Công nghệ siêu âm Hielscher

Phân tách E.coli bằng siêu âm

  • Vi khuẩn E. coli là vi khuẩn được sử dụng phổ biến nhất trong vi sinh học và công nghệ.
  • Phá vỡ tế bào siêu âm cung cấp kết quả đáng tin cậy và tái sản xuất cho việc lysis của E. coli.
  • Mạnh mẽ nhưng chính xác kiểm soát cavitation và lực cắt dẫn đến sự gián đoạn hoàn toàn và sản lượng khai thác cao (ví dụ như protein, DNA).

Sự gián đoạn tế bào bởi cavitation

Vi khuẩn Escherichia coli được lysed đáng tin cậy bằng cách sử dụng siêu âm mô homogenizers.Siêu âm đầu dò-loại homogenizers hoạt động với khoảng 20.000 chu kỳ mỗi giây (tại 20kHz) và gây ra cavitation trong chất lỏng hoặc supsensions. Acoustic cavitation các khu vực vi mô của chân không giống như áp lực và nhiệt độ cao mà xé các tế bào ngoài. Mặc dù nhiệt độ có thể đạt đến vài nghìn độ c, khối lượng cavitation quá nhỏ họ không làm nóng quá trình đáng kể. Siêu âm tạo ra cavitation âm thanh và lực cắt xuyên thủng hoặc phá vỡ màng tế bào của E. coli – tùy thuộc vào cài đặt thiết bị của homogenizer siêu âm.

Ưu điểm của siêu âm lysis

  • kiểm soát chính xác các lysis (cường độ, biên độ, Nhiệt Ðộ)
  • thích ứng tối ưu với các mẫu cụ thể
  • kiểm soát nhiệt độ
  • cho các mẫu rất nhỏ đến rất lớn (μL đến lít)
  • điều trị cơ học tinh khiết
  • quy mô tuyến tính-lên từ phòng thí nghiệm để sản xuất
Thiết bị siêu âm VialTweeter cho phép chuẩn bị mẫu đồng thời lên đến 10 lọ trong điều kiện quá trình tương tự. (Click vào để phóng to!)

VialTweeter cho siêu âm lysis

Yêu cầu thông tin




Lưu ý của chúng tôi Chính sách bảo mật.


Trong khi hóa chất và enzyme lysis có thể có vấn đề – kể từ sự lysis hóa học có thể làm thay đổi cấu trúc protein và giới thiệu các vấn đề thanh lọc và phân ly enzym đòi hỏi thời lần ủ lâu và không thể sanh sản được – gián đoạn siêu âm là một phương pháp phá vỡ tế bào nhanh chóng, tinh vi.
Siêu âm lysis chỉ dựa trên lực cơ học. Không có hóa chất được thêm vào, sonication phá vỡ thành tế bào bằng lực cắt. Hóa học có thể làm thay đổi cấu trúc protein và giới thiệu các vấn đề thanh lọc. Sự gián đoạn enzym đòi hỏi thời gian ủ bệnh lâu dài và không thể tái sản xuất. Sự gián đoạn tế bào siêu âm của các tế bào vi khuẩn E.coli là nhanh chóng, đơn giản, đáng tin cậy và tái sản xuất. Đó là lý do tại sao Ultrasonicators Hielscher được sử dụng trong các phòng thí nghiệm sinh học và sinh hóa trên toàn thế giới để chuẩn bị mẫu, tiền ananlytics, diagonstics trong ống nghiệm và xét nghiệm đa dạng.

Khuyến nghị chung

UP400St ultrasonicator với lò phản ứng dòng chảySonication là kỹ thuật phổ biến nhất cho lysing rất nhỏ, Trung bình và số lượng lớn của đình chỉ tế bào – từ Pico-lít lên đến 100L/giờ (sử dụng một tế bào dòng siêu âm). Các tế bào được lysed bằng chất lỏng cắt và cavitation. DNA cũng được sheared trong sonication, vì vậy nó không phải là cần thiết để thêm DNase để đình chỉ tế bào.
Kiểm soát nhiệt độ:
Bằng cách làm mát trước mẫu và giữ mẫu trong sonication trên băng, mẫu suy thoái nhiệt của mẫu có thể dễ dàng ngăn chặn.
Lý tưởng nhất, các mẫu nên được giữ băng-lạnh trong quá trình lysis, nhưng đối với hầu hết các mẫu nó đủ nếu nhiệt độ không tăng lên trên nhiệt độ của văn hóa hoặc mô nguồn. Do đó nó được khuyến khích, để giữ cho hệ thống treo trên băng và sonicate với một số xung ngắn Ultrasonics của 5-10 giây và tạm dừng của 10-30 giây. Trong quá trình tạm dừng, nhiệt có thể tiêu tan để thiết lập lại nhiệt độ thấp. Đối với các mẫu tế bào lớn hơn, các lò phản ứng tế bào dòng chảy với áo khoác làm mát có sẵn.

Giao thức chuẩn bị cho E. coli Lysates

Phân tích biểu hiện và thanh lọc protein tái tổ hợp

E. coli pellet được sonicated với một hệ thống siêu âm UP100H (Hielscher). Cho mục đích này, viên tế bào được resuspended trong ướp lạnh lysis đệm (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) và làm mát trên băng trong 10 phút. Sau đó, đình chỉ tế bào được sonicated với 10 chùm ngắn 10 s tiếp theo là khoảng 30 s để làm mát. Cuối cùng, các mảnh vỡ tế bào đã được gỡ bỏ bởi ultracentrifuenem ở 4 ° c cho 15 phút tại 14000 rpm. Để xác nhận biểu hiện rPR, phần phía trên được chạy trên 12% gel polyacrylamide và phân tích bởi SDS-PAGE và blotting phương Tây. Thanh lọc rPR đã được thực hiện bằng ni2 +-Nhựa NTA (Invitrogen, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong giai đoạn này, phương pháp thanh lọc bản địa đã được sử dụng. Độ tinh khiết của protein thanh tẩy được đánh ước bằng điện di trên gel polyacrylamide 12% và nhuộm màu xanh Coomassie tiếp theo. Nồng độ protein tinh khiết được đo bằng bộ protein khảo nghiệm Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Siêu âm tế bào phá vỡ UP100H (100W) để lysis, tế bào gián đoạn và cắt DNA.

Siêu âm homogenizer UP100H 100W

Tăng trưởng tế bào, crosslinking và chuẩn bị của E. coli tế bào chiết xuất

Đối với SeqA và RNA polymerase ChIP-chip E. coli MG1655 hoặc MG1655 ΔseqA đã được trồng ở 37 ° c đến một OD600 khoảng 0,15 trong 50 ml LB (+ 0,2% glucose) trước 27 μL formaldehyde (37%) mỗi ml vừa được thêm vào (nồng độ cuối cùng 1%). Crosslinking được thực hiện tại chậm lắc (100 rpm) ở nhiệt độ phòng trong 20 phút tiếp theo là dập tắt với 10 ml 2,5 m Glycine (cuối cùng nồng độ 0,5 M). Đối với thí nghiệm sốc nhiệt, E. coli MG1655 đã được trồng trong 65 ml trung bình ở 30 ° c đến một OD600 khoảng 0,3. Sau đó 30 ml văn hóa được chuyển đến một flask ấm trước ở 43 ° c và phần còn lại giữ ở 30 ° c. Crosslinking và dập tắt là như mô tả ở trên, ngoại trừ các tế bào được lưu giữ ở 30 hoặc 43 ° c trong 5 phút trước khi tiếp tục chậm lắc ở nhiệt độ phòng. Các tế bào được thu thập bằng cách ly tâm và rửa hai lần với TBS lạnh (pH 7,5). Sau khi resuspension trong 1 ml lysis đệm (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sucrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozyme) và ủ bệnh ở 37 ° c cho 30 phút tiếp theo là thêm 4 ml IP đệm, các tế bào được sonicated trên băng với 12 lần 30 giây và 30 giây Một UP400St bộ vi xử lý siêu âm (Hielscher Ultrasonics GmbH) với 100% điện. Sau khi ly tâm trong 10 phút tại 9000 g, 800 μL aliquotes của phần phía trên được lưu trữ ở-20 ° c. (Waldminghaus 2010)

Sản xuất quá mức và thanh lọc các enzym.

Đối với dư thừa của decahistidine (His10)-Tagged protein, E. coli BL21 (DE3) đã được chuyển đổi với pET19b xây dựng. Một chiếc preculture qua đêm được thu hoạch bằng cách ly tâm, và 1% được sử dụng để cấy một văn hóa biểu hiện. Các tế bào mang pET19mgtB đã được trồng ở 22 ° c cho đến khi một mật độ quang học tại 600 nm (OD600) của 0,7. Văn hóa đã được chuyển đến 17 ° c và gây ra bởi 100 μM IPTG. Sau 16 h, văn hóa được thu hoạch bằng cách ly tâm tại 7.500 × g ở 4 ° c. Các tế bào được resuspended trong 50 mM muối-đệm (PBS) với 0,3 M NaCl ở pH 7,4 và bị gián đoạn bởi ultrasonication với một S2 Micro-tip sonotrode tại UP200ST ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Đức) tại một chu kỳ của 0,5 và một biên độ 75%.
Quá trình sản xuất decahistidine-Tagged GtfC đã gây ra ở 37 ° c tại một OD600 của 0,6 với 100 μM IPTG. Các tế bào sau đó được ấp cho 4 h, thu hoạch, và lysed như đã nêu ở trên cho MgtB.
Chất chiết xuất từ tế bào thô được ly tâm tại 15.000 × g và 4 ° c đến trầm tích các mảnh vụn của tế bào. Các chiết xuất làm rõ đã được nạp trên 1 ml HisTrap FF cột thô bằng cách sử dụng một hệ thống ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Các enzyme được tinh chế theo giao thức của nhà sản xuất để elution gradient của ông-Tagged protein. Các dung môi protein eluted đã hai lần chống lại 1.000 tập 50 mM PBS, pH 7,4, với 0,3 M NaCl ở 4 ° c. Việc thanh lọc được phân tích bằng 12% SDS-PAGE. Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford sử dụng Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Đức). (Rabausch et al. 2013)

Khai thác protein từ vi khuẩn E. coli
Một protein mồi của quan tâm (trong trường hợp này, MTV1 của Arabidopsis thaliana) là hợp đồng với một thẻ GST và thể hiện trong BL21 Escherichia coli (E. coli) tế bào.
1. Lấy một miếng GST-MTV1 và GST (tương ứng với 50 ml vi khuẩn văn hóa) và resuspend mỗi trong 2,5 mL băng khai thác lạnh đệm.
2. sử dụng một ultrasonicator UP100H (được trang bị MS3 microtip-sonotrode cho khối lượng nhỏ (2-5mL)) để phá vỡ các tế bào vi khuẩn cho đến khi chúng được lysed, được chỉ định bằng cách giảm Opacity và tăng độ nhớt. Điều này đã được thực hiện trên băng, và nó được khuyến khích để sonicate trong khoảng thời gian (ví dụ như 10 giây sonicating theo sau 10 giây trên băng và như vậy). Chăm sóc phải được thực hiện không sonicate với cường độ quá cao. Nếu phát hiện tạo bọt hoặc hình thành kết tủa màu trắng, cường độ cần phải được hạ xuống.
3. chuyển dung dịch vi khuẩn lysed sang ống ly tâm 1,5 mL và máy ly tâm ở 4 ° c, 16.000 x g trong 20 phút.

Allicin-sửa đổi protein trong E. coli

Các vialtweeter là một ultrasonicator thoải mái cho mẫu nhỏ đồng nhấtXác định sulfhydryl nội dung của 5, 5 '-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Assay
An E. coli MG1655 văn hóa qua đêm đã được sử dụng để cấy MOPS trung bình tối thiểu (1:100). Các văn hóa đã được trồng aerobically cho đến khi một A600 All của 0,4 đã đạt được. Các nền văn hóa được chia thành 3 15-ml văn hóa để điều trị căng thẳng. Một văn hóa không được điều trị phục vụ như là một điều khiển tiêu cực. 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) hoặc đường kính 1 mM được thêm vào một trong hai nền văn hóa còn lại. Các nền văn hóa được ấp ủ trong 15 phút 5 ml mỗi văn hoá được thu hoạch bằng cách ly tâm (8.525 × g, 4 ° c, 10 phút). Các tế bào được rửa hai lần với 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2Của HPO4, 2 mM KH2Po4, pH 7,4, được lưu trữ anaerobically trước khi sử dụng) và ly tâm (13.000 × g, 4 ° c, 10 phút). Các tế bào được resuspended trong lysis đệm (PBS với 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) trước khi phá vỡ ở 4 ° c bởi ultrasonication (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Đức) (3 × 1 phút). Các mảnh vụn tế bào được thức bằng cách ly tâm (13.000 × g, 4 ° c, 15 phút). Phần phía trên được chuyển sang 3,5-ml QS-macro Cuvette (10 mm) với một thanh khuấy từ và trộn với 1 ml lysis đệm. Sự tuyệt chủng của các mẫu đã được theo dõi tại 412 nm với một máy đo quang phổ Jasco V-650 trang bị với PSC-718 nhiệt độ điều khiển giữ tế bào (Jasco) ở nhiệt độ phòng. 100 μL của một giải pháp 3 mM dithiobis (2-nitrobenzoic acid) được thêm vào. Sự tuyệt chủng đã được theo dõi cho đến khi nó đạt đến độ bão hòa. Tính toán nồng độ thiol được thực hiện bằng cách sử dụng hệ số tuyệt chủng ε412 = 13.700 M-1 Cm-1 Đối với Thio-2-nitrobenzoic acid (TNB). Nồng độ thiol di động được tính toán dựa trên một khối lượng tế bào E. coli của 6,7 × 10-15 lít và mật độ tế bào của A600 = 0,5 (tương đương với 1 × 108 tế bào ml-1 văn hóa). (Müller et al. 2016)

Trong xác định Vivo Glutathione

E. coli MG1655 đã được trồng tại MOPS trung bình tối thiểu trong một khối lượng tổng cộng 200ml cho đến khi A A600 của 0,5 đã đạt được. Các nền văn hóa được chia thành 50-ml văn hóa để điều trị căng thẳng. Sau 15 phút ủ bệnh với 0,79 mM allicin, 1 mM diamide, hoặc dimethyl sulfoxide (kiểm soát), các tế bào được thu hoạch tại 4, 000g ở 4 ° c trong 10 phút. các tế bào đã được rửa sạch hai lần với KPE đệm trước khi resuspension của bột viên trong 700 μL KPE đệm. Đối với deproteination, 300l của 10% (w/v) acid acid đã được thêm vào trước khi sự gián đoạn của các tế bào bằng ultrasonication (3 x 1 phút; VialTweeter ultrasonicator). Supernatants được thu thập sau khi ly tâm (30 phút, 13, 000g, 4 ° c). Nồng độ sulfosalicylic acid được giảm xuống còn 1% do việc bổ sung 3 khối lượng bộ đệm KPE. Các phép đo của tất cả các Glutathione và GSSG được thực hiện như mô tả ở trên. Nồng độ Glutathione di động được tính toán dựa trên khối lượng tế bào E. coli của 6,7×10-15 lít và mật độ tế bào của A600 0.5 (tương đương với 1×108 tế bào ml-1 văn hóa). Nồng độ GSH được tính toán bằng cách trừ 2 [GSSG] từ tổng Glutathione. (Müller et al. 2016)

Siêu âm phá vỡ cho tế bào lysis và khai thác vật liệu sinh học (Click vào để phóng to!)

Máy siêu âm loại đầu dò UP400St

Biểu hiện của con người mAspAT trong E. coli

Siêu âm tế bào phá vỡ UP400St (400W) để khai thác các chất nội bào (ví dụ như protein, organelles, DNA, RNA vv)Thuộc địa duy nhất của E. coli BL21 (DE3) làm nhiễu vector biểu hiện trong 30 mL trung bình Luria-Bertani (LB) có chứa 100μg/mL Ampicillin, và sau đó gieo trồng ở 37 º C cho đến khi mật độ quang học (OD600) đạt 0,6. Các tế bào được thu hoạch bằng máy ly tâm ở 4.000 × g trong 10 phút, và resuspended trong 3L tươi LB vừa chứa 100μg/mL Ampicillin.
Sau đó, biểu hiện protein đã gây ra với 1 mM isopropyl β-ᴅ -1-thiogalactopyranoside (IPTG) cho 20 h ở 16 º C. Các tế bào được thu hoạch bằng cách ly tâm ở 8.000 × g trong 15 phút và rửa sạch với bộ đệm A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Xấp xỉ 45g (trọng lượng ướt) các tế bào được lấy từ văn hóa 3 L. Sau khi ly tâm, các viên nén tế bào được resuspended trong 40 mL (cho 1 L văn hóa) băng khai thác lạnh A, và lysed bởi ultrasonication ở nhiệt độ lạnh bằng cách sử dụng một UP400St dụng cụ (Dr. Hielscher GmbH, Đức). Các tế bào lysis được ly tâm ở 12.000 rpm trong 15 phút để tách riêng biệt (supernatant) và kết tủa (pellet) phân số. (Jiang et al. 2015)

Bảng dưới đây cho bạn một dấu hiệu về khả năng xử lý gần đúng của máy siêu âm:

batch Khối lượng Tốc độ dòng Thiết bị khuyến nghị
0.5 đến 1.5mL N.A. VialTweeter
1 đến 500ml 10 đến 200mL / phút UP100H
10 đến 2000mL 20 đến 400mL / phút UP200Ht, UP400St
0.1 đến 20L 00,2 đến 4L / phút UIP2000hdT
10 đến 100L 2 đến 10L / phút UIP4000
N.A. 10 đến 100L / phút UIP16000
N.A. lớn hơn Cụm UIP16000

Liên hệ chúng tôi! / Hỏi chúng tôi!

Vui lòng sử dụng mẫu dưới đây, nếu bạn muốn yêu cầu thêm thông tin về đồng nhất bằng siêu âm. Chúng tôi sẽ vui lòng cung cấp cho bạn một hệ thống siêu âm đáp ứng yêu cầu của bạn.










Văn học / Tài liệu tham khảo



Sự kiện đáng biết

E coli

Escherichia coli (E. coli) là một loại vi khuẩn Gram âm, facultatively kỵ khí, hình que, thuộc chi Escherichia thường được tìm thấy trong ruột thấp hơn của các sinh vật máu nóng (endotherms). Có một số lượng lớn các chủng E. coli (hoặc các phân loại) với các đặc điểm đa dạng. Hầu hết các chủng E. coli là vô hại đối với con người, ví dụ như B và K-12 chủng được sử dụng phổ biến cho các ứng dụng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, một số chủng có hại và có thể gây ra căn bệnh nghiêm trọng.
E. coli đóng một vai trò quan trọng trong kỹ thuật sinh học hiện đại và vi sinh vật công nghiệp kể từ khi vi khuẩn dễ thao tác. Các ứng dụng phòng thí nghiệm thường có liên quan đến việc sử dụng E. coli, ví dụ như để tạo ra axit deoxyribonucleic tái tổ hợp (DNA) hoặc để hoạt động như một sinh vật mô hình.
E. coli là một máy chủ rất linh hoạt để sản xuất các protein dị thường, và các hệ thống biểu hiện protein đa dạng có sẵn để sản xuất các protein tái tổ hợp trong E. coli. Sử dụng plasmid cho phép biểu hiện mức độ cao của protein, gen có thể được đưa vào vi khuẩn, cho phép sản xuất các protein với số lượng cao trong quá trình lên men công nghiệp.
E. coli được sử dụng như một nhà máy tế bào để sản xuất insulin. Các ứng dụng khác bao gồm việc sử dụng các tế bào E. coli sửa đổi để phát triển và sản xuất vắc xin và các enzym cố định, để sản xuất nhiên liệu sinh học, cũng như để khắc phục sinh học.
Sự căng thẳng K-12 là một dạng đột biến của E. coli mà over-biểu hiện enzyme Alkaline Phosphatase (ALP). Đột biến này xảy ra do một khiếm khuyết trong gen liên tục mã cho enzyme. Nếu một gen tạo ra một sản phẩm mà không có bất kỳ sự ức chế này được gọi là hoạt động cấu. Hình thức đột biến cụ thể này được sử dụng để cô lập và thanh lọc enzyme ALP.

Siêu âm DNA Cắt

Lực cắt siêu âm là một phương pháp thường được sử dụng để tách khỏi tế bào và phá vỡ các sợi DNA thành từng mảnh. Acoustic cavitation phá vỡ các bức tường tế bào và màng để trích xuất DNA từ các tế bào và tạo ra những mảnh vỡ của khoảng 600 – 800 BP dài, đó là lý tưởng để phân tích.
Click vào đây để tìm hiểu thêm về siêu âm homogenizers cho phân mảnh DNA!