lượng phân tử cao (plasmid và DNA gen).
Các axit nucleic tinh khiết có thể được khuếch đại trước hoặc sau một bước phân mảnh.
Thông số Sonication (điện, chu kỳ xung/nổ, thời gian và nhiệt độ) có thể được kiểm soát an toàn thông qua cài đặt phần mềm.

Các giao thức cho cắt DNA siêu âm

Cho chromatin Immunoprecipitation Assay

Một thời gian ngắn, các tế bào được mạ trong các món ăn đường kính 60mm (400.000 cho mỗi món ăn) và truyền với RhoA siRNA (như mô tả); sau 72 h, chúng được ấp với formaldehyde (nồng độ cuối cùng, 1%) trong 10 phút ở 37 ° c đến các protein liên kết chéo với DNA. Phản ứng liên kết chéo đã được dập tắt bởi việc bổ sung một phần mười khối lượng 1,25 Mol/L Glycine, cho 125 mmol/L nồng độ cuối cùng. Các tế bào được rửa sạch hai lần với PBS lạnh, resuspended trong radioimmunoprecipitation khảo nghiệm đệm [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholate, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] chứa 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl florua, 1 AG/mL aprotinin, và 1 AG/mL pepstatin A, và giữ trên băng trong 30 phút. Sau đó, tế bào lysates được sonicated trên băng với một Cho UP200S siêu âm sonicator (3 x 40 s, biên độ 40%, chu kỳ 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) cho đến khi chromatins Cross-liên kết được sheared để sản lượng các đoạn DNA giữa 200 và 1.000 BP. Một phần mười của toàn bộ lysate đã được sử dụng để định lượng số tiền của DNA hiện diện trong các mẫu khác nhau và xem như là “Tổng số đầu vào DNA”. Supernatants được ấp với tinh trùng cá hồi DNA/protein agnảy-50% bùn để giảm nền không đặc hiệu. Immunoprecipitation sau đó được thực hiện qua đêm tại 4 ° c với 5 AG của Anti-NF-nB p65 (Upstate) hoặc không có kháng thể (điều khiển âm). Những supernatants được bổ sung với 5 Mol/L NaCl và nóng qua đêm ở 65 ° c để trở lại liên kết Cross-DNA protein. Các phức hợp miễn dịch được tiếp tục điều trị bằng Proteinase K DNase và RNase-miễn phí, và DNA được tinh chế bằng chiết xuất phenol/chloroform và lượng mưa ethanol. PCR được thực hiện với các chất mồi cụ thể tương ứng với một chuỗi trong vùng promoter của gen iNOS của con người (P1 Primer: 5 ¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3 ¶; P2 Primer: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3 ¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-Expression nghiên cứu

Đối với các nghiên cứu biểu hiện, các chủng tái tổ hợp L. tarentolae P10:: F9Begfp 1.4 dBsat # 12 (Jena Bioscience, Đức) với gen cho EGFP (tăng cường protein huỳnh quang xanh), ssu chromosome tích hợp, đã được trồng trong các phương tiện truyền thông khác nhau như mô tả trước đó và bổ sung thêm với 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Đức). Trong khi trồng trọt, 1 ml mẫu được chụp, ly tâm (2000 × g, 20 ° c, 10 phút) và rửa sạch với 0,9% dung giải NaCl. Pellet được resuspended trong bộ đệm (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) và tan rã bằng sonification với bộ vi xử lý siêu âm UP400S (áp dụng năng lượng ∼ 400 WS). Các mảnh vụn tế bào đã được loại bỏ bằng cách ly tâm (6000 × g, 4 ° c, 5 phút) và phân tích bởi Sodium dodecyl sulfate – điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE) trong điều kiện giảm theo phương pháp Laemmli (1970) với 12,5% polyacralamide gel. EGFP-Expression đã được kiểm tra trong văn hóa bị khuấy động. (Fritsche et al. 2007)

Immunoprecipitation, Campuchia

Các immunoprecipitation nghiệm nhiễm sắc đã được thực hiện bằng cách sử dụng ChIP-It^Tm Express (Active motif, Carlsbad, CA, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với một số sửa đổi. Một thời gian ngắn, podocytes con người phân biệt được liên kết chéo với 1% formaldehyde trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Các tế bào được rửa sạch với PBS lạnh và phản ứng cố định đã được dừng lại bằng cách thêm 0,125 M Glycine trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Các tế bào được rửa lại với PBS lạnh và cạo từ món ăn. Các tế bào được thức bằng ly tâm và resuspended trong bộ đệm lysis. Sau khi ly tâm, hạt nhân đã được resuspended trong bộ đệm cắt, ấp trên băng trong 30 phút và các nhiễm sắc được sheared bởi sonication, ví dụ. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Đức) ở 25% công suất 5 xung 20 giây mỗi ngày băng thành các mảnh vỡ khoảng 200 – 600 BP. Nhiễm sắc cắt được sau đó ly tâm và supernatant được thu thập. Đối với immunoprecipitations, 60 μL của nhiễm sắc được ấp với 1 μg Sp1 (Santa Cruz công nghệ sinh học, Santa Cruz, ca, Hoa Kỳ), NF-κb p65 (abcam, Cambridge, Vương Quốc Anh) hoặc NF-κb P50 (abcam) kháng thể hoặc với thỏ IgG (zymed Laboratories, South San Francisco, ca, USA), kiểm soát âm, qua đêm ở 4 ° c với xoay nhẹ nhàng. Immunophức ràng buộc với hạt từ tính được thu thập bằng cách sử dụng một đứng từ tính, rửa rộng rãi, và các protein/DNA crosslinks đã được đảo ngược và DNA eluted cho phân tích PCR thời gian thực. (Ristola et al. 2009)

Chuẩn bị ADN EHEC cho phân tích mảng chip

Sắp xếp của lysates tế bào và chiết xuất DNAs
Viên vi khuẩn bị đình chỉ trong PBS đến nồng độ cuối cùng mong muốn đã được điều trị bằng siêu âm phá vỡ UP100H (Hielscher GmbH, Đức) được trang bị một microtip MS1 (đường kính 1mm). Tần số hoạt động là 30 kHz và công suất đầu ra hiệu quả là 100 W. Trong quá trình hoạt động, các mẫu được làm lạnh trong bồn tắm nước đá, hỗn hợp và ly tâm. Các mẫu được sử dụng cho các nghiên cứu tế bào học dòng chảy, trong khi để xử lý sau này, các mẫu đã phải chịu một điều trị nhiệt (95 ° c, 5 phút). Các lysates tế bào thô được xử lý với một hỗn hợp của phenol: chloroform: isoamyl rượu (25:24:1). Một khối lượng bình đẳng của hỗn hợp này đã được thêm vào mẫu lysate, giải pháp được vortexed mạnh mẽ cho 15 s và ly tâm ở 15.000 x g trong 2 phút ở nhiệt độ phòng (RT) xung quanh 22 ° c. Pha nước đầu có chứa DNA gen đã được tách ra cẩn thận và thu thập trong một ống Eppendorf vô trùng mới.
Sau đó, các mẫu được sonicated để phân mảnh DNA. Bước sonication đã được thực hiện trong các điều kiện tương tự như mô tả ở trên. Để đánh giá các hiệu ứng phân mảnh trên DNA gen, các mẫu được tích tụ bằng cách sử dụng điện di gel nổi lên.
(…) Các mẫu sonicated trước đó cho 2,5 phút đã phải chịu một bước khai thác sau khi xử trị nhiệt và ly tâm. DNA phát hành đã được trích xuất hai lần với một phenol: chloroform: isoamyl rượu Mix, và sau đó phải chịu các sonication thứ hai trong 0 – 15 min. Agnảy gel điện di được sử dụng để xác định kích thước phân phối của DNA chịu để khai thác sau phân mảnh siêu âm (hình. ở phía trên bên phải). DNA rất phân mảnh được hiển nhiên từ sự hiện diện của một smear DNA chứ không phải là các ban nhạc trọng lượng khối cao được loại bỏ từ các mẫu sonicated trong 2,5 phút hoặc lâu hơn. Sonication còn giảm dần độ dài đoạn đến khoảng 150-600 BP, và sonication trong 15 phút tiếp tục bị suy thoái những mảnh vỡ, như có thể được nhìn thấy chủ yếu bởi phần trên của vết bẩn. Do đó, kích thước đoạn DNA trung bình dần bị từ chối với thời gian ultrasonication và 5 phút điều trị cho phép để có được kích thước của các mảnh DNA thích hợp nhất cho assays mảng chip. Cuối cùng, các quy trình chuẩn bị phân tích DNA bao gồm 2 phút xử trị siêu âm đầu tiên, chiết xuất DNA (2 ×), và sonication 5 phút tiếp theo, được thành lập. (Basselet et al. 2008)

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

HEK293 tế bào được nuôi cấy như mô tả ở trên và cố định với 2 mM disuccinimidyl-glutarate cho 45 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các tế bào được rửa hai lần với PBS. Chromatin được liên kết chéo trong 10 phút ở nhiệt độ phòng bằng cách sử dụng formaldehyde 1% (v/v) và rửa hai lần với PBS lạnh. Phản ứng liên kết ngang đã được ngừng lại bằng cách ủ với Glycine ở nồng độ cuối cùng là 0,125 M trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ với trypsin, các tế bào đã được cạo từ các món ăn văn hóa tế bào và rửa hai lần với PBS. Các viên tế bào được resuspended trong lysis đệm (5 mM ống, pH 8,0, 85 mM KCl, và 0,5% (v/v) Nonidet P-40), ủ trên băng trong 10 phút, và homogenized với một Dounce homogenizer. Sau đó, hạt nhân được dùng bằng cách ly tâm (3500 x g, 5 phút, 4 ° c) và resuspended trong đệm hạt nhân (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA, và 1% (w/v) SDS). Hạt nhân đã bị gián đoạn bởi sonication với 3 20-s xung trong một UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) tại một thiết lập của chu kỳ 0,5 và biên độ 30%, năng suất các mảnh DNA gen với kích thước số lượng lớn 200 – 1000 BP. Đối với ChIP, 50g DNA được pha loãng 4 lần trong bộ đệm immunoprecipitation (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100, và 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histone sửa đổi phân tích bởi nhiễm sắc immunoprecipitation (ChIP)

Tóm lại, 6 x 10⁶ Các tế bào được rửa hai lần với PBS và liên kết chéo trên tấm văn hóa trong 15 phút ở nhiệt độ phòng trong sự hiện diện của 0,5% formaldehyde. Phản ứng liên kết chéo đã được ngừng lại bằng cách thêm 0,125 M Glycine. Tất cả các bước tiếp theo được thực hiện ở 48 ° c. Tất cả các bộ đệm được Pre-ướp lạnh và chứa các chất ức chế protease (Complete mini, Roche). Các tế bào được rửa hai lần với PBS và sau đó cạo. Thu thập viên đã được hòa tan trong 1 ml lysis đệm (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) và được sonicated trong một bồn tắm ethanol lạnh cho 10 chu kỳ ở mức độ 100% bằng cách sử dụng một UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, Đức). Phân mảnh chromatin được hình dung trong gel 1% agnảy. Những mảnh vỡ thu được trong phạm vi 200 – 500pb. Nhiễm sắc hòa tan đã thu được bằng máy ly tâm các mẫu sonicated tại 14, 000g trong 10 phút ở 48 ° c. Phần hòa tan được pha loãng 1/10 trong bộ đệm pha loãng (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) sau đó được xếp và lưu trữ ở 80 ° c cho đến khi sử dụng. (Rodriguez et al. 2008)