Ly giải E. Coli bằng siêu âm

Vi khuẩn E. coli là loại vi khuẩn được sử dụng phổ biến nhất trong vi sinh học và công nghệ sinh học.
Các thiết bị phá vỡ tế bào bằng siêu âm mang lại kết quả đáng tin cậy và có thể tái lập khi ly giải E. coli.
Hiện tượng xâm thực và lực cắt mạnh nhưng có thể kiểm soát chính xác giúp phá vỡ hoàn toàn tế bào và đạt hiệu suất chiết xuất cao (ví dụ: protein, DNA).

Vì sao phá vỡ tế bào E. coli bằng siêu âm là phương pháp được ưu tiên?

Máy đồng nhất siêu âm hoặc thiết bị siêu âm dạng đầu dò mang lại nhiều ưu điểm khi ly giải E. coli vì siêu âm cường độ cao phá vỡ hiệu quả thành và màng tế bào. Thiết bị siêu âm dạng đầu dò được sử dụng rộng rãi để ly giải E. coli vì những lý do sau:

Phá vỡ thành tế bào hiệu quả: E. coli có thành tế bào bán cứng cấu tạo từ peptidoglycan, có thể khó phá vỡ bằng các phương pháp ly giải truyền thống. Thiết bị siêu âm dạng đầu dò tạo ra sóng siêu âm cường độ cao, hình thành các bọt xâm thực trong chất lỏng bao quanh tế bào. Khi các bọt này sụp đổ, chúng tạo ra các tia chất lỏng tốc độ cao và sóng xung kích, gây phá vỡ cơ học thành tế bào, giải phóng hiệu quả các thành phần bên trong tế bào như các phân tử sinh học.

Tăng cường khả năng xuyên sâu: Sóng siêu âm do đầu dò / đầu phát siêu âm tạo ra có thể xuyên sâu vào mẫu, tiếp cận nhiều tế bào E. coli hơn và xử lý chúng đồng đều. Điều này giúp quá trình ly giải diễn ra đồng đều hơn trong toàn bộ mẫu, mang lại hiệu quả phá vỡ tế bào cao hơn.

Rút ngắn thời gian xử lý: Năng lượng do thiết bị siêu âm dạng đầu dò truyền vào tập trung cao và cục bộ, giúp ly giải tế bào nhanh chóng và hiệu quả. So với các phương pháp khác như phá vỡ bằng hạt hoặc ly giải bằng enzyme, xử lý siêu âm có thể ly giải E. coli trong vòng vài phút hoặc thậm chí vài giây. Trong khi nhiều kỹ thuật thay thế như đông lạnh–rã đông cần nhiều lượt xử lý, ly giải bằng siêu âm phá mở tế bào chỉ trong một bước xử lý.

Kiểm soát nhiệt độ: Các thiết bị siêu âm tiên tiến được trang bị cảm biến nhiệt độ và phần mềm thông minh, cho phép đặt nhiệt độ xử lý tối đa. Thiết bị siêu âm tự động tạm dừng khi đạt giới hạn nhiệt độ và bắt đầu quá trình xử lý siêu âm khi đạt mức nhiệt độ đã đặt. Làm lạnh mẫu trong bể nước đá là phương pháp đơn giản để duy trì nhiệt độ mẫu thấp và ngăn mẫu bị phân hủy do nhiệt.

Khả năng mở rộng quy mô: Thiết bị siêu âm dạng đầu dò có nhiều kích cỡ, từ thiết bị cầm tay đến các mẫu công nghiệp quy mô lớn. Điều này giúp chúng phù hợp để xử lý thể tích nhỏ trong phòng thí nghiệm hoặc mở rộng quy mô cho các ứng dụng xử lý sinh học lớn hơn, ví dụ: sản xuất vắc-xin hoặc sinh tổng hợp các phân tử.

Tính đa dụng: Thiết bị siêu âm có thể được sử dụng cho nhiều ứng dụng ngoài ly giải tế bào, như cắt DNA bằng lực cắt, chiết xuất protein, đồng nhất mô, phân tán hạt nano và nhũ hóa. Vì vậy, đầu tư vào thiết bị siêu âm dạng đầu dò mang lại tính đa dụng trong môi trường nghiên cứu hoặc công nghiệp.

Các máy siêu âm dạng đầu dò như UP200St là những máy đồng nhất mô và phá vỡ tế bào đáng tin cậy, do đó được sử dụng rộng rãi để chuẩn bị mẫu trong di truyền học, ví dụ như ly giải E.coli

Việc chiết xuất protein từ tế bào E.coli được thực hiện hiệu quả bằng đầu dò siêu âm UP200St

Thiết bị siêu âm dạng đầu dò mang lại nhiều ưu điểm khi ly giải E. coli. Khả năng kiểm soát đáng tin cậy và chính xác các thông số của quá trình siêu âm cho phép tối ưu hóa các thông số vận hành như công suất, thời gian và cách xử lý mẫu để đạt kết quả mong muốn.

Video hướng dẫn này giải thích loại máy siêu âm phù hợp nhất cho các công việc chuẩn bị mẫu như ly giải, phá vỡ tế bào, phân lập protein, phân mảnh DNA và RNA trong phòng thí nghiệm, phân tích và nghiên cứu. Hãy chọn loại máy siêu âm lý tưởng cho ứng dụng, thể tích mẫu, số lượng mẫu và năng suất xử lý của quý vị. Hielscher Ultrasonics có máy đồng hóa siêu âm lý tưởng dành cho quý vị!

Phân mảnh DNA bằng siêu âm thường được sử dụng làm bước chuẩn bị mẫu trong giải trình tự thế hệ mới (NGS)

Phân tích điện di DNA hệ gen của E. coli EDL933 được xử lý siêu âm trong 0 – 15 min. L biểu thị thang chuẩn DNA.
(nghiên cứu và hình ảnh: ©Basselet et al. 2008)

Phá vỡ tế bào bằng hiện tượng xâm thực siêu âm

Máy đồng nhất siêu âm dạng đầu dò hoạt động với khoảng 20.000 chu kỳ mỗi giây (ở 20kHz) và gây ra hiện tượng xâm thực trong chất lỏng hoặc huyền phù. Hiện tượng xâm thực âm tạo ra các vùng vi mô có áp suất gần như chân không và nhiệt độ cao, làm xé vỡ tế bào. Mặc dù nhiệt độ có thể đạt tới vài nghìn độ C, các vùng xâm thực có thể tích nhỏ đến mức không làm tăng đáng kể nhiệt độ của quá trình. Hiện tượng xâm thực âm và lực cắt do siêu âm tạo ra làm thủng hoặc phá vỡ màng tế bào của các tế bào vi khuẩn như E.coli. Thiết bị siêu âm Hielscher cho phép kiểm soát chính xác các thông số quá trình như cường độ siêu âm, biên độ, năng lượng đầu vào và nhiệt độ. Nhờ đó, quá trình ly giải bằng siêu âm có thể được điều chỉnh tối ưu theo loại tế bào, mẫu nuôi cấy tế bào và mục tiêu của quá trình.

Ưu điểm của ly giải bằng siêu âm

kiểm soát chính xác quá trình ly giải (cường độ, biên độ, nhiệt độ)
kết quả đáng tin cậy, có khả năng tái lập
điều chỉnh tối ưu cho từng mẫu cụ thể
kiểm soát nhiệt độ
dành cho mẫu có thể tích từ rất nhỏ đến rất lớn (từ µL đến lít)
xử lý hoàn toàn bằng cơ học
vận hành an toàn, thân thiện với người dùng
mở rộng quy mô tuyến tính từ phòng thí nghiệm đến sản xuất

Thiết bị siêu âm VialTweeter cho phép chuẩn bị mẫu đồng thời trong tối đa 10 lọ với cùng điều kiện xử lý. (Nhấp để phóng to!)

VialTweeter để ly giải bằng siêu âm

Máy đồng nhất siêu âm so với các kỹ thuật ly giải khác

Trong khi ly giải bằng hóa chất và enzyme có thể gây khó khăn – vì ly giải bằng hóa chất có thể làm thay đổi cấu trúc protein và gây ra các vấn đề trong quá trình tinh sạch, còn ly giải bằng enzyme đòi hỏi thời gian ủ dài và không có khả năng tái lập – phá vỡ tế bào bằng siêu âm là một phương pháp tinh vi và nhanh chóng.
Ly giải bằng siêu âm chỉ dựa trên lực cơ học. Không bổ sung hóa chất; quá trình xử lý bằng siêu âm phá vỡ thành tế bào bằng lực cắt. Ly giải bằng hóa chất có thể làm thay đổi cấu trúc protein và gây ra các vấn đề trong quá trình tinh sạch. Phá vỡ tế bào bằng enzyme đòi hỏi thời gian ủ dài và không có khả năng tái lập. Phá vỡ tế bào vi khuẩn E.coli bằng siêu âm diễn ra nhanh chóng, đơn giản, đáng tin cậy và có khả năng tái lập. Đó là lý do thiết bị siêu âm Hielscher được sử dụng trong các phòng thí nghiệm sinh học và hóa sinh trên khắp thế giới để chuẩn bị mẫu, xử lý tiền phân tích, chẩn đoán in vitro và thực hiện nhiều loại xét nghiệm.

Khuyến nghị chung về ly giải bằng siêu âm

Xử lý bằng siêu âm là kỹ thuật phổ biến nhất để ly giải huyền phù tế bào với lượng rất nhỏ, trung bình và lớn – từ picolít đến 100L/hr (sử dụng buồng dòng chảy siêu âm). Tế bào được ly giải nhờ lực cắt trong chất lỏng và hiện tượng xâm thực. DNA cũng bị cắt đứt trong quá trình xử lý bằng siêu âm, vì vậy không cần bổ sung DNase vào huyền phù tế bào.

Kiểm soát nhiệt độ trong quá trình ly giải E.coli bằng siêu âm
Bằng cách làm lạnh mẫu trước và giữ mẫu trên đá trong quá trình xử lý bằng siêu âm, có thể dễ dàng ngăn ngừa sự phân hủy mẫu do nhiệt.
Lý tưởng nhất là giữ mẫu lạnh như đá trong quá trình ly giải, nhưng đối với hầu hết các mẫu, chỉ cần nhiệt độ không tăng vượt quá nhiệt độ của môi trường nuôi cấy hoặc nguồn mô. Vì vậy, nên giữ huyền phù trên đá và xử lý bằng siêu âm với nhiều xung siêu âm ngắn kéo dài 5–10 giây, xen kẽ các khoảng nghỉ 10–30 giây. Trong các khoảng nghỉ, nhiệt có thể tản đi để khôi phục nhiệt độ thấp. Đối với các mẫu tế bào có thể tích lớn hơn, có nhiều loại thiết bị phản ứng dòng chảy có áo làm mát.
Đọc tại đây các mẹo và khuyến nghị chi tiết để ly giải bằng siêu âm thành công!

Các quy trình chuẩn bị dịch ly giải E. Coli bằng siêu âm

Các nhà nghiên cứu sử dụng máy đồng nhất siêu âm Hielscher để phá vỡ tế bào E.coli. Dưới đây là nhiều quy trình ly giải E.coli đã được thử nghiệm và chứng minh hiệu quả, sử dụng máy đồng nhất siêu âm Hielscher cho các ứng dụng khác nhau liên quan đến E. coli.

Nuôi cấy tế bào, tạo liên kết chéo và chuẩn bị dịch chiết tế bào E. coli bằng siêu âm

Để thực hiện ChIP-Chip đối với SeqA và RNA polymerase, E. coli MG1655 hoặc MG1655 ΔseqA được nuôi cấy ở 37°C đến OD₆₀₀ khoảng 0,15 trong 50 ml LB (+ 0,2% glucose) trước khi thêm 27 μl formaldehyde (37%) cho mỗi ml môi trường (nồng độ cuối cùng 1%). Quá trình tạo liên kết chéo được thực hiện bằng cách lắc chậm (100 rpm) ở nhiệt độ phòng trong 20 min, sau đó dừng phản ứng bằng 10 ml glycine 2,5 M (nồng độ cuối cùng 0,5 M). Đối với các thí nghiệm sốc nhiệt, E. coli MG1655 được nuôi trong 65 ml môi trường LB ở 30°C đến OD₆₀₀ khoảng 0,3. Sau đó, 30 ml dịch nuôi cấy được chuyển sang bình đã được làm ấm trước ở 43°C và phần còn lại được giữ ở 30°C. Quá trình tạo liên kết chéo và dừng phản ứng được thực hiện như mô tả ở trên, ngoại trừ việc tế bào được giữ ở 30 hoặc 43°C trong 5 min trước khi tiếp tục lắc chậm ở nhiệt độ phòng. Tế bào được thu bằng ly tâm và rửa hai lần bằng TBS lạnh (pH7.5). Sau khi được tái huyền phù trong 1 ml đệm ly giải (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sucrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozyme), ủ ở 37°C trong 30 min rồi bổ sung 4 ml đệm IP, tế bào được xử lý siêu âm trên đá lạnh 12 lần, mỗi lần 30 sec với thời gian nghỉ 30 sec, bằng máy xử lý siêu âm Hielscher UP400St ở mức công suất 100%. Sau khi ly tâm trong 10 min ở 9000 g, các phần dịch nổi có thể tích 800 μl được bảo quản ở -20°C. (Waldminghaus 2010)

Sản xuất vượt mức và tinh sạch enzyme bằng đầu dò siêu âm

Để sản xuất vượt mức các protein gắn thẻ decahistidine (His10), E. coli BL21(DE3) được biến nạp bằng các cấu trúc pET19b. Dịch nuôi cấy sơ bộ qua đêm được thu bằng ly tâm, và 1% được dùng để cấy vào môi trường nuôi cấy biểu hiện. Tế bào mang pET19mgtB được nuôi ở 22°C đến khi mật độ quang ở 600 nm (OD600) đạt 0,7. Dịch nuôi cấy được chuyển sang 17°C và được cảm ứng bằng 100 μM IPTG. Sau 16 h, dịch nuôi cấy được thu bằng ly tâm ở 7.500 × g tại 4°C. Tế bào được tái huyền phù trong dung dịch muối đệm phosphate (PBS) 50 mM chứa 0,3 M NaCl ở pH 7,4 và được phá vỡ bằng siêu âm với đầu phát siêu âm vi đầu S2 trên máy siêu âm Hielscher UP200St ở chu kỳ 0,5 và biên độ 75%.
Quá trình sản xuất vượt mức GtfC gắn thẻ decahistidine được cảm ứng ở 37°C tại OD₆₀₀ đạt 0,6 bằng 100 μM IPTG. Sau đó, tế bào được ủ trong 4 h, thu và ly giải như đã nêu ở trên đối với MgtB.
Dịch chiết tế bào thô được ly tâm ở 15.000 × g và 4°C để lắng các mảnh vụn tế bào. Các dịch chiết đã được làm trong được nạp lên các cột HisTrap FF Crude 1-ml bằng hệ thống ÄKTAprime Plus. Các enzyme được tinh sạch theo quy trình của nhà sản xuất về rửa giải theo gradient đối với protein gắn thẻ His. Các dung dịch protein đã rửa giải được thẩm tích hai lần với dung dịch PBS 50 mM, pH 7,4, chứa 0,3 M NaCl ở 4°C, với thể tích dung dịch thẩm tích gấp 1.000 lần thể tích mẫu. Quá trình tinh sạch được phân tích bằng SDS-PAGE 12%. Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford sử dụng Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Chiết xuất protein từ vi khuẩn E. coli bằng siêu âm
Một protein mồi cần nghiên cứu (trong trường hợp này là MTV1 của Arabidopsis thaliana) được dung hợp với thẻ GST và biểu hiện trong tế bào Escherichia coli (E. coli) BL21.

Lấy một phần cặn GST-MTV1 và một phần cặn GST (tương ứng với 50 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn) và tái huyền phù từng phần trong 2,5 mL đệm chiết lạnh như đá.
Sử dụng máy siêu âm UP100H (được trang bị đầu phát siêu âm vi đầu MS3 cho thể tích nhỏ khoảng 2–5mL) để phá vỡ tế bào vi khuẩn cho đến khi chúng được ly giải, thể hiện qua độ đục giảm và độ nhớt tăng. Việc này phải được thực hiện trên đá lạnh, và nên xử lý siêu âm ngắt quãng (ví dụ: xử lý siêu âm trong 10 sec, sau đó nghỉ 10 sec trên đá lạnh và tiếp tục như vậy). Cần chú ý tránh xử lý siêu âm ở cường độ quá cao. Nếu phát hiện hiện tượng tạo bọt hoặc hình thành kết tủa trắng, cần giảm cường độ.
Chuyển dung dịch vi khuẩn đã ly giải vào các ống ly tâm vi lượng 1,5 mL và ly tâm ở 4°C, 16.000 x g trong 20 min.

Các đầu dò siêu âm sử dụng lực do hiện tượng xâm thực âm học tạo ra để phá vỡ tế bào và chiết xuất các phân tử cùng DNA từ E.coli.

Các máy siêu âm dạng đầu dò như UP400St sử dụng nguyên lý hoạt động của hiện tượng xâm thực âm để ly giải E.coli hiệu quả.

Phân tích biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp bằng xử lý siêu âm

Phần cặn tế bào E. coli được xử lý bằng máy siêu âm UP100H của Hielscher. Để thực hiện, phần cặn tế bào được huyền phù lại trong đệm ly giải đã làm lạnh (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) và làm lạnh trên đá trong 10 min. Sau đó, huyền phù tế bào được xử lý siêu âm bằng 10 xung ngắn, mỗi xung kéo dài 10 s, với khoảng nghỉ 30 s sau mỗi xung để làm mát. Cuối cùng, mảnh vụn tế bào được loại bỏ bằng siêu ly tâm ở 4°C trong 15 min tại 14.000 rpm. Để xác nhận sự biểu hiện của rPR, dịch nổi được chạy điện di trên gel polyacrylamide 12% và phân tích bằng SDS-PAGE cùng kỹ thuật Western blot. rPR được tinh sạch bằng nhựa Ni2+-NTA (Invitrogen, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ở giai đoạn này, phương pháp tinh sạch trong điều kiện tự nhiên được sử dụng. Độ tinh sạch của protein sau tinh sạch được đánh giá bằng điện di trên gel polyacrylamide 12%, sau đó nhuộm xanh Coomassie. Nồng độ protein sau tinh sạch được đo bằng bộ xét nghiệm protein Micro BCA (PIERCE, Hoa Kỳ). (Azarnezhad et al. 2016)

Video giới thiệu đầu siêu âm dạng cốc công suất 200 oát để phân tán, đồng hóa, chiết xuất hoặc khử khí các mẫu trong phòng thí nghiệm.

Máy đồng nhất siêu âm để ly giải E. coli

Hielscher Ultrasonics thiết kế, sản xuất và cung cấp các máy đồng nhất siêu âm hiệu năng cao để ly giải vi khuẩn E. coli cũng như các loại tế bào, mô và dịch nuôi cấy tế bào khác một cách đáng tin cậy và hiệu quả.
Danh mục đa dạng gồm các đầu dò siêu âm cùng các hệ thống xử lý siêu âm gián tiếp cho phép chúng tôi cung cấp cho bạn máy đồng nhất mô bằng siêu âm lý tưởng cho ứng dụng phá vỡ tế bào và chiết xuất của bạn.

Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng sản xuất tại Đức

Máy siêu âm Hielscher nổi tiếng với các tiêu chuẩn cao nhất về chất lượng và thiết kế. Phần mềm thông minh, trình đơn trực quan, các cài đặt có thể lập trình và khả năng tự động ghi dữ liệu chỉ là một vài tính năng của máy siêu âm Hielscher. Độ bền và khả năng vận hành dễ dàng cho phép tích hợp thuận lợi các máy siêu âm của chúng tôi vào các cơ sở nghiên cứu và công nghệ sinh học. Ngay cả điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi cao cũng được máy siêu âm Hielscher đáp ứng dễ dàng.

Hielscher Ultrasonics là công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt chú trọng đến các máy siêu âm hiệu năng cao có công nghệ tiên tiến nhất và dễ sử dụng. Tất nhiên, máy siêu âm Hielscher tuân thủ CE và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.

Bảng dưới đây cho biết công suất xử lý gần đúng của các máy siêu âm của chúng tôi:

Thể tích mẻ	Lưu lượng	Thiết bị được khuyến nghị
đĩa nhiều giếng / đĩa vi chuẩn độ	n.a.	UIP400MTP
CupHorn cho lọ hoặc cốc có mỏ	n.a.	CupHorn siêu âm
thiết bị phản ứng siêu âm dòng chảy vi mô	n.a.	GDmini2
tối đa 10 lọ, mỗi lọ chứa từ 0,5 đến 1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5 đến 1,5mL	n.a.	VialTweeter
1 đến 500mL	10 đến 200mL/min	UP100H
10 đến 2000mL	20 đến 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 đến 20L	0,2 đến 4L/min	UIP2000hdT
10 đến 100L	2 đến 10L/min	UIP4000
n.a.	10 đến 100L/min	UIP16000
n.a.	lớn hơn	cụm thiết bị UIP16000

Liên hệ với chúng tôi! / Đặt câu hỏi cho chúng tôi!

Video giới thiệu hệ thống chuẩn bị mẫu bằng siêu âm UIP400MTP, cho phép chuẩn bị mẫu tin cậy trên mọi loại đĩa nhiều giếng tiêu chuẩn bằng siêu âm cường độ cao. Các ứng dụng điển hình của UIP400MTP bao gồm ly giải tế bào, cắt phân mảnh DNA, RNA và chất nhiễm sắc, cũng như chiết xuất protein.

Các quy trình bổ sung để ly giải E. coli bằng siêu âm

Protein được biến đổi bằng allicin trong E. coli sử dụng thiết bị siêu âm VialTweeter

Xác định hàm lượng sulfhydryl bằng phép thử với axit 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic) (DTNB)
Dịch nuôi cấy E. coli MG1655 qua đêm được dùng để cấy vào môi trường tối thiểu MOPS (1:100). Vi khuẩn được nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí cho đến khi A600 đạt 0,4. Dịch nuôi cấy được chia thành ba phần, mỗi phần 15 ml, để xử lý gây stress. Một phần dịch nuôi cấy không được xử lý được dùng làm đối chứng âm. Hai phần dịch nuôi cấy còn lại lần lượt được bổ sung 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) hoặc 1 mM diamide. Các dịch nuôi cấy được ủ trong 15 min. Tế bào từ 5 ml của mỗi dịch nuôi cấy được thu bằng ly tâm (8.525 × g, 4°C, 10 min). Tế bào được rửa hai lần bằng 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, được bảo quản trong điều kiện kỵ khí trước khi sử dụng) và ly tâm (13.000 × g, 4°C, 10 min). Tế bào được huyền phù lại trong đệm ly giải (PBS chứa 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) trước khi được phá vỡ ở 4°C bằng xử lý siêu âm (VialTweeter – máy siêu âm, Hielscher GmbH, Đức) (3 × 1 min). Mảnh vụn tế bào được thu thành cặn bằng ly tâm (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Dịch nổi được chuyển vào cuvet QS-macro 3,5-ml (10 mm) có thanh khuấy từ và trộn với 1 ml đệm ly giải. Độ hấp thụ quang của các mẫu được theo dõi ở 412 nm bằng máy quang phổ Jasco V-650 được trang bị bộ giữ cuvet có kiểm soát nhiệt độ PSC-718 ở nhiệt độ phòng. 100μl dung dịch dithiobis(2-nitrobenzoic acid) 3 mM được thêm vào. Độ hấp thụ quang được theo dõi cho đến khi đạt mức bão hòa. Nồng độ thiol được tính bằng hệ số hấp thụ quang ϵ₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 đối với axit thio-2-nitrobenzoic (TNB). Nồng độ thiol trong tế bào được tính dựa trên thể tích tế bào E. coli là 6,7 × 10^-15 lít và mật độ tế bào A600 = 0,5 (tương đương 1 × 10⁸ tế bào ml^-1 dịch nuôi cấy). (Müller et al. 2016)

Định lượng glutathione in vivo bằng máy phá vỡ tế bào siêu âm

E.coli MG1655 được nuôi trong môi trường tối thiểu MOPS với tổng thể tích 200ml cho đến khi A600 đạt 0,5. Dịch nuôi cấy được chia thành các phần 50-ml để xử lý gây stress. Sau khi ủ 15 min với 0,79 mM allicin, 1 mM diamide hoặc dimethyl sulfoxide (đối chứng), tế bào được thu bằng ly tâm ở 4.000g tại 4°C trong 10 min. Tế bào được rửa hai lần bằng đệm KPE trước khi tái huyền phù cặn tế bào trong 700µl đệm KPE. Để loại protein, 300l axit sulfosalicylic 10% (w/v) được thêm vào trước khi phá vỡ tế bào bằng siêu âm (3 x 1 min; VialTweeter – máy siêu âm). Dịch nổi được thu sau khi ly tâm (30 min, 13.000g, 4°C). Nồng độ axit sulfosalicylic được giảm xuống 1% bằng cách thêm 3 thể tích đệm KPE. Tổng glutathione và GSSG được định lượng như mô tả ở trên. Nồng độ glutathione trong tế bào được tính dựa trên thể tích tế bào E. coli là 6,7×10^-15 lít và mật độ tế bào A600 0,5 (tương đương 1×10⁸ tế bào ml^-1 dịch nuôi cấy). Nồng độ GSH được tính bằng cách trừ 2[GSSG] khỏi tổng glutathione. (Müller et al. 2016)

Biểu hiện mAspAT của người trong E. coli bằng máy đồng nhất hóa siêu âm

Một khuẩn lạc đơn E. coli BL21 (DE3) mang vector biểu hiện được cấy vào 30 mL môi trường Luria-Bertani (LB) chứa 100μg/mL ampicillin, sau đó được nuôi ở 37ºC cho đến khi mật độ quang (OD₆₀₀) đạt 0,6. Tế bào được thu bằng ly tâm ở 4.000 × g trong 10 min và tái huyền phù trong 3L môi trường LB mới chứa 100μg/mL ampicillin.
Sau đó, sự biểu hiện protein được cảm ứng bằng 1 mM isopropyl β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) trong 20 h ở 16ºC. Tế bào được thu bằng ly tâm ở 8.000 × g trong 15 min và rửa bằng đệm A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Khoảng 45g tế bào (khối lượng ướt) được thu từ 3 L dịch nuôi cấy. Sau khi ly tâm, cặn tế bào được tái huyền phù trong 40 mL (cho 1 L dịch nuôi cấy) đệm chiết A lạnh như nước đá và được ly giải bằng siêu âm ở nhiệt độ lạnh như nước đá bằng máy phá vỡ tế bào siêu âm Hielscher UP400St. Dịch ly giải tế bào được ly tâm ở 12.000 rpm trong 15 min để tách các phân đoạn hòa tan (dịch nổi) và kết tủa (cặn). (Jiang et al. 2015)

Chủ đề liên quan

Những điều đáng biết

E.coli

Escherichia coli (E. coli) là một loài vi khuẩn coliform Gram âm, kỵ khí tùy nghi, hình que thuộc chi Escherichia, thường được tìm thấy ở phần dưới của ruột các sinh vật máu nóng (động vật hằng nhiệt). Có rất nhiều chủng (hoặc phân nhóm) E. coli với các đặc điểm đa dạng. Hầu hết các chủng E. coli đều vô hại đối với con người, ví dụ như các chủng B và K-12 thường được sử dụng cho các ứng dụng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, một số chủng có hại và có thể gây bệnh nghiêm trọng.
E. coli đóng vai trò quan trọng trong kỹ thuật sinh học hiện đại và vi sinh vật học công nghiệp vì vi khuẩn này dễ thao tác. Các ứng dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm thường sử dụng E. coli bao gồm tạo axit deoxyribonucleic (DNA) tái tổ hợp hoặc sử dụng làm sinh vật mô hình.
E. coli là một vật chủ rất đa năng để sản xuất protein ngoại lai, và có nhiều hệ thống biểu hiện protein để sản xuất protein tái tổ hợp trong E. coli. Bằng cách sử dụng các plasmid cho phép biểu hiện protein ở mức cao, có thể đưa gen vào vi khuẩn, từ đó cho phép sản xuất các protein này với số lượng lớn trong các quy trình lên men công nghiệp.
E.coli được sử dụng làm nhà máy tế bào để sản xuất insulin. Các ứng dụng khác bao gồm sử dụng tế bào E. coli đã biến đổi để phát triển và sản xuất vắc-xin và enzyme cố định, sản xuất nhiên liệu sinh học cũng như xử lý ô nhiễm bằng phương pháp sinh học.
Chủng K-12 là một dạng đột biến của E. coli biểu hiện quá mức enzyme phosphatase kiềm (ALP). Đột biến này xảy ra do một khiếm khuyết trong gen liên tục mã hóa enzyme này. Nếu một gen tạo ra sản phẩm mà không có bất kỳ sự ức chế nào, hiện tượng này được gọi là hoạt động thường trực. Dạng đột biến cụ thể này được sử dụng để phân lập và tinh sạch enzyme ALP.
Vi khuẩn E. coli cũng được sử dụng rộng rãi làm nhà máy tế bào. Các vi sinh vật đã được biến đổi bằng kỹ thuật sinh học (ví dụ: vi khuẩn) và tế bào thực vật có thể được sử dụng làm các nhà máy tế bào. Những tế bào biến đổi gen này sản xuất các phân tử, hóa chất, polyme, protein và các chất khác, được sử dụng chẳng hạn trong ngành dược phẩm, thực phẩm và hóa chất. Để giải phóng các phân tử được tạo ra bên trong những tế bào được biến đổi bằng kỹ thuật sinh học này, ly giải bằng siêu âm là một phương pháp phổ biến để phá vỡ thành tế bào và chuyển các chất mục tiêu vào chất lỏng xung quanh. Đọc thêm về quá trình ly giải các tế bào được biến đổi bằng kỹ thuật sinh học!

Cắt DNA bằng siêu âm

Lực cắt siêu âm thường được sử dụng để giải phóng các phân tử, bào quan và protein từ bên trong tế bào cũng như cắt các sợi DNA thành từng đoạn. Hiện tượng xâm thực âm học phá vỡ thành và màng tế bào để chiết xuất DNA từ tế bào và tạo ra các đoạn có chiều dài khoảng 600 – 800 bp, lý tưởng cho việc phân tích.
Nhấp vào đây để tìm hiểu thêm về máy đồng nhất siêu âm dùng để phân mảnh DNA!

Tài liệu / Tài liệu tham khảo

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Công nghệ siêu âm hiệu suất cao! Dòng sản phẩm Hielscher bao quát toàn bộ phạm vi từ máy siêu âm phòng thí nghiệm nhỏ gọn, qua các thiết bị để bàn, đến các hệ thống siêu âm quy mô công nghiệp hoàn chỉnh.

Hielscher Ultrasonics sản xuất các máy đồng nhất siêu âm hiệu suất cao từ quy mô phòng thí nghiệm đến quy mô công nghiệp.