Công nghệ siêu âm Hielscher

Chiết xuất Protein Siêu âm từ Tissue và Cell Cultures

  • Chiết xuất protein là một bước chuẩn bị mẫu thiết yếu trong Proteomics.
  • Protein có thể được chiết xuất từ thực vật và mô động vật, nấm men và vi sinh vật.
  • Sonication là một phương pháp chiết xuất protein đáng tin cậy, hiệu quả cho năng suất protein cao trong một thời gian ngắn khai thác.

 

Chiết xuất protein từ các mô và tế bào

Chiết xuất protein từ các mô và tế bào nuôi cấy là một bước chuẩn bị mẫu thiết yếu được thực hiện trong nhiều kỹ thuật sinh hóa và phân tích như ELISA, PAGE, Thấm Tây, Mass spectrometry, hoặc lọc protein. Siêu âm tế bào gián đoạn, lysis và khai thác là một kỹ thuật kiểm soát chính xác để đảm bảo năng suất cao của protein.

Chiết xuất protein từ mô động vật

Đối với việc chuẩn bị các mô toàn bộ kích thước (ví dụ như thận, tim, phổi, cơ vv), mô nên được chia cắt thành miếng rất nhỏ với các công cụ sạch, trên băng tốt, và càng nhanh càng tốt để ngăn ngừa sự suy thoái của protease (ví dụ như lysis đệm như RIPA hoặc hạ huyết áp lysis bộ đệm có chứa protease và cocktail chất ức chế Phosphatase). Sau khi mổ xẻ, mẫu được đắm mình vào nitơ lỏng để đóng băng. Các mẫu có thể được lưu trữ ở-80 ° c để sử dụng sau này hoặc được keept trên băng để đồng nhất ngay lập tức. Ngay trước khi khai thác siêu âm, băng lysis lạnh đệm (với các chất ức chế protease DTT, leupeptin và aprotinin) nhanh chóng được thêm vào ống mẫu (mỗi ~ 10 mg của mô xấp xỉ ~ 600 μL bộ đệm được khuyến cáo). Xấp xỉ 20-60mg mô được khuyến cáo trên mỗi ống mẫu.
Siêu âm homogenization, lysis và khai thác được thực hiện với một homogenizer siêu âm như UP200Ht hoặc là UP200ST, được trang bị một sonotrode Micro-tip. Sonication thời gian là 60-90 giây. tại một chế độ chu kỳ siêu âm của 15 SEC. sonication và 10 sec. thời gian yên. Các mẫu nên được giữ trong băng tất cả các thời gian.
Sau khi đồng nhất siêu âm/khai thác, lysate được ly tâm ở 27, 000g trong khoảng 20 phút. sau đó các supernatent được thu thập, do đó nồng độ protein có thể được xác định bởi một khảo nghiệm protein như Pierce khảo nghiệm protein BCA.

Protein sonication là một phương pháp quan trọng của chuẩn bị mẫu

Siêu âm protein khai thác từ các tế bào với UP200ST

Yêu cầu thông tin




Lưu ý của chúng tôi Chính sách bảo mật.


Chiết xuất protein từ huyết thanh

Đối với một hỗn hợp đồng nhất của huyết thanh và bộ đệm phosphate, mẫu được vortexed đầu tiên trước khi siêu âm tế bào lysis. Đối với các siêu âm lysis, mẫu được sonicated với một phòng thí nghiệm siêu âm homogenizer như UP100H cho 8 chu kỳ ở biên độ 20%, cho chu kỳ mỗi 5 giây và 15 giây tắt. Sonocation được thực hiện bởi sonicationg trong chu kỳ và bằng cách đặt mẫu trên băng để cho một quá nóng và suy thoái nhiệt của mẫu được tránh. Kể từ khi huyết thanh có chứa một lượng lớn protein trọng lượng phân tử cao (như albumin, α1-Antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunoglobulin G và immunoglobulin A), can thiệp vào việc tách các protein trọng lượng phân tử thấp trong quá trình IEF, nó là khuyến khích để làm cạn kiệt chúng từ huyết thanh bằng cách sử dụng một cột suy giảm.

Chiết xuất protein từ mô thực vật

Tươi, mô thực vật mềm, ví dụ như rêu vv, có thể dễ dàng bị gián đoạn bằng cách đơn giản là đặt các vật liệu mẫu xắt nhỏ trong lysis đệm cho sonication. Cứng rắn, các mô thực vật, chẳng hạn như hạt, kim linh sam vv, nên được mặt đất khô. Một số cứng, vật liệu thực vật thân gỗ phải được đông lạnh và mặt đất trong nitơ lỏng trước khi chiết xuất bởi sonication. Đối với thực vật đình chỉ văn hóa tế bào, một điều trị bằng siêu âm giữa 30 và 150 giây trong một bộ đệm lysis là chủ yếu là đủ. Vật liệu khó khăn hơn như hạt bí ngô đòi hỏi một sonication dữ dội hơn như mô tả dưới đây.

Giao thức khai thác siêu âm albumin từ hạt bí ngô

Siêu âm mô homogenizer UP400St với S24d40-cho chiết xuất protein từ thực vật và mô động vật (Click vào để phóng to!)Đối với việc chiết xuất protein siêu âm của albumin từ bột hạt bí ngô nghiền mịn, 10 g bột hạt bí ngô và 100 mL nước bị khử ion như dung môi được thêm vào trong Cốc thủy tinh 250mL. Việc chiết xuất protein bao gồm hai bước: đầu tiên, mẫu được sonicated với một ultrasonicator loại thăm dò UP400St (400W, 24kHz) với gắn sonotrode S24d7. Các Cốc thủy tinh được đặt trong một bồn tắm nước lạnh trong homogenization siêu âm. Các thiết lập của ultrasonicator UP400St với cảm biến nhiệt độ có thể cắm đảm bảo rằng nhiệt độ mẫu luôn được giữ dưới 30 ° c. Bằng cách kiểm soát nhiệt độ chính xác trong quá trình sonication, một sự biến tính của albumin được tránh. Thứ hai, khai thác được thực hiện với một máy trộn ở tốc độ 200 rpm và ở 30 ° c. Sau đó cốc được chuyển thành một shaker nhiệt. Globulin được loại bỏ qua lọc máu với nước cất. Sau khi loại bỏ globulin, chiết xuất protein có thể được lấy mẫu để xác định hồ sơ albumin và sau đó được điều chỉnh để pI = 3.0 bằng 0,1 M HCl cho đông máu albumin. Pha rắn được tách ra bằng cách ly tâm ở 5000g, 20 ° c và tái hòa tan trong nước bị khử ion. Đông máu albumin được thực hiện hai lần để tăng tỷ lệ protein trong tập trung albumin.

Chiết xuất protein kiềm siêu âm để chuẩn bị protein tập trung từ cám gạo cho thấy kết quả điều trị bằng siêu âm trong năng suất protein cao hơn trong thời gian khai thác ngắn hơn đáng kể – so với phương pháp khai thác thông thường.

Thiết bị siêu âm VialTweeter để chiết xuất protein từ mẫu mô (bấm vào để phóng to!)

VialTweeter cho sonication gián tiếp.

Lợi thế

  • Nhanh chóng
  • năng suất cao
  • hiệu quả cao
  • Kiểm soát chính xác các thông số
  • Kết quả tái sanh
  • Khả năng mở rộng tuyến tính

Giao thức chuẩn bị mẫu cho enzyme iNOS chức năng

Để có được enzyme iNOS đầy đủ chức năng (ví dụ như sàng lọc thuốc), khuyến cáo các giao thức sau: việc đình chỉ tế bào nên được đặt trên băng và sonicate với một UP100H tại biên độ 10μm tại chu trình của 5 sec. sonication và 25 SEC. phần còn lại trên băng. Quy trình cần được lặp lại khoảng 3 lần. Thời gian yên ở giữa chu kỳ sonication làm giảm nhiệt độ tăng và do đó sẽ làm giảm nguy cơ biến tính.

Siêu âm protein solubilization

Sonication có thể đẩy nhanh quá trình hòa tan protein, thường đòi hỏi vài giờ. Để không quá nóng mẫu và ngăn chặn sự suy thoái protein và sửa đổi trong các giải pháp có chứa urê, các bùng nổ siêu âm không nên kéo dài hơn vài giây.

Hướng dẫn chung

Kiểm soát nhiệt độ: Để đảm bảo năng suất protein cao mà không có tính biến tính nhiệt, nhiệt độ trong quá trình chiết xuất phải được kiểm soát. Hielscher của nhà nước-of-nghệ thuật siêu âm homogenizers – còn được gọi là siêu âm tan rã hoặc sonificator – có thể kiểm soát chính xác. Họ đi kèm với một cảm biến nhiệt độ có thể cắm. Trong các tùy chọn cài đặt của homogenizer siêu âm, nhiệt độ tối đa có thể được thiết lập. Khi đạt đến nhiệt độ tối đa này, ultrasonicator tự động dừng lại cho đến khi mẫu đã nguội đi.
Bộ đệm: Việc choise của một bộ đệm phù hợp và khối lượng đúng của bộ đệm thay đổi từ mô đến mô và phải được figured-out bằng thử nghiệm và-lỗi kiểm tra.
Cách ly/thanh lọc: Protein lysates có thể chứa một dư thừa của các phân tử sinh học như DNA hoặc carbohydrate, mà có thể được loại bỏ bởi lượng mưa protein (deoxycholate-trichloroacetic acid) hoặc đệm trao đổi.

Chittapalo và noomhorm (2009) báo cáo rằng năng suất protein tăng lên bằng cách sử dụng sonication và rằng quá trình đồng nhất mô siêu âm và lysis có thể tăng cường quá trình khai thác hiện có đáng kể – cho phép các cơ hội khai thác thương mại mới.

Âm thanh bảo vệ với Hielscher của âm thanh enclosure SPB-L và thiết bị siêu âm UP200St. (Click vào để phóng to!)

Siêu âm mô homogenizer UP200ST cho chiết xuất protein hiệu quả

Kiểm soát chính xác điều trị siêu âm (Click vào để phóng to!)

Điều khiển trình duyệt cho hoạt động chính xác và giám sát quá trình sonication

Thiết bị siêu âm để chiết xuất protein

Hielscher Ultrasonics cung cấp một loạt các siêu âm homogenizers cho sự tan rã của các tế bào, mô, vi khuẩn, vi sinh vật, men, và bào tử.
Hielscher phòng thí nghiệm ultrasonicators là mạnh mẽ và dễ dàng để hoạt động. Được xây dựng cho hoạt động 24/7, chúng được thiết kế như là các thiết bị phòng thí nghiệm mạnh mẽ và hiệu quả. Đối với tất cả các thiết bị, đầu ra năng lượng và biên độ có thể được kiểm soát chính xác. Phạm vi rộng của Phụ kiện mở thêm tùy chọn thiết lập. Các thiết bị kỹ thuật số như VialTweeter, UP200Ht, UP200ST, và UP400St có một kiểm soát nhiệt độ tích hợp và một thẻ SD tích hợp để ghi dữ liệu tự động.
Đối với sonication gián tiếp, không nhiễm chéo và đồng thời của nhiều mẫu, chúng tôi cung cấp VialTweeter hoặc các Siêu âm CupHorn.
Tùy thuộc vào ứng dụng, vật liệu và khối lượng mẫu của bạn, chúng tôi sẽ đề nghị bạn thiết lập phù hợp nhất cho chuẩn bị mẫu của bạn. Liên hệ với chúng tôi hôm nay!

Liên hệ chúng tôi! / Hỏi chúng tôi!

Vui lòng sử dụng mẫu dưới đây, nếu bạn muốn yêu cầu thêm thông tin về đồng nhất bằng siêu âm. Chúng tôi sẽ vui lòng cung cấp cho bạn một hệ thống siêu âm đáp ứng yêu cầu của bạn.










Văn học / Tài liệu tham khảo

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): siêu âm hỗ trợ kiềm khai thác protein từ cám gạo và các tính chất của protein tập trung. Int J thực phẩm Sci Technol 44:1843 – 1849.
  • Simões, André E. S:; ^ Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Chỉ đạo, Clifford J.; ^ Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): hiệu quả phục hồi của protein từ nhiều mẫu nguồn sau khi trizol hoặc trizol LS RNA khai thác và lưu trữ dài hạn. BMC Genomics 2013, 14:181.


Sự kiện đáng biết

Proteomic

Proteomics là lĩnh vực nghiên cứu điều tra protein và proteome. Protein fullfil một loạt các chức năng quan trọng trong sinh vật. Proteome là toàn bộ các protein được thể hiện bằng một bộ gen, tế bào, mô, hoặc sinh vật tại một thời gian nhất định. Các proteome thay đổi theo thời gian và yêu cầu riêng biệt, hoặc nhấn mạnh, rằng một tế bào hoặc sinh vật trải qua. Cụ thể hơn, nó là tập hợp các protein bày tỏ trong một loại tế bào hoặc sinh vật nhất định, tại một thời gian nhất định, trong điều kiện xác định. Thuật ngữ này là một sự pha trộn của protein và bộ gen. Proteomics là nghiên cứu của các proteome.

Protein

Protein là các phân tử sinh học lớn, được gọi là các phân tử vĩ mô – trong đó bao gồm từ một hoặc nhiều chuỗi dài của dư lượng axit amin. Protein có mặt trong tất cả các sinh vật của cả hai thực vật và động vật có nguồn gốc và họ là rất quan trọng đối với hầu hết các chức năng. Vì các protein chứa rất nhiều thông tin sinh học, chúng được chiết xuất cho mục đích phân tích, ví dụ như đối với nghiên cứu proteomic. Chức năng quan trọng nhất được thực hiện bởi các protein bao gồm các xúc tác của các phản ứng trao đổi chất, sao chép DNA, phản ứng với các kích thích, và vận chuyển các phân tử từ một địa chỉ khác. Protein khác với nhau chủ yếu trong chuỗi các axit amin, được quyết định bởi chuỗi nucleotide của gen của chúng, và thường kết quả trong việc xếp protein thành một cấu trúc ba chiều cụ thể xác định hoạt động của nó. Protein là – ngoài peptide – một trong những thành phần chính của thực phẩm. Do đó, proteomic là một công cụ mạnh mẽ trong khoa học thực phẩm để tối ưu hóa các quy trình, an toàn thực phẩm và đánh giá dinh dưỡng.

Gel electrophoresis

Điện di gel là phương pháp chính để chia tách và phân tích các phân tử vĩ mô như DNA, RNA và protein cũng như các mảnh vỡ của chúng, dựa trên kích thước và tính phí của chúng. Nó được sử dụng trong hóa học lâm sàng cho các protein riêng biệt bằng cách sạc và/hoặc kích thước (ief phát sinh, về cơ bản kích thước độc lập) và trong ngành hóa học, phân tử và các proteomic để tách một dân số hỗn hợp của DNA và các mảnh RNA theo chiều dài, để ước tính kích thước của Phân đoạn DNA và RNA hoặc để tách các protein theo phí.

Tế bào văn hóa

Văn hóa tế bào là quá trình phát triển kiểm soát mà các tế bào được trồng trong điều kiện kiểm soát. Điều kiện văn hóa tế bào khác nhau cho mỗi loại tế bào. Nói chung, môi trường của một nền văn hóa tế bào bao gồm một con tàu phù hợp (ví dụ: món Petri) với bề mặt hoặc phương tiện cung cấp các chất dinh dưỡng thiết yếu (axit amin, carbohydrate, vitamin, khoáng chất), yếu tố tăng trưởng, kích thích tố, và khí (CO2O2), và điều chỉnh môi trường vật lý hóa học (đệm pH, áp suất thẩm thấu, nhiệt độ). Hầu hết các tế bào cần một bề mặt hoặc chất nền nhân tạo, trong khi các nền văn hóa tế bào khác có thể được canh tác miễn phí nổi trong môi trường văn hóa (văn hoá đình chỉ, đình chỉ tế bào).
Văn hóa đại chúng của dòng tế bào động vật được sử dụng trong sản xuất công nghiệp của các loại vắc-xin virus và các sản phẩm khác có nguồn gốc biotechnologically. Tế bào gốc của con người được nuôi cấy để mở rộng số lượng tế bào và phân biệt các tế bào thành các loại tế bào Soma khác nhau cho các mục đích transplantation.

Mẫu mô

Thuật ngữ mô mô tả một tế bào trung gian, nơi mà các vật liệu tế bào là trên một mức độ tổ chức giữa các tế bào và một cơ quan hoàn chỉnh. Trong mô, các tế bào tương tự, từ cùng một nguồn gốc mà cùng nhau thực hiện một chức năng cụ thể, được lắp ráp. Bởi các nhóm chức năng của nhiều mô, các cấu trúc phức tạp của các cơ quan được hình thành.
Mô được lấy mẫu cho các nghiên cứu trong sinh học, histology/bệnh, ký sinh trùng, khoa hóa học, Pháp cũng như để trồng và chiết xuất DNA. Nó có thể được phân biệt giữa động vật (phân ngành: mô có vú) và mô thực vật. Mô động vật được nhóm lại thành bốn loại cơ bản của liên kết, cơ bắp, thần kinh, và mô biểu mô. Mô thực vật được chia thành ba hệ thống mô sau đây: lớp biểu bì, mô mặt đất, và mô mạch.
Các mẫu mô có thể được chuẩn bị từ các bộ phận của động vật hoặc thực vật, ví dụ như xương, cơ, lá, vv

Chất lỏng cơ thể

Máu, huyết thanh, huyết tương, Dịch não tủy, nước bọt và dịch khớp là chất dịch cơ thể, cung cấp một nguồn thông tin có liên quan đến chẩn đoán tuyệt vời. Vì vậy, một chuẩn bị tinh vi của các mẫu chất lỏng cơ thể để phân tích là quan trọng. Khó khăn đầu tiên có liên quan đến phạm vi năng động rộng của các thành phần hiện diện trong dịch cơ thể.

Xác định nồng độ protein

Bradford Assay, Lowry khảo nghiệm và axit bicinchoninic (BCA) khảo nghiệm được phổ biến xét nghiệm để xác định nồng độ protein. Albumin huyết thanh bò (BSA) là một trong những tiêu chuẩn protein được sử dụng thường xuyên nhất.

Lysis đệm

Lysis đệm phải được chọn phù hợp với các vật liệu tế bào hoặc mô (mô văn hóa, thực vật, vi khuẩn, nấm, vv), và cho dù các tế bào có trong một cấu trúc và các loại cấu trúc. Một loạt các chất đệm lysis để khai thác các protein, màng, và các bào quan được xây dựng với một hoặc nhiều chất tẩy rửa. Chất tẩy rửa thường được lựa chọn qua các xét nghiệm thử và lỗi – Nếu có – theo một giao thức chiết xuất protein hiện có. Các chất tẩy rửa phải tương thích với các nguồn mô và các protein. Nói chung, các chất tẩy rửa nhẹ nhất mà làm việc cho một mô cụ thể/protein, được chọn để duy trì chức năng tối đa của chiết xuất. Hơn nữa, trong trường hợp khai thác màng và các chất hữu cơ, một chất tẩy nhẹ giữ nguyên vẹn màng. Các chất tẩy rửa thường được sử dụng trong bộ đệm lysis chủ yếu là không hoặc Zwitterion, ví dụ chaps, deoxycholate, Triton™ X-100, NP40, và tween 20.
Ví dụ:, các mô như não, gan, ruột, thận, lá lách, vv có thể được chỉ đơn giản là buffered với RIPA – Tuy nhiên thuốc ức chế protease và DTT (ví dụ như cho điện di gel) nên được bao gồm.
Lysis đệm cho mô cơ xương (băng lạnh): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol bổ sung với protease và cocktail chất ức chế Phosphatase
Bảng các bộ đệm thông thường và phạm vi pH của chúng. Nói chung, các bộ đệm này thường được sử dụng ở nồng độ 20-50 mM.

Bộ đệm phạm vi pH
Axít citric – Naoh 2,2 – 6,5
Natri citrat – Axít citric 3,0 – 6,2
Natri axetat – axit axetic 3,6 – 5,6
Muối natri axit cacodylic – Hcl 5,0 – 7,4
Mes – Naoh 5,6 – 6,8
Natri dihydrogen phosphate – Disodium Hydrogen phosphate 5,8 – 8,0
Imidazole – Hcl 6,2 – 7,8
MOPS – Koh 6,6 – 7,8
Triethanolamine Hiđrôclorua – Naoh 6,8 – 8,8
Tris – Hcl 7,0 – 9,0
Các HEPES – Naoh 7,2 – 8,2
Tricine là – Naoh 7,6 – 8,6
Natri tetraborat – axit boric 7,6 – 9,2
Tiếng bicine – Naoh 7,7 – 8,9
Glycine – Naoh 8,6 – 10,6

Hầu hết các bộ đệm Hiển thị pH-phụ thuộc với nhiệt độ. Điều này đặc biệt đúng đối với các bộ đệm Tris. PKa thay đổi từ 8,06 ở 25 ° c đến 8,85 ở 0 ° c.
(pH và pKa của một bộ đệm: pH các biện pháp nồng độ của các ion hydro trong một dung dịch nước. pKa (= liên tục phân ly axit) là một biện pháp liên quan, nhưng cụ thể hơn, trong đó nó giúp để dự đoán làm thế nào một loại vi khuẩn sẽ hoạt động ở một giá trị pH cụ thể.)

TRIzol

TRIzol là một giải pháp hóa học được sử dụng để chiết xuất RNA/DNA/protein trong quá trình khai thác guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform. Việc sử dụng ultrasonically hỗ trợ TRIzol kết quả khai thác trong DNA cao, RNA, và năng suất protein từ cùng một mẫu và trội do đó phương pháp khai thác khác.