Chuẩn bị plasmid bằng cách sử dụng Ultrasonication

Ultrasonication là một kỹ thuật đáng tin cậy để phân mảnh DNA plasmid. Biên độ có thể kiểm soát chính xác, chế độ xung và kiểm soát nhiệt độ là những tính năng quan trọng nhất của một ultrasonicator cho sự phân mảnh plasmid không gây hại. Ngoài ra, việc sử dụng một số tác nhân giúp bảo vệ chống lại sự thoái hóa plasmid. Hielscher Ultrasonics cung cấp các giải pháp khác nhau để kiểm soát phân mảnh plasmid từ lọ đơn, đồng thời sonication của nhiều mẫu cũng như tấm đa giếng. Tìm hiểu thêm về phân mảnh plasmid siêu âm thành công!

Plasmid cắt bằng cách sử dụng Ultrasonication

Khi các mẫu DNA phải chịu sóng siêu âm, các rung động được tạo ra bằng siêu âm tạo ra sự xâm thực âm thanh trong chất lỏng cắt hoặc phá vỡ các phân tử DNA trọng lượng phân tử cao thông qua các lực cơ học. Sonication là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất cho các thí nghiệm cắt DNA số lượng lớn bao gồm các ứng dụng, chẳng hạn như Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), trong đó kích thước mảnh nhỏ là hoàn toàn quan trọng để có được độ phân giải cao. (xem Tseng và cộng sự, 2012)
DNA plasmid (pDNA) là dạng DNA cụ thể, được đặc trưng bởi hình dạng vòng của nó và được tìm thấy trong vi khuẩn và một số sinh vật nhân chuẩn.
PDNA siêu cuộn là dạng DNA plasmid mong muốn vì nó cho thấy kết quả tốt nhất trong các quy trình xuôi dòng như giải trình tự và truyền tự động. Ultrasonication phù hợp để phân mảnh pDNA, bao gồm pDNA siêu cuộn, thành công.
Thompson et al. (2008) đã chứng minh rằng sonication plasmid, được biết là phân mảnh DNA siêu cuộn, là một cách hiệu quả để cải thiện độ dài đọc phred20 trình tự đến mức chúng không khác biệt đáng kể so với mẫu kiểm soát của Beckman Coulter hoặc plasmid tuyến tính hóa enzyme.

Sử dụng vectơ plasmid

Plasmid thường được sử dụng làm công cụ để nhân bản, chuyển giao và thao tác gen. Khi plasmid được sử dụng thực nghiệm cho các mục đích này, chúng được gọi là vector. Các đoạn DNA hoặc gen có thể được chèn vào một vectơ plasmid, tạo ra cái gọi là plasmid tái tổ hợp. Các vectơ plasmid được sử dụng làm phương tiện để điều khiển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ và là thành phần chính của nhân bản phân tử.
“Các vectơ không phải virus đang được nghiên cứu rộng rãi về tiềm năng sử dụng trong liệu pháp gen để điều trị các bệnh phức tạp khác nhau. Các vectơ không phải virus bảo vệ DNA plasmid chống lại sự thoái hóa vật lý, hóa học và enzyme và đưa phân tử DNA đến vị trí đích. Ví dụ, liposome cation, chitosan và các hạt nano tích điện dương khác tạo thành phức hợp với DNA plasmid thông qua các tương tác tĩnh điện. Tuy nhiên, các phức hợp liposome / plasmid cation dễ hình thành tương đối lớn (tức là 300–400 nm) và không đồng nhất trong tự nhiên khiến chúng khó sử dụng trong các ứng dụng dược phẩm. Các DNA plasmid lớn và không đồng nhất / liposome, plasmid DNA / aerosol, và phức hợp DNA / peptide plasmid có thể được giảm xuống các hạt nhỏ hơn và đồng nhất bằng cách sử dụng siêu âm.” (Sarker và cộng sự, 2019)
Một ví dụ nổi bật cho việc sử dụng vectơ plasmid là CRISPR–Cas9. Hệ thống CRISPR-Cas9 thường được phân phối đến các tế bào dưới dạng một plasmid lớn duy nhất hoặc nhiều plasmid nhỏ hơn mã hóa chuỗi đích, hướng dẫn CRISPR và Cas9.

Chuẩn bị siêu âm các hạt nano PLGA nạp DNA bằng cách kết tủa nano

Jo et al. (2020) đã sử dụng poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) để tạo thành chất mang hạt nano để đưa plasmid mô hình CRISPR–Cas9 vào các đại thực bào có nguồn gốc từ tủy xương nguyên phát. Đối với sự kết tủa nano của các hạt nano PLGA, PLGA với hai nhóm cuối khác nhau (nhóm este và amin) đã được sử dụng với mục tiêu là nắp cuối amin tích điện dương làm tăng hiệu quả đóng gói và tải do tương tác điện tích giữa nó và xương sống tích điện âm của DNA. Trong ống ly tâm hình nón polypropylene 50 ml, Pluronic F127 100 mg đã được hòa tan trong 20 ml nước DI hấp tiệt trùng bằng cách trộn xoáy sau đó là 30 phút sonication nhẹ nhàng bằng cách sử dụng bồn tắm siêu âm (xem CupHorn). Một thanh khuấy từ hấp tiệt trùng đã được thêm vào và dung dịch được trộn ở tốc độ 600 vòng / phút trong 30 phút trong khi các dung dịch khác được tạo ra. Dụng cụ phòng thí nghiệm bằng nhựa được sử dụng thay vì đồ thủy tinh trong suốt để giảm thiểu sự hấp phụ DNA không đặc hiệu. Các dung dịch PLGA hòa tan trong DMF (44,48 mg / ml) và TIPS pentacene hòa tan trong THF (0,667 mg / ml) được thực hiện riêng biệt. PLGA được để yên trong DMF trong 30 phút trước khi được sonicated trong 30 phút. (để biết giao thức đầy đủ, xem Jo et al., 2020)

Bảo vệ DNA plasmid trong quá trình Sonication

DNA bao gồm plasmid và plasmid siêu cuộn là sự thoái hóa rất nhạy cảm. Tất cả các phương pháp phân mảnh có sẵn được biết đến với những nhược điểm nhất định. Phân mảnh DNA siêu âm là một trong những phương pháp ưa thích kể từ khi sonication kiểm soát kết hợp với các biện pháp bảo vệ cho phép giảm thiệt hại cắt và nhiệt gây ra của các sợi DNA.
Bên cạnh cài đặt biên độ thấp, chế độ xung và kiểm soát nhiệt độ trong quá trình cắt DNA siêu âm, việc sử dụng một số tác nhân cho thấy tác dụng bảo vệ đáng kể chống lại sự thoái hóa DNA. Ví dụ, các polyme, peptide và lipid khác nhau bảo vệ DNA plasmid trong quá trình siêu âm.

Sự ổn định của DNA plasmid và phức hợp nano plasmid DNA / IL chống lại ứng suất cắt siêu âm đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng xét nghiệm điện di gel agarose. Cả DNA plasmid và phức hợp nano plasmid DNA / IL đều chịu ứng suất cắt siêu âm cho các điểm thời gian khác nhau. DNA plasmid đã tiếp xúc với ứng suất cắt siêu âm trong 0, 10, 20, 30 và 40 phút. Tuy nhiên, các phức hợp nano plasmid DNA / IL đã tiếp xúc với ứng suất cắt siêu âm trong 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 và 120 phút.
(nghiên cứu và hình ảnh: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) đã chứng minh rằng khi cấu trúc nano plasmid DNA / ion lỏng (pDNA / IL) phải chịu ứng suất cắt siêu âm trong 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 và 120 phút và phức hợp với chất phân phối gen cation có sẵn trên thị trường lipofectamine, tỷ lệ tế bào dương tính huỳnh quang là 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% và 50% tương ứng (xem biểu đồ bên dưới). Tỷ lệ phần trăm của các tế bào dương huỳnh quang tăng lên khi các cấu trúc nano chịu ứng suất cắt siêu âm trong 10 và 20 phút, và sau đó giảm chậm.

Ảnh hưởng của chất lỏng ion [Bmim][PF6] đến việc cung cấp DNA plasmid đến các tế bào COS7. Các phức hợp nano plasmid DNA / IL (chất lỏng ion) phải chịu ứng suất cắt siêu âm trong tối đa 120 phút và phức hợp với LA trước khi đưa vào tế bào COS7. Dữ liệu cho thấy số lượng trung bình (%) tế bào HeLa dương tính GFP được tính trong 10 trường vi mô khác nhau và thí nghiệm được thực hiện nhiều lần trong ba ngày khác nhau. (Nghiên cứu và biểu đồ: ©Sarker et al., 2019)

Chuẩn bị siêu âm Lysate

Giao thức ly giải tế bào siêu âm
Bắt đầu với một mẫu tế bào phong phú được chuẩn bị thông qua phương pháp tách tế bào (ví dụ: tách tế bào miễn dịch từ, phân loại tế bào kích hoạt huỳnh quang (FACS), ly tâm gradient mật độ, cách ly tế bào mật độ miễn dịch).
Các mẫu tế bào phải hiển thị một khối lượng của một bộ đệm ly giải phù hợp với mục tiêu thử nghiệm và siêu âm loại thăm dò.
Bộ đệm hypotonic được ưa thích vì chúng tăng cường ly giải tế bào siêu âm. Điều quan trọng là các chất phụ gia và nồng độ muối được sử dụng một cách thích hợp.
Chọn thiết bị ly giải siêu âm của bạn: Đối với sonication gián tiếp của lọ, VialTweeter hoặc CupHorn được khuyến khích. Đối với tấm multiwell, UIP400MTP là ultrasonicator lý tưởng. Và sonication kiểu thăm dò cổ điển, một máy đồng nhất siêu âm như UP100H hoặc UP200Ht với một đầu vi mô là phù hợp nhất.
Giao thức cho sonication loại đầu dò: Đặt đầu dò siêu âm vào thể tích mẫu trong ống vi ly tâm và sonicate trong khoảng 10 giây. Tùy thuộc vào mẫu DNA, sonication có thể được lặp lại một hoặc hai lần nữa. Đầu vào năng lượng siêu âm cần thiết (Ws / mL) phụ thuộc vào độ nhớt của mẫu và loại DNA. Làm mát thông qua bồn nước đá và chế độ xung của ultrasonicator giúp ngăn chặn rằng mẫu bị suy thoái nhiệt.
Sau khi ly giải siêu âm, mẫu được ly tâm để tách các mảnh vụn viên (chứa các tế bào, nhân và bào quan chưa phân giải)
Nếu mẫu không được xử lý ngay lập tức, nó có thể được bảo quản ở nhiệt độ thích hợp để bảo quản khả năng tồn tại của nó.

Ultrasonicators cho DNA phân mảnh

Hielscher Ultrasonics cung cấp các nền tảng dựa trên siêu âm khác nhau cho DNA, RNA, và phân mảnh chromatin. Các nền tảng khác nhau này bao gồm đầu dò siêu âm (sonotrodes), giải pháp sonication gián tiếp để chuẩn bị mẫu đồng thời nhiều ống hoặc tấm đa giếng (ví dụ: tấm 96 giếng, tấm microtiter), sonoreactor và cuphorns siêu âm. Tất cả các nền tảng để cắt DNA được cung cấp bởi bộ vi xử lý siêu âm hiệu suất cao, điều chỉnh tần số, có thể kiểm soát chính xác và mang lại kết quả tái tạo.

Bộ vi xử lý siêu âm cho bất kỳ số lượng mẫu và kích thước

Với siêu âm đa mẫu của Hielscher VialTweeter (cho đến 10 ống nghiệm) và UIP400MTP (đối với microplates / tấm multiwell), nó trở nên dễ dàng có thể giảm thời gian xử lý mẫu do ultrasonication cường độ cao và chính xác có thể kiểm soát trong khi có được sự phân bố kích thước đoạn DNA mong muốn và năng suất. Phân mảnh DNA siêu âm làm cho các bước chuẩn bị plasmid hiệu quả, đáng tin cậy và có thể mở rộng. Các giao thức có thể được chia tỷ lệ tuyến tính từ một đến nhiều mẫu bằng cách áp dụng các thông số siêu âm không đổi.
Thăm dò ultrasonicators với một đến năm ngón tay là lý tưởng cho việc chuẩn bị các số mẫu nhỏ hơn. Ultrasonicators phòng thí nghiệm của Hielscher có sẵn với các mức năng lượng khác nhau để bạn có thể chọn chất phá vỡ siêu âm lý tưởng cho ứng dụng liên quan đến DNA của bạn.