Plasmid chuẩn bị bằng cách sử dụng Ultrasonication

Ultrasonication là một kỹ thuật đáng tin cậy để phân mảnh DNA plasmid. Biên độ có thể kiểm soát chính xác, chế độ xung và kiểm soát nhiệt độ là những tính năng quan trọng nhất của một ultrasonicator cho sự phân mảnh plasmid không gây hại. Ngoài ra, việc sử dụng một số tác nhân nhất định giúp bảo vệ chống lại sự xuống cấp plasmid. Hielscher Ultrasonics cung cấp các giải pháp khác nhau cho sự phân mảnh plasmid được kiểm soát từ các lọ đơn lẻ, đồng thời sonication của nhiều mẫu cũng như các tấm đa giếng. Tìm hiểu thêm về phân mảnh plasmid siêu âm thành công!

Plasmid Shearing bằng ultrasonication

Khi các mẫu DNA phải chịu sóng siêu âm, các rung động được tạo ra bằng siêu âm tạo ra sự xâm thực âm thanh trong chất lỏng cắt hoặc phá vỡ các phân tử DNA trọng lượng phân tử cao thông qua các lực cơ học. Sonication là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất cho các thí nghiệm cắt DNA hàng loạt bao gồm các ứng dụng, chẳng hạn như Kết tủa miễn dịch Chromatin (ChIP), mà kích thước mảnh nhỏ là hoàn toàn quan trọng để có được độ phân giải cao. (xem Tseng và cộng sự, 2012)
Plasmid DNA (pDNA) là dạng DNA cụ thể, được đặc trưng bởi hình dạng vòng của nó và được tìm thấy ở vi khuẩn và một số sinh vật nhân chuẩn.
pDNA siêu lạnh là dạng DNA plasmid mong muốn vì nó cho thấy kết quả tốt nhất trong các quy trình xuống dòng như giải trình tự và chuyển đổi tự động. Ultrasonication là thích hợp để phân mảnh pDNA, bao gồm cả pDNA siêu lạnh, thành công.
Thompson et al. (2008) đã chứng minh rằng plasmid sonication, được biết đến với dna siêu mỏng phân mảnh, là một cách hiệu quả để cải thiện độ dài đọc phred20 trình tự đến mức chúng không khác biệt đáng kể so với mẫu điều khiển của Beckman Coulter hoặc plasmid tuyến tính hóa enzyme.

Sử dụng vectơ Plasmid

Plasmid thường được sử dụng làm công cụ để nhân bản, chuyển giao và thao tác gen. Khi plasmid được sử dụng thử nghiệm cho các mục đích này, chúng được gọi là vectơ. Các đoạn DNA hoặc gen có thể được đưa vào vectơ plasmid, tạo ra cái gọi là plasmid tái tổ hợp. Vectơ Plasmid được sử dụng làm phương tiện để điều khiển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ và là thành phần quan trọng của nhân bản phân tử.
“Các vectơ không phải virus đang được nghiên cứu rộng rãi về việc sử dụng tiềm năng của chúng trong liệu pháp gen để điều trị các bệnh phức tạp khác nhau. Các vectơ không phải virus bảo vệ DNA plasmid chống lại sự suy thoái vật lý, hóa học và enzyme và đưa phân tử DNA đến vị trí đích. Ví dụ, liposome cation, chitosan và các hạt nano tích điện dương khác tạo thành phức hợp với DNA plasmid thông qua các tương tác tĩnh điện. Tuy nhiên, các phức hợp liposome / plasmid DNA cationic dễ hình thành tương đối lớn (tức là 300–400 nm) và không đồng nhất trong tự nhiên khiến chúng khó sử dụng trong các ứng dụng dược phẩm. Các lớn và không đồng nhất plasmid DNA/liposomes, plasmid DNA/aerosols, và plasmid DNA/peptides phức tạp có thể được giảm xuống nhỏ hơn, và các hạt đồng nhất bằng cách sử dụng ultrasonication.” (Sarker và cộng sự, 2019)
Một ví dụ nổi bật cho việc sử dụng vectơ plasmid là CRISPR–Cas9. Hệ thống CRISPR-Cas9 thường được phân phối đến các tế bào dưới dạng một plasmid lớn duy nhất hoặc nhiều plasmid nhỏ hơn mã hóa một chuỗi mục tiêu, một hướng dẫn CRISPR và Cas9.

Chuẩn bị siêu âm các hạt nano PLGA nạp DNA bằng cách kết tủa nano

Jo et al. (2020) đã sử dụng poly (axit lactic-co-glycolic) (PLGA) để tạo thành chất mang hạt nano để cung cấp một mô hình CRISPR–Cas9 plasmid vào các đại thực bào có nguồn gốc từ tủy xương nguyên phát. Đối với sự kết tủa nano của các hạt nano PLGA, PLGA với hai nhóm cuối khác nhau (nhóm este và amin) đã được sử dụng với mục tiêu là các nắp cuối amin tích điện dương làm tăng hiệu quả đóng gói và tải do tương tác điện tích giữa nó và xương sống tích điện âm của DNA. Trong một ống ly tâm hình nón polypropylen 50 mL, 100 mg Pluronic F127 đã được hòa tan trong 20 mL nước DI hấp tiệt trùng bằng cách trộn xoáy sau đó là 30 phút sonication nhẹ nhàng bằng cách sử dụng một bồn tắm siêu âm (xem CupHorn). Một thanh khuấy từ tính hấp tiệt trùng đã được thêm vào và dung dịch được trộn ở tốc độ 600 vòng / phút trong 30 phút trong khi các dung dịch khác được tạo ra. Đồ dùng thí nghiệm bằng nhựa đã được sử dụng thay vì đồ thủy tinh trong suốt để giảm thiểu sự hấp phụ không đặc hiệu của DNA. Các dung dịch PLGA hòa tan trong DMF (44,48 mg/ ml) và TIPS pentacene hòa tan trong THF (0,667 mg/ml) được pha chế riêng. PLGA không ngừng bị ướt trong DMF trong 30 phút trước khi được sonicated trong 30 phút. (để biết giao thức đầy đủ, hãy xem Jo và cộng sự, 2020)

Bảo vệ DNA Plasmid trong Sonication

DNA bao gồm plasmid và plasmid siêu mỏng là sự xuống cấp rất nhạy cảm. Tất cả các phương pháp phân mảnh có sẵn được biết đến với những nhược điểm nhất định. Siêu âm DNA phân mảnh là một trong những phương pháp ưa thích kể từ khi sonication kiểm soát kết hợp với các biện pháp bảo vệ cho phép để giảm cắt- và nhiệt gây ra thiệt hại của các sợi DNA.
Bên cạnh cài đặt biên độ thấp, chế độ xung và kiểm soát nhiệt độ trong quá trình cắt DNA siêu âm, việc sử dụng một số tác nhân cho thấy hiệu quả bảo vệ đáng kể chống lại sự suy thoái DNA. Ví dụ, các polyme khác nhau, peptide, và lipid bảo vệ DNA plasmid trong quá trình ultrasonication.

Sự ổn định của PLASMID DNA và plasmid DNA / IL nanocomplexes chống lại ứng suất cắt siêu âm đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng xét nghiệm điện di gel agarose. Cả hai plasmid DNA và plasmid DNA / IL nanocomplexes đã phải chịu ứng suất cắt siêu âm cho các điểm thời gian khác nhau. DNA plasmid đã tiếp xúc với ứng suất cắt siêu âm trong 0, 10, 20, 30 và 40 phút. Tuy nhiên, các plasmid DNA / IL nanocomplexes đã tiếp xúc với ứng suất cắt siêu âm trong 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 và 120 phút.
(nghiên cứu và hình ảnh: ©Sarker và cộng sự, 2019)

Sarker et al. (2019) đã chứng minh rằng khi cấu trúc nano PLASMID DNA / chất lỏng ion (pDNA / IL) phải chịu ứng suất cắt siêu âm trong 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 và 120 phút và phức tạp với chất phân phối gen cation có sẵn trên thị trường lipofectamine, tỷ lệ phần trăm tế bào dương tính huỳnh quang là 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, Lần lượt là 65% và 50% (xem biểu đồ bên dưới). Tỷ lệ phần trăm các tế bào dương tính huỳnh quang tăng lên khi các cấu trúc nano phải chịu ứng suất cắt siêu âm trong 10 và 20 phút, và sau đó giảm chậm.

Ảnh hưởng của chất lỏng ion [Bmim][PF6] đến việc cung cấp DNA plasmid đến các tế bào COS7. Plasmid DNA / IL (chất lỏng ion) nanocomplexes đã phải chịu ứng suất cắt siêu âm trong tối đa 120 phút và phức tạp với LA trước khi đưa vào tế bào COS7. Dữ liệu cho thấy số lượng trung bình (%) các tế bào HeLa dương tính với GFP được tính trong 10 trường vi mô khác nhau và thí nghiệm được thực hiện nhiều lần vào ba ngày khác nhau. (Nghiên cứu và biểu đồ: ©Sarker và cộng sự, 2019)

Chuẩn bị Lysate siêu âm

Giao thức ly giải tế bào siêu âm
Bắt đầu với một mẫu tế bào được làm giàu được điều chế thông qua phương pháp tách tế bào (ví dụ: tách tế bào từ tính miễn dịch, phân loại tế bào hoạt hóa huỳnh quang (FACS), ly tâm gradient mật độ, phân lập tế bào miễn dịch).
Các mẫu tế bào phải hiển thị một khối lượng của một bộ đệm ly giải thích hợp cho các mục tiêu thí nghiệm và ultrasonicator loại thăm dò.
Bộ đệm Hypotonic được ưa thích khi chúng tăng cường ly giải tế bào siêu âm. Điều quan trọng là các chất phụ gia và nồng độ muối được sử dụng một cách thích hợp.
Chọn thiết bị ly giải siêu âm của bạn: Đối với sonication gián tiếp của lọ, VialTweeter hoặc CupHorn được khuyến khích. Đối với các tấm multiwell, UIP400MTP là ultrasonicator lý tưởng. Và sonication kiểu đầu dò cổ điển, một bộ đồng nhất siêu âm như UP100H hoặc UP200Ht với một đầu vi mô là phù hợp nhất.
Giao thức cho sonication loại thăm dò: Đặt đầu dò ultrasonicator vào thể tích mẫu trong một ống microcentrifuge và sonicate trong khoảng 10 giây. Tùy thuộc vào mẫu DNA, sonication có thể được lặp lại một hoặc hai lần nữa. Đầu vào năng lượng siêu âm cần thiết (Ws / mL) phụ thuộc vào độ nhớt của mẫu và loại DNA. Làm mát thông qua tắm nước đá và chế độ xung của ultrasonicator giúp ngăn chặn rằng mẫu bị thoái hóa nhiệt.
Sau khi ly giải siêu âm, mẫu được ly tâm để tách các mảnh vụn viên (chứa các tế bào chưa được phân tách, nhân và bào quan chưa được tách ra)
Nếu mẫu không được xử lý ngay lập tức, nó có thể được bảo quản ở nhiệt độ thích hợp để bảo tồn khả năng tồn tại của nó.

Ultrasonicators cho DNA Fragmentation

Siêu âm Hielscher cung cấp các nền tảng dựa trên siêu âm khác nhau cho DNA, RNA và phân mảnh nhiễm sắc thể. Các nền tảng khác nhau này bao gồm đầu dò siêu âm (sonotrodes), giải pháp sonication gián tiếp để chuẩn bị mẫu đồng thời của nhiều ống hoặc tấm đa giếng (ví dụ: tấm 96 giếng, tấm microtiter), sonoreactors và cuphorn siêu âm. Tất cả các nền tảng để cắt DNA được cung cấp bởi các bộ xử lý siêu âm hiệu suất cao, được điều chỉnh tần số, có thể kiểm soát chính xác và mang lại kết quả tái tạo.

Bộ xử lý siêu âm cho bất kỳ số mẫu và kích thước

Với Hielscher của multi-sample ultrasonicators VialTweeter (cho đến 10 ống nghiệm) và UIP400MTP (cho microplates/ multiwell tấm) nó trở nên dễ dàng để giảm thời gian xử lý mẫu do ultrasonication cường độ cao và chính xác có thể kiểm soát trong khi có được sự phân bố kích thước đoạn DNA mong muốn và năng suất. Phân mảnh DNA siêu âm làm cho các bước chuẩn bị plasmid hiệu quả, đáng tin cậy và có thể mở rộng. Các giao thức có thể được chia tỷ lệ tuyến tính từ một đến nhiều mẫu bằng cách áp dụng các thông số siêu âm liên tục.
Đầu dò ultrasonicators với một đến năm ngón tay là lý tưởng cho việc chuẩn bị các số mẫu nhỏ hơn. Máy siêu âm phòng thí nghiệm của Hielscher có sẵn với các mức công suất khác nhau để bạn có thể chọn bộ phá vỡ siêu âm lý tưởng cho ứng dụng liên quan đến DNA của bạn.