Phân tách E.coli bằng siêu âm

  • Vi khuẩn E. coli là vi khuẩn được sử dụng phổ biến nhất trong vi sinh học và công nghệ.
  • Phá vỡ tế bào siêu âm cung cấp kết quả đáng tin cậy và tái sản xuất cho việc lysis của E. coli.
  • Mạnh mẽ nhưng chính xác kiểm soát cavitation và lực cắt dẫn đến sự gián đoạn hoàn toàn và sản lượng khai thác cao (ví dụ như protein, DNA).

Tại sao sự gián đoạn tế bào siêu âm của E. coli là phương pháp ưa thích?

Siêu âm homogenizers hoặc thăm dò loại ultrasonicators cung cấp một số lợi thế cho ly giải E. coli như siêu âm cường độ cao có hiệu quả phá vỡ thành tế bào và màng. Ultrasonicators loại thăm dò được sử dụng rộng rãi cho ly giải E. coli do những lý do sau:

  • Sự gián đoạn hiệu quả của thành tế bào: E. coli có thành tế bào bán cứng bao gồm peptidoglycan, có thể khó phá vỡ bằng các phương pháp ly giải truyền thống. Một ultrasonicator loại thăm dò tạo ra sóng siêu âm cường độ cao tạo ra bong bóng cavitation trong chất lỏng xung quanh các tế bào. Khi những bong bóng này sụp đổ, chúng tạo ra các tia chất lỏng tốc độ cao và sóng xung kích dẫn đến sự phá vỡ cơ học của thành tế bào, giải phóng hiệu quả các nội dung tế bào như phân tử sinh học.
  • Tăng cường thâm nhập: Các sóng siêu âm được tạo ra bởi đầu dò / sonotrode có thể xâm nhập sâu vào mẫu, tiếp cận một số lượng lớn hơn các tế bào E. coli và xử lý chúng đồng đều. Điều này giúp đảm bảo rằng quá trình ly giải đồng đều hơn trong toàn bộ mẫu, dẫn đến hiệu quả phá vỡ tế bào cao hơn.
  • Giảm thời gian xử lý: Năng lượng được cung cấp bởi ultrasonicator loại thăm dò được tập trung cao độ và cục bộ, dẫn đến ly giải tế bào nhanh chóng và hiệu quả. So với các phương pháp khác như đập hạt hoặc ly giải enzyme, sonication có thể đạt được ly giải E. coli trong vòng vài phút hoặc thậm chí vài giây. Trong khi nhiều kỹ thuật thay thế như đông lạnh-tan băng đòi hỏi nhiều vòng điều trị, ly giải siêu âm mở các tế bào trong một bước xử lý duy nhất.
  • Kiểm soát nhiệt độ: Ultrasonicators hiện đại được trang bị cảm biến nhiệt độ và phần mềm thông minh, cho phép thiết lập nhiệt độ quá trình tối đa. Ultrasonicator tạm dừng tự động khi đạt đến giới hạn nhiệt độ và bắt đầu quá trình sonication khi đạt đến điểm nhiệt độ cài đặt. Làm mát các mẫu trong bồn nước đá là một phương pháp đơn giản để giữ nhiệt độ mẫu thấp và ngăn ngừa sự xuống cấp mẫu do nhiệt.
  • Khả năng mở rộng: Ultrasonicators loại thăm dò có sẵn trong các kích cỡ khác nhau, từ các thiết bị cầm tay đến các mô hình công nghiệp quy mô lớn. Điều này làm cho chúng phù hợp để xử lý khối lượng nhỏ trong phòng thí nghiệm hoặc mở rộng quy mô cho các ứng dụng xử lý sinh học lớn hơn, ví dụ như sản xuất vắc-xin hoặc tổng hợp sinh học các phân tử.
  • Linh hoạt: Ultrasonicators có thể được sử dụng cho các ứng dụng khác nhau ngoài ly giải tế bào, chẳng hạn như cắt DNA, khai thác protein, đồng nhất mô, phân tán hạt nano, và nhũ tương hóa. Do đó, đầu tư vào một ultrasonicator loại thăm dò cung cấp tính linh hoạt trong nghiên cứu hoặc thiết lập công nghiệp.
  • Ultrasonicators loại thăm dò như UP200St là homogenizers mô đáng tin cậy và nghiền tế bào, do đó được sử dụng rộng rãi để chuẩn bị mẫu trong di truyền học, ví dụ, cho ly giải E.coli

    Chiết xuất protein từ tế bào E.coli được thực hiện hiệu quả với đầu dò siêu âm UP200St

    Ultrasonicator loại thăm dò cung cấp nhiều lợi thế cho ly giải E. coli. Việc kiểm soát đáng tin cậy và chính xác các thông số quá trình siêu âm cho phép tối ưu hóa các thông số vận hành như công suất, thời gian và xử lý mẫu để đạt được kết quả mong muốn.
     

    Yêu cầu thông tin




    Lưu ý của chúng tôi Chính sách bảo mật.


     

    Hướng dẫn này giải thích loại sonicator nào là tốt nhất cho các nhiệm vụ chuẩn bị mẫu của bạn như ly giải, phá vỡ tế bào, phân lập protein, phân mảnh DNA và RNA trong phòng thí nghiệm, phân tích và nghiên cứu. Chọn loại sonicator lý tưởng cho ứng dụng của bạn, khối lượng mẫu, số mẫu và thông lượng. Hielscher Ultrasonics có homogenizer siêu âm lý tưởng cho bạn!

    Làm thế nào để tìm sonicator hoàn hảo cho sự gián đoạn tế bào và chiết xuất protein trong khoa học và phân tích

    Hình thu nhỏ video

    Phân mảnh DNA siêu âm thường được sử dụng làm bước chuẩn bị mẫu trong Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS)

    Phân tích điện di của DNA bộ gen của E. coli EDL933 chịu 0 - 15 phút siêu âm. L chỉ ra Thang DNA.
    (nghiên cứu và hình ảnh: ©Basselet et al. 2008)

    Gián đoạn tế bào bằng cách sử dụng Cavitation siêu âm

    Máy đồng nhất loại đầu dò siêu âm hoạt động với khoảng 20.000 chu kỳ mỗi giây (ở 20kHz) và gây ra cavitation trong chất lỏng hoặc huyền phù. Xâm thực âm thanh, các khu vực siêu nhỏ có áp suất giống như chân không và nhiệt độ cao xé các tế bào. Mặc dù nhiệt độ có thể lên tới vài nghìn độ C, nhưng khối lượng xâm thực quá nhỏ nên chúng không làm nóng quá trình đáng kể. Siêu âm tạo ra cavitation âm thanh và lực cắt đục lỗ hoặc phá vỡ màng tế bào của các tế bào vi khuẩn như E.coli. Hielscher ultrasonicators cho phép kiểm soát chính xác các thông số quá trình như cường độ siêu âm, biên độ, năng lượng đầu vào, và nhiệt độ. Qua đó, quá trình ly giải siêu âm có thể được điều chỉnh tối ưu theo loại tế bào, nuôi cấy tế bào và mục tiêu quá trình.
     

    Ưu điểm của siêu âm lysis

    • kiểm soát chính xác các lysis (cường độ, biên độ, Nhiệt Ðộ)
    • Kết quả đáng tin cậy, có thể tái tạo
    • thích ứng tối ưu với các mẫu cụ thể
    • kiểm soát nhiệt độ
    • cho các mẫu rất nhỏ đến rất lớn (μL đến lít)
    • Xử lý cơ học hoàn toàn
    • Vận hành an toàn, thân thiện với người dùng
    • quy mô tuyến tính-lên từ phòng thí nghiệm để sản xuất
    Thiết bị siêu âm VialTweeter cho phép chuẩn bị mẫu đồng thời lên đến 10 lọ trong điều kiện quá trình tương tự. (Click vào để phóng to!)

    VialTweeter cho siêu âm lysis

    Yêu cầu thông tin




    Lưu ý của chúng tôi Chính sách bảo mật.


    Siêu âm Homogenizer vs Kỹ thuật ly giải khác

    Trong khi ly giải hóa học và enzyme có thể có vấn đề – kể từ sự lysis hóa học có thể làm thay đổi cấu trúc protein và giới thiệu các vấn đề thanh lọc và phân ly enzym đòi hỏi thời lần ủ lâu và không thể sanh sản được – gián đoạn siêu âm là một phương pháp phá vỡ tế bào nhanh chóng, tinh vi.
    Ly giải siêu âm chỉ dựa trên lực cơ học. Không có hóa chất được thêm vào, sonication phá vỡ thành tế bào bằng lực cắt. Ly giải hóa học có thể làm thay đổi cấu trúc protein và gây ra các vấn đề thanh lọc. Sự gián đoạn enzyme đòi hỏi thời gian ủ bệnh dài và không thể tái tạo. Sự gián đoạn tế bào siêu âm của các tế bào vi khuẩn E.coli là nhanh chóng, đơn giản, đáng tin cậy và có thể tái tạo. Đó là lý do tại sao Hielscher ultrasonicators được sử dụng trong các phòng thí nghiệm sinh học và sinh hóa trên khắp thế giới để chuẩn bị mẫu, pre-ananlytics, diagonstics trong ống nghiệm và xét nghiệm đa dạng.

    Khuyến nghị chung cho ly giải siêu âm

    Sonication là kỹ thuật phổ biến nhất cho lysing rất nhỏ, Trung bình và số lượng lớn của đình chỉ tế bào – từ Pico-lít lên đến 100L/giờ (sử dụng một tế bào dòng siêu âm). Các tế bào được lysed bằng chất lỏng cắt và cavitation. DNA cũng được sheared trong sonication, vì vậy nó không phải là cần thiết để thêm DNase để đình chỉ tế bào.
     

    Kiểm soát nhiệt độ trong quá trình ly giải E.coli siêu âm
    Chất phá vỡ tế bào siêu âm UP100H (100W) cho sự gián đoạn tế bào und khai thác các hợp chất thực vật.Bằng cách làm mát trước mẫu và giữ mẫu trong sonication trên băng, mẫu suy thoái nhiệt của mẫu có thể dễ dàng ngăn chặn.
    Lý tưởng nhất, các mẫu nên được giữ lạnh trong quá trình ly giải, nhưng đối với hầu hết các mẫu, nó là đủ nếu nhiệt độ không tăng cao hơn nhiệt độ nuôi cấy hoặc nguồn mô. Do đó, nó được khuyến khích, để giữ huyền phù trên băng và âm thanh với một số xung siêu âm ngắn 5-10 giây và tạm dừng 10-30 giây. Trong quá trình tạm dừng, nhiệt có thể tiêu tan để thiết lập lại nhiệt độ thấp. Đối với các mẫu tế bào lớn hơn, các lò phản ứng tế bào dòng chảy khác nhau với áo làm mát có sẵn.
    Đọc ở đây lời khuyên chi tiết và khuyến nghị cho một ly giải siêu âm thành công!

    Các giao thức để chuẩn bị siêu âm của E. coli lysates

    Các nhà nghiên cứu sử dụng đồng nhất siêu âm Hielscher cho sự gián đoạn tế bào E.coli. Dưới đây bạn có thể tìm thấy các giao thức đã được thử nghiệm và chứng minh khác nhau cho ly giải E.coli bằng cách sử dụng chất đồng nhất siêu âm Hielscher cho các ứng dụng liên quan đến E. coli khác nhau.
     

    Video clip này cho thấy các hielscher siêu âm homogenizer UP100H, một ultrasonicator được sử dụng rộng rãi để chuẩn bị mẫu trong phòng thí nghiệm.

    Siêu âm Homogenizer UP100H

    Hình thu nhỏ video

    Tăng trưởng tế bào, liên kết ngang và chuẩn bị chiết xuất tế bào E. coli bằng cách sử dụng siêu âm

    Đối với SeqA và RNA polymerase ChIP-chip E. coli MG1655 hoặc MG1655 ΔseqA đã được trồng ở 37 ° c đến một OD600 khoảng 0,15 trong 50 ml LB (+ 0,2% glucose) trước 27 μL formaldehyde (37%) mỗi ml vừa được thêm vào (nồng độ cuối cùng 1%). Crosslinking được thực hiện tại chậm lắc (100 rpm) ở nhiệt độ phòng trong 20 phút tiếp theo là dập tắt với 10 ml 2,5 m Glycine (cuối cùng nồng độ 0,5 M). Đối với thí nghiệm sốc nhiệt, E. coli MG1655 đã được trồng trong 65 ml trung bình ở 30 ° c đến một OD600 khoảng 0,3. Sau đó, 30 ml nuôi cấy được chuyển sang bình được làm ấm trước ở 43 ° C và phần còn lại được giữ ở 30 ° C. Liên kết ngang và dập tắt như mô tả ở trên ngoại trừ các tế bào được giữ ở 30 hoặc 43 ° C trong 5 phút trước khi lắc chậm hơn ở nhiệt độ phòng. Các tế bào được thu thập bằng cách ly tâm và rửa hai lần bằng TBS lạnh (pH7.5). Sau khi hồi sức trong dung dịch đệm ly giải 1 ml (10 mM Tris (pH 8.0), 20% sucrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lysozyme) và ủ ở 37 ° C trong 30 phút sau đó bổ sung 4 ml đệm IP, các tế bào được sonicated trên băng với 12 lần 30 giây và 30 giây nghỉ bằng cách sử dụng bộ xử lý siêu âm Hielscher UP400St ở cài đặt công suất 100%. Sau khi ly tâm trong 10 phút ở 9000 g, 800 μl aliquotes của supernatant được bảo quản ở -20 ° C. (Waldminghaus 2010)
     

    Sản xuất quá mức và tinh chế enzyme bằng đầu dò siêu âm

    Ultrasonicator UP100H là một homogeniser phòng thí nghiệm thường được sử dụng để chuẩn bị mẫu của các tấm nuôi cấy tế bào.Để sản xuất quá mức các protein được gắn thẻ decahistidine (His10), E. coli BL21 (DE3) đã được chuyển đổi với cấu trúc pET19b. Một nền tiền nuôi cấy qua đêm đã được thu hoạch bằng cách ly tâm, và 1% đã được sử dụng để cấy một nền văn hóa biểu hiện. Các tế bào mang pET19mgtB được phát triển ở 22 ° C cho đến khi mật độ quang học ở 600 nm (OD600) là 0,7. Nuôi cấy được chuyển đến 17 ° C và gây ra bởi 100 μM IPTG. Sau 16 giờ, nuôi cấy được thu hoạch bằng cách ly tâm ở 7.500 × g ở 4 ° C. Các tế bào được đình chỉ lại trong nước muối đệm phốt phát 50 mM (PBS) với 0,3 M NaCl ở pH 7,4 và bị phá vỡ bởi siêu âm với một sonotrode đầu vi mô S2 tại siêu âm Hielscher UP200St ở chu kỳ 0,5 và biên độ 75%.
    Quá trình sản xuất decahistidine-Tagged GtfC đã gây ra ở 37 ° c tại một OD600 của 0,6 với 100 μM IPTG. Các tế bào sau đó được ấp cho 4 h, thu hoạch, và lysed như đã nêu ở trên cho MgtB.
    Chiết xuất tế bào thô được ly tâm ở 15.000 × g và 4 ° C để lắng các mảnh vụn tế bào. Các chất chiết xuất đã được làm rõ được nạp trên các cột HisTrap FF Crude 1 ml bằng hệ thống ÄKTAprime Plus. Các enzyme được tinh chế theo giao thức của nhà sản xuất để làm loãng gradient của các protein được gắn thẻ His. Các dung dịch protein Eluted được thẩm tách hai lần so với 1.000 thể tích 50 mM PBS, pH 7,4, với 0,3 M NaCl ở 4 ° C. Việc thanh lọc được phân tích bởi 12% SDS-PAGE. Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford sử dụng Roti-Quant. (Rabausch và cộng sự 2013)
     

    Khai thác siêu âm protein từ vi khuẩn E. coli
    Một protein mồi của quan tâm (trong trường hợp này, MTV1 của Arabidopsis thaliana) là hợp đồng với một thẻ GST và thể hiện trong BL21 Escherichia coli (E. coli) tế bào.

    1. Lấy một viên GST-MTV1 và GST (tương ứng với nuôi cấy vi khuẩn 50 ml) và treo lại mỗi viên trong dung dịch đệm chiết lạnh đá lạnh 2,5 ml.
    2. Sử dụng một ultrasonicator UP100H (được trang bị MS3 microtip-sonotrode cho khối lượng nhỏ khoảng 2-5mL) để phá vỡ các tế bào vi khuẩn cho đến khi chúng được lysed, được biểu thị bằng cách giảm độ mờ đục và tăng độ nhớt. Điều này phải được thực hiện trên băng, và nên sonicate trong khoảng thời gian (ví dụ: sonicating 10 giây sau đó là tạm dừng 10 giây trên băng, v.v.). Phải cẩn thận không để sonicate với cường độ quá cao. Nếu phát hiện tạo bọt hoặc hình thành kết tủa trắng, cường độ cần phải được hạ xuống.
    3. Chuyển dung dịch vi khuẩn phân giải vào ống vi ly tâm 1,5 mL và máy ly tâm ở 4°C, 16.000 x g trong 20 phút.

     

    Đầu dò siêu âm sử dụng các lực xâm thực âm thanh để phá vỡ tế bào và trích xuất các phân tử và DNA từ E.coli.

    Ultrasonicators loại thăm dò như UP400St sử dụng nguyên lý làm việc của xâm thực âm thanh để ly giải E.coli hiệu quả.

    Phân tích biểu hiện và thanh lọc protein tái tổ hợp bằng cách sử dụng Sonication

    Các viên E. coli đã được sonicated với siêu âm Hielscher UP100H. Với mục đích này, viên nén tế bào được tái sử dụng trong dung dịch đệm ly giải ướp lạnh (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) và làm lạnh trên đá trong 10 phút. Sau đó, hệ thống treo tế bào được sonicated với 10 đợt ngắn 10 giây tiếp theo là khoảng thời gian 30 giây để làm mát. Cuối cùng, các mảnh vụn tế bào đã được loại bỏ bằng siêu ly tâm ở 4 ° C trong 15 phút ở 14000 vòng / phút. Để xác nhận biểu hiện rPR, supernatant được chạy trên gel polyacrylamide 12% và được phân tích bởi SDS-PAGE và Western blotting. Việc tinh chế rPR được thực hiện bằng nhựa Ni2 + -NTA (Invitrogen, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong giai đoạn này, phương pháp thanh lọc bản địa đã được sử dụng. Độ tinh khiết của protein tinh khiết được đánh giá bằng cách sử dụng điện di trên gel polyacrylamide 12% và nhuộm màu xanh Coomassie sau đó. Nồng độ protein tinh khiết được đo bằng bộ xét nghiệm protein Micro BCA (PIERCE, Hoa Kỳ). (Azarnezhad và cộng sự 2016)
     

    Video này cho thấy cuphorn siêu âm 200 watt để phân tán, đồng nhất, chiết xuất hoặc khử khí của các mẫu phòng thí nghiệm.

    Cuphorn siêu âm (200 Watts)

    Hình thu nhỏ video

    Siêu âm Homogenizers cho E. coli ly giải

    Hielscher Ultrasonics thiết kế, sản xuất và cung cấp homogenizers siêu âm hiệu suất cao cho sự ly giải đáng tin cậy và hiệu quả của vi khuẩn E. coli và các loại tế bào khác, mô và nuôi cấy tế bào.
    Danh mục đầu tư rộng của đầu dò siêu âm cũng như hệ thống sonication gián tiếp cho phép chúng tôi cung cấp cho bạn homogenizer mô siêu âm lý tưởng cho sự gián đoạn tế bào và ứng dụng khai thác của bạn.

    Thiết kế, Sản xuất và Tư vấn – Chất lượng Sản xuất tại Đức

    Máy siêu âm Hielscher có thể được điều khiển từ xa thông qua điều khiển trình duyệt. Các thông số sonication có thể được theo dõi và điều chỉnh chính xác theo yêu cầu quy trình.Hielscher ultrasonicators nổi tiếng với chất lượng cao nhất và tiêu chuẩn thiết kế của họ. Phần mềm thông minh, menu trực quan, cài đặt lập trình và giao thức dữ liệu tự động chỉ là một vài tính năng của Hielscher ultrasonicators. Mạnh mẽ và hoạt động dễ dàng cho phép tích hợp trơn tru của ultrasonicators của chúng tôi vào các cơ sở nghiên cứu và công nghệ sinh học. Ngay cả điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi khắt khe cũng dễ dàng được xử lý bởi Hielscher ultrasonicators.

    Hielscher Ultrasonics là một công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt nhấn mạnh vào ultrasonicators hiệu suất cao có công nghệ hiện đại và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, Hielscher ultrasonicators là CE tuân thủ và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.

    Bảng dưới đây cho bạn một dấu hiệu về khả năng xử lý gần đúng của máy siêu âm:

    batch Khối lượngTốc độ dòngThiết bị khuyến nghị
    tấm đa giếng / microtiterN.A.UIP400MTP (UIP400MTP)
    CupHorn cho lọ hoặc cốcN.A.Siêu âm CupHorn
    lò phản ứng dòng chảy siêu âmN.A.GDmini2
    lên đến 10 lọ với 0,5 đến 1,5mLN.A.VialTweeter
    0.5 đến 1.5mLN.A.VialTweeter
    1 đến 500ml10 đến 200mL / phútUP100H
    10 đến 2000mL20 đến 400mL / phútUP200Ht, UP400St
    0.1 đến 20L00,2 đến 4L / phútUIP2000hdT
    10 đến 100L2 đến 10L / phútUIP4000
    N.A.10 đến 100L / phútUIP16000
    N.A.lớn hơnCụm UIP16000

    Liên hệ chúng tôi! / Hỏi chúng tôi!

    Yêu cầu thêm thông tin

    Vui lòng sử dụng mẫu dưới đây để yêu cầu thêm thông tin về máy đồng nhất mô siêu âm và máy nghiền tế bào, ứng dụng ly giải và giá cả. Chúng tôi sẽ vui mừng thảo luận về quá trình của bạn với bạn và cung cấp cho bạn một máy đồng nhất siêu âm đáp ứng yêu cầu của bạn!










    Video cho thấy hệ thống chuẩn bị mẫu siêu âm UIP400MTP, cho phép chuẩn bị mẫu đáng tin cậy của bất kỳ tấm đa giếng tiêu chuẩn nào bằng cách sử dụng siêu âm cường độ cao. Các ứng dụng điển hình của UIP400MTP bao gồm lysis tế bào, DNA, RNA và cắt sắc thể cũng như chiết xuất protein.

    Ultrasonicator UIP400MTP cho sonication tấm đa giếng

    Hình thu nhỏ video

    Các giao thức bổ sung cho siêu âm E. coli Lysis

    Protein biến đổi Allicin trong E. coli bằng cách sử dụng VialTweeter siêu âm

    VialTweeter tại bộ xử lý siêu âm UP200STXác định sulfhydryl nội dung của 5, 5 '-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Assay
    Nuôi cấy qua đêm E. coli MG1655 đã được sử dụng để tiêm MOPS môi trường tối thiểu (1:100). Nuôi cấy được nuôi cấy hiếu khí cho đến khi đạt được A600 0,4. Nuôi cấy được chia thành ba nền văn hóa 15 ml để điều trị căng thẳng. Một nền văn hóa không được điều trị phục vụ như một kiểm soát tiêu cực. 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) hoặc 1 mM diamide đã được thêm vào một trong hai nền văn hóa còn lại mỗi loại. Nuôi cấy được ủ trong 15 phút. 5 ml mỗi nền văn hóa được thu hoạch bằng cách ly tâm (8.525 × g, 4 ° C, 10 phút). Các tế bào được rửa hai lần bằng 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, được bảo quản kỵ khí trước khi sử dụng) và ly tâm (13.000 × g, 4 ° C, 10 phút). Các tế bào được treo lại trong dung dịch đệm ly giải (PBS với 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) trước khi bị gián đoạn ở 4 °C bằng siêu âm (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Đức) (3 × 1 phút). Các mảnh vụn tế bào được tạo viên bằng cách ly tâm (13.000 × g, 4 °C, 15 phút). Supernatant được chuyển sang cuvet QS-macro 3,5 ml (10 mm) với thanh khuấy từ tính và trộn với 1 ml dung dịch đệm ly giải. Sự tuyệt chủng của các mẫu được theo dõi ở 412 nm bằng máy đo quang phổ Jasco V-650 được trang bị giá đỡ tế bào kiểm soát nhiệt độ PSC-718 ở nhiệt độ phòng. 100μl dung dịch dithiobis (axit 2-nitrobenzoic) 3 mM đã được thêm vào. Sự tuyệt chủng được theo dõi cho đến khi nó đạt đến độ bão hòa. Tính toán nồng độ thiol được thực hiện bằng hệ số tuyệt chủng ε412 = 13.700 M-1 Cm-1 Đối với Thio-2-nitrobenzoic acid (TNB). Nồng độ thiol di động được tính toán dựa trên một khối lượng tế bào E. coli của 6,7 × 10-15 lít và mật độ tế bào A600 = 0,5 (tương đương 1 × 108 tế bào ml-1 văn hóa). (Müller et al. 2016)
     

    Xác định Glutathione In Vivo bằng Máy nghiền tế bào siêu âm

    E.coli MG1655 được trồng trong môi trường tối thiểu MOPS với tổng thể tích 200ml cho đến khi đạt được A600 là 0,5. Nuôi cấy được chia thành các nền văn hóa 50 ml để điều trị căng thẳng. Sau 15 phút ủ với 0,79 mM allicin, 1 mM diamide hoặc dimethyl sulfoxide (đối chứng), các tế bào được thu hoạch ở 4.000g ở 4 ° C trong 10 phút. Các tế bào được rửa hai lần bằng dung dịch đệm KPE trước khi tái tạo viên trong 700μl dung dịch đệm KPE. Đối với deproteination, 300l axit sulfosalicylic 10% (w / v) đã được thêm vào trước khi phá vỡ các tế bào bằng siêu âm (3 x 1 phút; VialTweeter ultrasonicator). Supernatants được thu thập sau khi ly tâm (30 phút, 13, 000g, 4 ° c). Nồng độ sulfosalicylic acid được giảm xuống còn 1% do việc bổ sung 3 khối lượng bộ đệm KPE. Các phép đo của tất cả các Glutathione và GSSG được thực hiện như mô tả ở trên. Nồng độ Glutathione di động được tính toán dựa trên khối lượng tế bào E. coli của 6,7×10-15 lít và mật độ tế bào A600 0,5 (tương đương 1×108 tế bào ml-1 văn hóa). Nồng độ GSH được tính toán bằng cách trừ 2 [GSSG] từ tổng Glutathione. (Müller et al. 2016)

    Biểu hiện của mAspAT ở người trong E. coli bằng cách sử dụng một Homogenizer siêu âm

    Siêu âm tế bào phá vỡ UP400St (400W) để khai thác các chất nội bào (ví dụ như protein, organelles, DNA, RNA vv)Thuộc địa duy nhất của E. coli BL21 (DE3) làm nhiễu vector biểu hiện trong 30 mL trung bình Luria-Bertani (LB) có chứa 100μg/mL Ampicillin, và sau đó gieo trồng ở 37 º C cho đến khi mật độ quang học (OD600) đạt 0,6. Các tế bào được thu hoạch bằng máy ly tâm ở 4.000 × g trong 10 phút, và resuspended trong 3L tươi LB vừa chứa 100μg/mL Ampicillin.
    Sau đó, biểu hiện protein được gây ra với 1 mM isopropyl β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) trong 20 giờ ở 16ºC. Các tế bào được thu hoạch bằng cách ly tâm ở 8.000 × g trong 15 phút và rửa bằng dung dịch đệm A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Các tế bào xấp xỉ 45g (trọng lượng ướt) thu được từ nuôi cấy 3 L. Sau khi ly tâm, các viên tế bào được treo lại trong 40 mL (đối với nuôi cấy 1 L) đệm khai thác lạnh đá A, và lysed bằng siêu âm ở nhiệt độ lạnh bằng cách sử dụng máy nghiền tế bào siêu âm Hielscher UP400St. Quá trình ly giải tế bào được ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng / phút trong 15 phút để tách các phân đoạn hòa tan (supernatant) và kết tủa (viên). (Giang và cộng sự 2015)
     



    Sự kiện đáng biết

    E coli

    Escherichia coli (E. coli) là một loại vi khuẩn Gram âm, facultatively kỵ khí, hình que, thuộc chi Escherichia thường được tìm thấy trong ruột thấp hơn của các sinh vật máu nóng (endotherms). Có một số lượng lớn các chủng E. coli (hoặc các phân loại) với các đặc điểm đa dạng. Hầu hết các chủng E. coli là vô hại đối với con người, ví dụ như B và K-12 chủng được sử dụng phổ biến cho các ứng dụng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, một số chủng có hại và có thể gây ra căn bệnh nghiêm trọng.
    E. coli đóng một vai trò quan trọng trong kỹ thuật sinh học hiện đại và vi sinh vật công nghiệp kể từ khi vi khuẩn dễ thao tác. Các ứng dụng phòng thí nghiệm thường có liên quan đến việc sử dụng E. coli, ví dụ như để tạo ra axit deoxyribonucleic tái tổ hợp (DNA) hoặc để hoạt động như một sinh vật mô hình.
    E. coli là một máy chủ rất linh hoạt để sản xuất các protein dị thường, và các hệ thống biểu hiện protein đa dạng có sẵn để sản xuất các protein tái tổ hợp trong E. coli. Sử dụng plasmid cho phép biểu hiện mức độ cao của protein, gen có thể được đưa vào vi khuẩn, cho phép sản xuất các protein với số lượng cao trong quá trình lên men công nghiệp.
    E.coli được sử dụng làm nhà máy sản xuất tế bào để sản xuất insulin. Các ứng dụng tiếp theo bao gồm việc sử dụng các tế bào E. coli biến đổi để phát triển và sản xuất vắc-xin và enzyme cố định, để sản xuất nhiên liệu sinh học, cũng như xử lý sinh học.
    Sự căng thẳng K-12 là một dạng đột biến của E. coli mà over-biểu hiện enzyme Alkaline Phosphatase (ALP). Đột biến này xảy ra do một khiếm khuyết trong gen liên tục mã cho enzyme. Nếu một gen tạo ra một sản phẩm mà không có bất kỳ sự ức chế này được gọi là hoạt động cấu. Hình thức đột biến cụ thể này được sử dụng để cô lập và thanh lọc enzyme ALP.
    Vi khuẩn E. coli cũng được sử dụng rộng rãi như các nhà máy sản xuất tế bào. Vi khuẩn được thiết kế (ví dụ: vi khuẩn) và tế bào thực vật có thể được sử dụng như cái gọi là nhà máy tế bào. Những tế bào biến đổi gen này tạo ra các phân tử, hóa chất, polyme, protein và các chất khác, được sử dụng ví dụ trong ngành dược phẩm, thực phẩm và hóa chất. Để giải phóng các phân tử được sản xuất bên trong các tế bào kỹ thuật sinh học như vậy, lysis siêu âm là một phương pháp phổ biến để phá vỡ các bức tường tế bào và chuyển các chất mục tiêu vào chất lỏng xung quanh. Đọc thêm về lysis của các tế bào kỹ thuật sinh học!

    Siêu âm DNA Cắt

    Lực cắt siêu âm là một phương pháp thường được sử dụng để giải phóng các phân tử, bào quan và protein từ bên trong tế bào cũng như phá vỡ các sợi DNA thành từng mảnh. Acoustic cavitation phá vỡ các thành tế bào và màng để trích xuất DNA từ các tế bào và tạo ra các mảnh khoảng 600 – 800 BP dài, đó là lý tưởng để phân tích.
    Click vào đây để tìm hiểu thêm về siêu âm homogenizers cho phân mảnh DNA!

    Văn học/tài liệu tham khảo


    Siêu âm hiệu suất cao! Phạm vi sản phẩm Hielscher bao gồm toàn bộ quang phổ từ máy siêu âm phòng thí nghiệm nhỏ gọn trên các đơn vị băng ghế dự bị đến các hệ thống siêu âm công nghiệp đầy đủ.

    Hielscher Ultrasonics sản xuất homogenizers siêu âm hiệu suất cao từ Phòng thí nghiệm đến kích thước công nghiệp.


    Chúng tôi sẽ rất vui khi thảo luận về quá trình của bạn.

    Hãy liên hệ.