Chuẩn bị plasmid bằng siêu âm

Siêu âm là một kỹ thuật đáng tin cậy để phân mảnh DNA plasmid. Biên độ có thể kiểm soát chính xác, chế độ xung và khả năng kiểm soát nhiệt độ là những đặc tính quan trọng nhất của thiết bị siêu âm để phân mảnh plasmid mà không gây hư hại. Ngoài ra, việc sử dụng một số tác nhân giúp bảo vệ plasmid khỏi bị phân hủy. Hielscher Ultrasonics cung cấp nhiều giải pháp phân mảnh plasmid có kiểm soát, từ xử lý từng lọ riêng lẻ đến xử lý siêu âm đồng thời nhiều mẫu cũng như các đĩa nhiều giếng. Tìm hiểu thêm về cách phân mảnh plasmid thành công bằng siêu âm!

Cắt plasmid bằng siêu âm

Khi mẫu DNA chịu tác động của sóng siêu âm, các dao động do siêu âm tạo ra gây ra hiện tượng xâm thực âm trong chất lỏng, từ đó cắt hoặc làm đứt các phân tử DNA có khối lượng phân tử cao bằng lực cơ học. Xử lý siêu âm là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong các thí nghiệm cắt DNA hàng loạt, bao gồm các ứng dụng như kết tủa miễn dịch chromatin (ChIP), trong đó kích thước đoạn nhỏ là yếu tố tối quan trọng để đạt độ phân giải cao. (xem Tseng et al., 2012)
DNA plasmid (pDNA) là một dạng DNA đặc thù, có hình vòng và được tìm thấy ở vi khuẩn cùng một số sinh vật nhân thực.
pDNA siêu xoắn là dạng DNA plasmid mong muốn vì cho kết quả tốt nhất trong các quy trình tiếp theo như giải trình tự tự động và chuyển nạp. Siêu âm phù hợp để phân mảnh thành công pDNA, bao gồm cả pDNA siêu xoắn.
Thompson et al. (2008) đã chứng minh rằng xử lý plasmid bằng siêu âm, vốn được biết đến với khả năng phân mảnh DNA siêu xoắn, là một cách hiệu quả để cải thiện chiều dài đoạn đọc trình tự phred20 đến mức không còn khác biệt đáng kể so với khuôn đối chứng của Beckman Coulter hoặc plasmid được tuyến tính hóa bằng enzyme.

Sử dụng vector plasmid

Plasmid thường được sử dụng làm công cụ để tạo dòng, chuyển và thao tác gen. Khi được sử dụng trong thí nghiệm cho các mục đích này, plasmid được gọi là vector. Các đoạn DNA hoặc gen có thể được chèn vào vector plasmid, tạo ra cái gọi là plasmid tái tổ hợp. Vector plasmid được sử dụng làm phương tiện đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ và là thành phần then chốt của kỹ thuật tạo dòng phân tử.
“Các vector không có nguồn gốc virus đang được nghiên cứu rộng rãi về tiềm năng sử dụng trong liệu pháp gen để điều trị nhiều bệnh phức tạp. Các vector không có nguồn gốc virus bảo vệ DNA plasmid khỏi sự phân hủy do các tác động vật lý, hóa học và enzyme, đồng thời đưa phân tử DNA đến vị trí đích. Ví dụ, liposome cation, chitosan và các hạt nano tích điện dương khác tạo phức với DNA plasmid thông qua tương tác tĩnh điện. Tuy nhiên, các phức liposome cation/DNA plasmid dễ hình thành này có kích thước tương đối lớn (tức là 300–400 nm) và có bản chất không đồng nhất, khiến chúng khó sử dụng trong các ứng dụng dược phẩm. Các phức DNA plasmid/liposome, DNA plasmid/sol khí và DNA plasmid/peptide có kích thước lớn và không đồng nhất có thể được làm nhỏ thành các hạt nhỏ hơn và đồng nhất bằng siêu âm.” (Sarker et al., 2019)
Một ví dụ nổi bật về việc sử dụng vector plasmid là CRISPR–Cas9. Hệ thống CRISPR–Cas9 thường được đưa vào tế bào dưới dạng một plasmid lớn hoặc nhiều plasmid nhỏ hơn mã hóa một trình tự đích, một RNA dẫn đường CRISPR và Cas9.

Chuẩn bị hạt nano PLGA mang DNA bằng phương pháp kết tủa nano có hỗ trợ siêu âm

Jo et al. (2020) đã sử dụng poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) để tạo chất mang dạng hạt nano nhằm đưa plasmid CRISPR–Cas9 mô hình vào các đại thực bào nguyên phát có nguồn gốc từ tủy xương. Để tạo hạt nano PLGA bằng phương pháp kết tủa nano, PLGA có hai nhóm tận cùng khác nhau (nhóm ester và amine) đã được sử dụng với mục tiêu tăng hiệu suất bao gói và mức nạp nhờ các nhóm amine tận cùng tích điện dương tương tác điện tích với khung xương tích điện âm của DNA. Trong một ống ly tâm đáy côn bằng polypropylene dung tích 50 mL, 100 mg Pluronic F127 được hòa tan trong 20 mL nước khử ion đã được hấp tiệt trùng bằng cách trộn vortex, sau đó xử lý siêu âm nhẹ trong 30 min bằng bể siêu âm (xem CupHorn). Một thanh khuấy từ đã được hấp tiệt trùng được thêm vào và dung dịch được khuấy ở 600 RPM trong 30 min trong khi chuẩn bị các dung dịch khác. Dụng cụ thí nghiệm bằng nhựa được sử dụng thay cho dụng cụ thủy tinh trong suốt quá trình để giảm thiểu sự hấp phụ không đặc hiệu của DNA. Các dung dịch PLGA hòa tan trong DMF (44,48 mg/ ml) và TIPS pentacene hòa tan trong THF (0,667 mg/ml) được chuẩn bị riêng biệt. PLGA được để yên cho thấm ướt trong DMF trong 30 min trước khi được xử lý siêu âm trong 30 min. (để xem quy trình đầy đủ, xem Jo et al., 2020)

Bảo vệ DNA plasmid trong quá trình xử lý siêu âm

DNA, bao gồm plasmid và plasmid siêu xoắn, rất dễ bị phân hủy. Tất cả các phương pháp phân mảnh hiện có đều có những nhược điểm nhất định. Phân mảnh DNA bằng siêu âm là một trong những phương pháp được ưu tiên vì xử lý siêu âm có kiểm soát kết hợp với các biện pháp bảo vệ cho phép giảm tổn thương các sợi DNA do lực cắt và nhiệt gây ra.
Bên cạnh việc thiết lập biên độ thấp, chế độ xung và kiểm soát nhiệt độ trong quá trình cắt DNA bằng siêu âm, việc sử dụng một số tác nhân đã cho thấy tác dụng bảo vệ đáng kể chống lại sự phân hủy DNA. Chẳng hạn, nhiều loại polymer, peptide và lipid bảo vệ DNA plasmid trong quá trình xử lý siêu âm.

Độ ổn định của DNA plasmid và các phức hợp nano DNA plasmid/IL trước ứng suất cắt do siêu âm được khảo sát bằng phép thử điện di gel agarose. Cả DNA plasmid và các phức hợp nano DNA plasmid/IL đều được cho chịu ứng suất cắt do siêu âm trong các khoảng thời gian khác nhau. DNA plasmid được cho chịu ứng suất cắt do siêu âm trong 0, 10, 20, 30 và 40 phút. Tuy nhiên, các phức hợp nano DNA plasmid/IL được cho chịu ứng suất cắt do siêu âm trong 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 và 120 phút.
(nghiên cứu và hình ảnh: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) đã chứng minh rằng khi các cấu trúc nano DNA plasmid / chất lỏng ion (pDNA/IL) được cho chịu ứng suất cắt do siêu âm trong 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 và 120 min rồi được tạo phức với lipofectamine, một tác nhân cation đưa gen vào tế bào có bán trên thị trường, tỷ lệ tế bào dương tính với huỳnh quang lần lượt là 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% và 50% (xem biểu đồ bên dưới). Tỷ lệ tế bào dương tính với huỳnh quang tăng khi các cấu trúc nano được cho chịu ứng suất cắt do siêu âm trong 10 và 20 min, sau đó giảm chậm.

Ảnh hưởng của chất lỏng ion [Bmim][PF6] đến việc đưa DNA plasmid vào tế bào COS7. Các phức hợp nano DNA plasmid/IL (chất lỏng ion) được cho chịu ứng suất cắt do siêu âm trong tối đa 120 phút và được tạo phức với LA trước khi đưa vào tế bào COS7. Dữ liệu cho thấy số lượng trung bình (%) tế bào HeLa dương tính với GFP được đếm trong 10 vi trường kính hiển vi khác nhau và thí nghiệm được thực hiện nhiều lần vào ba ngày khác nhau. (Nghiên cứu và biểu đồ: ©Sarker et al., 2019)

Chuẩn bị dịch ly giải bằng siêu âm

Quy trình ly giải tế bào bằng siêu âm
Bắt đầu với mẫu tế bào đã được làm giàu bằng một phương pháp phân tách tế bào (ví dụ: phân tách tế bào bằng từ tính miễn dịch, phân loại tế bào hoạt hóa bằng huỳnh quang (FACS), ly tâm gradient mật độ, phân lập tế bào theo mật độ miễn dịch).
Các mẫu tế bào phải có thể tích dung dịch đệm ly giải phù hợp với mục tiêu thí nghiệm và thiết bị siêu âm dạng đầu dò.
Dung dịch đệm nhược trương được ưu tiên vì giúp tăng cường ly giải tế bào bằng siêu âm. Điều quan trọng là phải sử dụng các chất phụ gia và nồng độ muối một cách phù hợp.
Chọn thiết bị ly giải bằng siêu âm: VialTweeter hoặc CupHorn được khuyến nghị để xử lý siêu âm gián tiếp các lọ mẫu. Đối với đĩa nhiều giếng, UIP400MTP là thiết bị siêu âm lý tưởng. Đối với xử lý siêu âm dạng đầu dò truyền thống, các thiết bị đồng nhất hóa siêu âm như UP100H hoặc UP200Ht có đầu dò siêu nhỏ là phù hợp nhất.
Quy trình xử lý siêu âm dạng đầu dò: Đặt đầu dò của thiết bị siêu âm vào phần mẫu trong ống ly tâm vi lượng và xử lý siêu âm trong khoảng 10 giây. Tùy thuộc vào mẫu DNA, có thể lặp lại quá trình xử lý siêu âm thêm một hoặc hai lần. Năng lượng siêu âm đầu vào cần thiết (Ws/mL) phụ thuộc vào độ nhớt của mẫu và loại DNA. Làm mát bằng bể nước đá và chế độ xung của thiết bị siêu âm giúp ngăn mẫu bị phân hủy do nhiệt.
Sau khi ly giải bằng siêu âm, mẫu được ly tâm để tách phần cặn lắng (chứa các tế bào chưa ly giải, nhân tế bào và các bào quan chưa ly giải)
Nếu mẫu chưa được xử lý tiếp ngay lập tức, có thể bảo quản mẫu ở nhiệt độ thích hợp để duy trì khả năng sống của mẫu.

Thiết bị siêu âm để phân mảnh DNA

Hielscher Ultrasonics cung cấp nhiều nền tảng sử dụng siêu âm để phân mảnh DNA, RNA và chất nhiễm sắc. Các nền tảng này bao gồm đầu dò siêu âm (sonotrode), các giải pháp xử lý siêu âm gián tiếp để chuẩn bị đồng thời mẫu trong nhiều ống hoặc đĩa nhiều giếng (ví dụ: đĩa 96 giếng, đĩa vi chuẩn độ), thiết bị phản ứng siêu âm và đầu siêu âm dạng cốc. Tất cả các nền tảng cắt DNA đều được vận hành bằng bộ xử lý siêu âm hiệu năng cao được tinh chỉnh tần số, cho phép kiểm soát chính xác và mang lại kết quả có thể tái lập.

Bộ xử lý siêu âm cho mọi số lượng và kích thước mẫu

Với các thiết bị siêu âm đa mẫu VialTweeter (cho tối đa 10 ống nghiệm) và UIP400MTP (cho đĩa vi lượng/đĩa nhiều giếng) của Hielscher, có thể dễ dàng rút ngắn thời gian xử lý mẫu nhờ siêu âm cường độ cao có thể kiểm soát chính xác, đồng thời đạt được phân bố kích thước và hiệu suất thu hồi các đoạn DNA như mong muốn. Phân mảnh DNA bằng siêu âm giúp các bước chuẩn bị plasmid trở nên hiệu quả, đáng tin cậy và có thể mở rộng quy mô. Có thể mở rộng tuyến tính quy trình từ một mẫu lên nhiều mẫu bằng cách áp dụng các thông số siêu âm không đổi.
Thiết bị siêu âm dạng đầu dò có từ một đến năm nhánh là lựa chọn lý tưởng để chuẩn bị số lượng mẫu ít hơn. Các thiết bị siêu âm phòng thí nghiệm của Hielscher có nhiều mức công suất khác nhau, giúp bạn lựa chọn thiết bị phá vỡ bằng siêu âm lý tưởng cho ứng dụng liên quan đến DNA của mình.