Ly giải tế bào được biến đổi bằng kỹ thuật sinh học bằng siêu âm trong sản xuất công nghiệp

Các loài vi khuẩn được biến đổi bằng kỹ thuật sinh học như E. coli cũng như các loại tế bào động vật có vú và thực vật được biến đổi gen được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học để biểu hiện các phân tử. Để giải phóng các phân tử sinh học đã được tổng hợp này, cần có một kỹ thuật phá vỡ tế bào đáng tin cậy. Xử lý siêu âm hiệu năng cao là phương pháp đã được chứng minh để ly giải tế bào hiệu quả và đáng tin cậy – dễ dàng mở rộng quy mô để đạt năng suất xử lý lớn. Hielscher Ultrasonics cung cấp cho bạn thiết bị siêu âm hiệu năng cao để ly giải tế bào hiệu quả nhằm sản xuất lượng lớn các phân tử sinh học chất lượng cao.

Chiết xuất các phân tử từ nhà máy tế bào

Để sản xuất nhiều loại phân tử sinh học, có thể sử dụng nhiều vi sinh vật và tế bào thực vật đã được biến đổi làm nhà máy tế bào vi sinh vật, bao gồm Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana và tảo, cùng nhiều loại khác. Các nhà máy tế bào này có thể sản xuất protein, lipid, hóa chất sinh học, polyme, nhiên liệu sinh học và hóa chất có nguồn gốc từ dầu mỡ, được sử dụng làm thực phẩm hoặc nguyên liệu cho các ứng dụng công nghiệp. Các tế bào được sử dụng làm nhà máy tế bào được nuôi cấy trong các thiết bị phản ứng sinh học kín, nơi chúng có thể đạt hiệu suất cao, tính đặc hiệu cao và nhu cầu năng lượng thấp.
Để phân lập các phân tử mục tiêu từ các dịch nuôi cấy tế bào được biến đổi bằng kỹ thuật sinh học, cần phá vỡ tế bào để giải phóng vật chất nội bào. Thiết bị phá vỡ tế bào bằng siêu âm đã được công nhận rộng rãi là một kỹ thuật có độ tin cậy và hiệu quả cao để phân rã tế bào và giải phóng các hợp chất.

Nhà máy tế bào vi sinh vật là các tế bào được cải biến chuyển hóa để tổng hợp nhiều hợp chất có giá trị. Phá vỡ tế bào bằng siêu âm là phương pháp hiệu quả và đáng tin cậy để giải phóng các hợp chất có giá trị từ bên trong tế bào.
nghiên cứu và hình minh họa: ©Villaverde, 2010.

Ưu điểm của thiết bị phá vỡ tế bào bằng siêu âm

Là một công nghệ không dùng nhiệt, nhẹ nhàng nhưng có hiệu quả cao, thiết bị phá vỡ tế bào bằng siêu âm được sử dụng trong phòng thí nghiệm và công nghiệp để ly giải tế bào và tạo ra các dịch chiết chất lượng cao, ví dụ dùng để phân lập các phân tử từ nhà máy tế bào.

Siêu âm công suất cao để phá vỡ hiệu quả các nhà máy tế bào vi sinh vật

Cơ chế và tác động của thiết bị phá vỡ tế bào bằng siêu âm:
Phá vỡ tế bào bằng siêu âm sử dụng năng lượng của sóng siêu âm. Máy đồng nhất hóa / thiết bị phá vỡ tế bào bằng siêu âm được trang bị một đầu dò (còn gọi là sonotrode) làm bằng hợp kim titan, dao động ở tần số cao khoảng 20 kHz. Điều này có nghĩa là đầu dò siêu âm truyền 20.000 dao động mỗi giây vào chất lỏng được xử lý bằng siêu âm. Sóng siêu âm truyền vào chất lỏng có đặc trưng là các chu kỳ áp suất cao / áp suất thấp luân phiên. Trong một chu kỳ áp suất thấp, chất lỏng giãn nở và các bọt chân không cực nhỏ hình thành. Những bọt rất nhỏ này lớn dần qua nhiều chu kỳ áp suất luân phiên cho đến khi không thể hấp thụ thêm năng lượng. Tại thời điểm này, các bọt xâm thực sụp đổ dữ dội và tạo ra cục bộ một môi trường có mật độ năng lượng đặc biệt cao. Hiện tượng này được gọi là xâm thực âm và có đặc trưng là nhiệt độ rất cao, áp suất rất cao và lực cắt tại các vùng cục bộ. Các ứng suất cắt này phá vỡ thành tế bào một cách hiệu quả và tăng cường truyền khối giữa bên trong tế bào và dung môi xung quanh. Là một kỹ thuật thuần cơ học, việc sử dụng lực cắt do siêu âm tạo ra được áp dụng rộng rãi và là quy trình được khuyến nghị để phá vỡ tế bào vi khuẩn cũng như phân lập protein. Là một phương pháp phá vỡ tế bào đơn giản và nhanh chóng, xử lý bằng siêu âm lý tưởng cho việc phân lập ở các thể tích nhỏ, trung bình và lớn. Các máy siêu âm kỹ thuật số của Hielscher được trang bị menu cài đặt rõ ràng để kiểm soát chính xác quá trình xử lý bằng siêu âm. Tất cả dữ liệu xử lý bằng siêu âm được tự động lưu trên thẻ SD tích hợp và có thể dễ dàng truy cập. Các tùy chọn tản nhiệt tiên tiến như làm mát bên ngoài, xử lý bằng siêu âm ở chế độ xung, v.v. trong quá trình phân rã bằng siêu âm đảm bảo duy trì nhiệt độ lý tưởng của quá trình, qua đó bảo toàn tính nguyên vẹn của các hợp chất nhạy nhiệt được chiết xuất.

Nghiên cứu khẳng định các ưu điểm của việc phá vỡ tế bào và chiết xuất bằng siêu âm

GS. Chemat và cộng sự (2017) tổng kết trong nghiên cứu của họ rằng “chiết xuất có hỗ trợ siêu âm là một giải pháp xanh và khả thi về mặt kinh tế để thay thế các kỹ thuật thông thường đối với thực phẩm và sản phẩm tự nhiên. Những lợi ích chính là giảm thời gian chiết xuất và xử lý, lượng năng lượng và dung môi sử dụng, số công đoạn đơn vị và lượng CO₂ phát thải.”
Gabig-Ciminska và cộng sự (2014) đã sử dụng một máy đồng nhất hóa áp suất cao và một thiết bị phân rã tế bào bằng siêu âm trong nghiên cứu về ly giải bào tử để giải phóng DNA. Khi so sánh hai phương pháp phá vỡ tế bào, nhóm nghiên cứu kết luận rằng đối với việc ly giải tế bào để thu DNA bào tử, “việc phân tích đã được thực hiện bằng cách sử dụng dịch ly giải tế bào thu được từ quá trình đồng nhất hóa áp suất cao. Sau đó, chúng tôi nhận thấy rằng phá vỡ tế bào bằng siêu âm có những ưu điểm vượt trội cho mục đích này. Phương pháp này khá nhanh và có thể thực hiện với các thể tích mẫu nhỏ.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Các phân tử sinh học từ nhà máy tế bào phục vụ sản xuất thực phẩm

Các nhà máy tế bào vi sinh vật là một phương thức sản xuất khả thi và hiệu quả, sử dụng vi sinh vật để tạo ra các chất chuyển hóa vốn có và không vốn có với sản lượng cao thông qua kỹ thuật sinh học cải biến chuyển hóa ở các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm, v.v. Ví dụ, enzyme số lượng lớn được sản xuất bằng các vi sinh vật như Aspergillus oryzae, nấm và vi khuẩn. Những enzyme được sản xuất với số lượng lớn này được sử dụng trong sản xuất thực phẩm và đồ uống, cũng như trong nông nghiệp, năng lượng sinh học và chăm sóc nhà cửa.
Một số vi khuẩn như Acetobacter xylinum và Gluconacetobacter xylinus tạo ra cellulose trong quá trình lên men, trong đó các sợi nano được tổng hợp theo quy trình từ dưới lên. Cellulose vi khuẩn (còn được gọi là cellulose vi sinh vật) tương đương về mặt hóa học với cellulose thực vật, nhưng có độ kết tinh cao và độ tinh khiết cao (không chứa lignin, hemicellulose, pectin và các thành phần có nguồn gốc sinh học khác), đồng thời có cấu trúc độc đáo dạng mạng lưới ba chiều (3D) đan từ các sợi nano cellulose. (xem Zhong, 2020) So với cellulose có nguồn gốc thực vật, cellulose vi khuẩn có tính bền vững cao hơn và cellulose được tạo ra có độ tinh khiết cao, không cần các bước tinh sạch phức tạp. Xử lý siêu âm và chiết bằng dung môi sử dụng NaOH hoặc SDS (natri dodecyl sulfat) rất hiệu quả trong việc phân lập cellulose vi khuẩn từ tế bào vi khuẩn.

Các phân tử sinh học từ nhà máy tế bào phục vụ sản xuất dược phẩm và vắc-xin

Một trong những sản phẩm dược phẩm nổi bật nhất có nguồn gốc từ các nhà máy tế bào là insulin người. E. coli và Saccharomyces cerevisiae được sử dụng chủ yếu để sản xuất insulin bằng kỹ thuật sinh học. Vì các phân tử kích thước nano được tổng hợp sinh học có tính tương thích sinh học cao, các hạt nano sinh học như ferritin mang lại lợi thế cho nhiều ứng dụng sản xuất sinh học. Ngoài ra, quá trình sản xuất bằng các vi sinh vật được cải biến chuyển hóa thường đạt hiệu quả cao hơn đáng kể về sản lượng thu được. Ví dụ, sản lượng axit artemisinic, resveratrol và lycopene đã tăng từ mười lần đến vài trăm lần, và việc sản xuất ở quy mô công nghiệp đã được thiết lập hoặc đang được phát triển. (xem Liu và cộng sự; Microb. Cell Fact. 2017)
Ví dụ, các phân tử sinh học kích thước nano có bản chất protein và có khả năng tự lắp ráp, như ferritin và các hạt giống vi-rút, đặc biệt được quan tâm trong phát triển vắc-xin vì chúng mô phỏng cả kích thước lẫn cấu trúc của tác nhân gây bệnh và cho phép liên hợp kháng nguyên trên bề mặt để thúc đẩy tương tác với tế bào miễn dịch. Những phân tử như vậy được biểu hiện trong các hệ thống được gọi là nhà máy tế bào (ví dụ: các chủng E. coli đã được cải biến), tạo ra một phân tử đích cụ thể.

Quy trình ly giải E. coli BL21 bằng siêu âm để giải phóng ferritin

Ferritin là một protein có chức năng chính là dự trữ sắt. Ferritin cho thấy tiềm năng đầy hứa hẹn dưới dạng các hạt nano tự lắp ráp trong vắc-xin, nơi nó được sử dụng làm phương tiện vận chuyển vắc-xin (ví dụ: protein gai SARS-Cov-2). Nghiên cứu khoa học của Sun và cộng sự (2016) cho thấy ferritin tái tổ hợp có thể được giải phóng từ Escherichia coli ở dạng hòa tan tại nồng độ NaCl thấp (≤50 mmol/L). Để biểu hiện ferritin trong E. coli BL21 và giải phóng ferritin, quy trình sau đã được áp dụng thành công. Plasmid tái tổ hợp pET-28a/ferritin được biến nạp vào chủng E coli BL21 (DE3). Các tế bào E coli BL21 (DE3) mang ferritin được nuôi cấy trong môi trường sinh trưởng LB có 0,5% kanamycin ở 37°C và được cảm ứng tại OD600 bằng 0,6 với 0,4% isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside trong 3 giờ ở 37°C. Sau đó, dịch nuôi cấy cuối cùng được thu hoạch bằng cách ly tâm ở 8000g trong 10 phút ở 4°C, và phần cặn được thu lại. Tiếp theo, phần cặn được tái huyền phù lần lượt trong môi trường LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% dịch chiết nấm men)/đệm ly giải (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) và dung dịch NaCl ở các nồng độ khác nhau (0, 50, 100, 170 và 300 mmol/L). Để ly giải tế bào vi khuẩn, xử lý siêu âm được áp dụng ở chế độ xung: ví dụ, sử dụng thiết bị siêu âm UP400St ở biên độ 100% với chu kỳ hoạt động gồm 5 giây BẬT, 10 giây TẮT, trong 40 chu kỳ) rồi ly tâm ở 10 000g trong 15 phút ở 4°C. Dịch nổi và kết tủa được phân tích bằng điện di trên gel polyacrylamide có natri dodecyl sulfat (SDS-PAGE). Tất cả các gel được nhuộm bằng natri dodecyl sulfat đều được quét bằng máy quét có độ phân giải cao. Hình ảnh gel được phân tích bằng phần mềm Magic Chemi 1D. Để đạt độ rõ nét tối ưu, các băng protein được phát hiện bằng cách điều chỉnh các thông số. Dữ liệu cho các băng được thu từ ba lần lặp kỹ thuật. (xem Sun và cộng sự, 2016)

Thiết bị phá vỡ tế bào bằng siêu âm để ly giải các nhà máy tế bào ở quy mô công nghiệp

Ly giải và chiết xuất bằng siêu âm là phương pháp đáng tin cậy và thuận tiện để giải phóng các chất chuyển hóa từ các nhà máy tế bào, qua đó hỗ trợ sản xuất hiệu quả các phân tử mục tiêu. Thiết bị phá vỡ tế bào bằng siêu âm có các kích cỡ từ phòng thí nghiệm đến công nghiệp, và quy mô của các quy trình có thể được mở rộng hoàn toàn tuyến tính.
Hielscher Ultrasonics là đối tác có năng lực của bạn về thiết bị phá vỡ tế bào bằng siêu âm hiệu năng cao và có kinh nghiệm lâu năm trong việc triển khai các hệ thống siêu âm ở quy mô để bàn và công nghiệp.
Với phần cứng và phần mềm tiên tiến, các hệ thống phá vỡ tế bào của Hielscher Ultrasonics đáp ứng mọi yêu cầu về kiểm soát quy trình tối ưu, vận hành dễ dàng và tính thân thiện với người dùng. Khách hàng và người sử dụng thiết bị siêu âm Hielscher đánh giá cao lợi ích mà các thiết bị phá vỡ tế bào và chiết xuất bằng siêu âm Hielscher mang lại: cho phép giám sát và kiểm soát quy trình chính xác – thông qua màn hình cảm ứng kỹ thuật số và điều khiển từ xa qua trình duyệt. Tất cả dữ liệu xử lý siêu âm quan trọng (ví dụ: năng lượng thuần, tổng năng lượng, biên độ, thời gian, nhiệt độ, áp suất) đều được tự động lưu dưới dạng tệp CSV trên thẻ SD tích hợp. Điều này giúp thu được kết quả có khả năng tái lập và lặp lại, đồng thời tạo thuận lợi cho việc chuẩn hóa quy trình cũng như đáp ứng các yêu cầu của Thực hành sản xuất tốt hiện hành (cGMP).
Tất nhiên, các thiết bị xử lý siêu âm Hielscher được chế tạo để hoạt động 24/7 ở mức đầy tải, do đó có thể vận hành đáng tin cậy trong môi trường sản xuất công nghiệp. Nhờ độ bền cao và nhu cầu bảo trì thấp, thời gian ngừng hoạt động của thiết bị siêu âm thực sự rất ít. Các tính năng CIP (vệ sinh tại chỗ) và SIP (tiệt trùng tại chỗ) giúp giảm thiểu công việc vệ sinh tốn công sức, đặc biệt vì tất cả các bộ phận tiếp xúc với chất lỏng đều có bề mặt kim loại nhẵn (không có lỗ hoặc vòi phun khuất).

Bảng dưới đây cung cấp thông tin về năng lực xử lý gần đúng của các thiết bị siêu âm của chúng tôi: