Khai thác protein siêu âm từ nuôi cấy mô và tế bào
- Chiết xuất protein là một bước chuẩn bị mẫu thiết yếu trong proteomics.
- Protein có thể được chiết xuất từ mô thực vật và động vật, nấm men và vi sinh vật.
- Sonication là một phương pháp chiết xuất protein đáng tin cậy, hiệu quả cho năng suất protein cao trong thời gian chiết xuất ngắn.
Chiết xuất protein từ mô và tế bào
Chiết xuất protein từ các mô và tế bào nuôi cấy là một bước chuẩn bị mẫu thiết yếu được thực hiện trong nhiều kỹ thuật phân tích và sinh hóa như ELISA, PAGE, Western blotting, khối phổ hoặc tinh chế protein. Phá vỡ tế bào siêu âm, ly giải và chiết xuất là một kỹ thuật không nhiệt có thể kiểm soát chính xác để đảm bảo năng suất protein cao.
Chiết xuất protein từ tế bào với đầu dò siêu âm UP200St
- Nhanh chóng
- năng suất cao
- Hiệu quả cao
- Kiểm soát chính xác các thông số
- Kết quả tái tạo
- Khả năng mở rộng tuyến tính
Hướng dẫn chung cho ly giải siêu âm và chiết xuất protein
- Kiểm soát nhiệt độ: Để đảm bảo năng suất protein cao mà không bị biến tính nhiệt, nhiệt độ trong quá trình chiết xuất phải được kiểm soát. Máy đồng nhất siêu âm hiện đại của Hielscher – còn được gọi là máy phân hủy siêu âm hoặc siêu âm – có thể điều khiển chính xác. Chúng đi kèm với một cảm biến nhiệt độ có thể cắm được. Trong các tùy chọn cài đặt của máy đồng nhất siêu âm, nhiệt độ tối đa có thể được đặt. Khi đạt đến nhiệt độ tối đa này, máy siêu âm sẽ tự động dừng cho đến khi mẫu nguội đi.
- Bộ đệm: Việc lựa chọn một dung dịch đệm phù hợp và thể tích đệm phù hợp thay đổi giữa các mô và phải được tìm ra bằng thử nghiệm thử và sai.
- Cách ly / thanh lọc: Chất ly giải protein có thể chứa dư thừa các phân tử sinh học như DNA hoặc carbohydrate, có thể được loại bỏ bằng cách kết tủa protein (axit deoxycholate-trichloroacetic) hoặc trao đổi đệm.
Chittapalo và Noomhorm (2009) đã báo cáo trong nghiên cứu của họ rằng năng suất protein tăng lên bằng cách sử dụng siêu âm và quá trình ly giải và đồng nhất mô siêu âm có thể tăng cường đáng kể các quy trình chiết xuất hiện có – tạo điều kiện cho các cơ hội khai thác thương mại mới.
Cuphorn siêu âm để chuẩn bị mẫu đồng thời, hiệu quả cao của nhiều mẫu trong cùng một điều kiện để phân lập protein và phân mảnh DNA.
Chiết xuất protein từ mô động vật
Để chuẩn bị mô có kích thước toàn bộ (ví dụ: thận, tim, phổi, cơ, v.v.), mô nên được mổ xẻ thành các mảnh rất nhỏ bằng dụng cụ sạch, tốt nhất là trên đá và càng nhanh càng tốt để ngăn chặn sự phân hủy của protease (ví dụ: đệm ly giải như RIPA hoặc dung dịch đệm ly giải giảm trương có chứa protease và cocktail ức chế phosphatase). Sau khi mổ xẻ, mẫu được ngâm vào nitơ lỏng để đông lạnh. Mẫu có thể được bảo quản ở -80 ° C để sử dụng sau này hoặc được giữ trên đá để đồng nhất ngay lập tức. Ngay trước khi chiết xuất siêu âm, dung dịch đệm ly giải lạnh bằng đá (với chất ức chế protease DTT, leupeptin và aprotinin) được thêm nhanh vào ống mẫu (khuyến cáo cho mỗi ~ 10 mg mô khoảng ~ 600 μL dung dịch đệm). Xấp xỉ 20-60mg mô được khuyến nghị cho mỗi ống mẫu.
Đồng nhất, ly giải và chiết xuất siêu âm được thực hiện bằng máy đồng nhất siêu âm như UP100H hoặc UP200Ht, được trang bị sonotrode đầu siêu nhỏ. Thời lượng siêu âm là 60-90 giây ở chế độ chu kỳ siêu âm 15 giây và 10 giây thời gian nghỉ ngơi. Mẫu nên được giữ trong đá mọi lúc.
Sau khi đồng nhất / chiết xuất siêu âm, chất ly giải được ly tâm ở 27.000g trong khoảng 20 phút. Sau đó, supernatent được thu thập, để nồng độ protein có thể được xác định bằng một xét nghiệm protein như xét nghiệm protein Pierce BCA.
Chiết xuất protein từ huyết thanh
Đối với hỗn hợp đồng nhất của huyết thanh và dung dịch đệm phốt phát, mẫu được xoáy trước khi ly giải tế bào siêu âm. Đối với ly giải siêu âm, mẫu được sonicated với một homogenizer phòng thí nghiệm siêu âm như UP100H cho 8 chu kỳ ở biên độ 20%, cho chu kỳ của mỗi 5 giây trên và 15 giây tắt. Khai thác protein được thực hiện bằng cách sonicating theo chu kỳ (chế độ xung) và bằng cách đặt mẫu lên băng để tránh quá nhiệt và suy thoái nhiệt của mẫu. Vì huyết thanh chứa một lượng lớn protein trọng lượng phân tử cao (như albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunoglobulin G và immunoglobulin A), cản trở việc tách protein trọng lượng phân tử thấp trong IEF, nên làm cạn kiệt chúng khỏi huyết thanh bằng cách sử dụng cột cạn kiệt.
Chiết xuất protein từ mô thực vật
Mô thực vật tươi, mềm, ví dụ như rêu, v.v., có thể dễ dàng bị phá vỡ bằng cách đặt vật liệu mẫu đã cắt nhỏ vào bộ đệm ly giải để siêu âm. Các mô thực vật cứng, linh tinh, chẳng hạn như hạt, kim linh sam, v.v., nên được xay khô. Một số nguyên liệu thực vật cứng, thân gỗ phải được đông lạnh và nghiền trong nitơ lỏng trước khi chiết xuất bằng cách siêu âm. Đối với huyền phù nuôi cấy tế bào thực vật, xử lý siêu âm từ 30 đến 150 giây trong dung dịch đệm ly giải hầu hết là đủ. Vật liệu cứng hơn như hạt bí ngô đòi hỏi quá trình siêu âm mạnh hơn như được mô tả dưới đây.
Giao thức chiết xuất siêu âm Albumin từ hạt bí ngô
Để chiết xuất siêu âm protein albumin từ bột hạt bí ngô xay mịn, 10 g bột hạt bí ngô đã khử mỡ và 100 mL nước khử ion làm dung môi được thêm vào cốc thủy tinh 250mL. Quá trình chiết xuất protein bao gồm hai bước: Đầu tiên, mẫu được siêu âm bằng một máy siêu âm kiểu đầu số UP400St (400W, 24kHz) được trang bị sonotrode S24d7. Cốc thủy tinh được đặt trong nồi cách thủy lạnh trong quá trình đồng nhất siêu âm. Cảm biến nhiệt độ có thể cắm được và cài đặt kiểm soát nhiệt độ của máy siêu âm UP400St đảm bảo rằng nhiệt độ mẫu luôn được giữ dưới 30 °C. Bằng cách kiểm soát nhiệt độ chính xác trong quá trình siêu âm, tránh được sự biến tính của albumin. Thứ hai, chiết xuất được thực hiện bằng máy trộn ở tốc độ 200 vòng / phút và ở 30 ° C. Sau đó, cốc được chuyển vào bình lắc điều nhiệt. Globulin được loại bỏ thông qua lọc máu bằng nước cất. Sau khi loại bỏ globulin, chiết xuất protein có thể được lấy mẫu để xác định hồ sơ albumin và sau đó được điều chỉnh thành pI = 3,0 bằng cách sử dụng 0,1 M HCl để đông máu albumin. Pha rắn được tách ra bằng cách ly tâm ở 5000g, 20°C và hòa tan lại trong nước khử ion. Quá trình đông máu albumin được thực hiện hai lần để tăng tỷ lệ protein trong albumin cô đặc.
Chiết xuất protein kiềm siêu âm để điều chế protein cô đặc từ cám gạo cho thấy xử lý siêu âm dẫn đến năng suất protein cao hơn trong thời gian chiết xuất ngắn hơn đáng kể – so với các phương pháp chiết xuất thông thường.
Quy trình chuẩn bị mẫu cho Enzyme iNOS chức năng
Để có được enzyme iNOS đầy đủ chức năng (ví dụ: để sàng lọc thuốc), phác đồ sau được khuyến nghị: Huyền phù tế bào nên được đặt trên đá và được siêu âm bằng UP100H ở biên độ 10μm ở chế độ chu kỳ 5 giây siêu âm và 25 giây nghỉ ngơi trên đá. Quy trình nên được lặp lại khoảng 3 lần. Thời gian nghỉ giữa các chu kỳ siêu âm làm giảm sự gia tăng nhiệt độ và do đó sẽ làm giảm nguy cơ biến tính.
hòa tan protein siêu âm
Quá trình siêu âm có thể đẩy nhanh quá trình hòa tan protein, thường mất vài giờ. Để không làm mẫu quá nóng và ngăn chặn sự thoái hóa và biến đổi protein trong dung dịch có chứa urê, các vụ nổ siêu âm không được kéo dài quá vài giây.
siêu âm UP200Ht với microtip S26d2 2mm để siêu âm các mẫu nhỏ.
Thiết bị siêu âm để chiết xuất protein
Hielscher Ultrasonics cung cấp một loạt các bộ đồng nhất siêu âm để phân hủy tế bào, mô, vi khuẩn, vi sinh vật, nấm men và bào tử.
Máy siêu âm phòng thí nghiệm Hielscher mạnh mẽ và dễ vận hành. Được chế tạo để hoạt động 24/7, chúng được thiết kế như các thiết bị phòng thí nghiệm và để bàn mạnh mẽ và hiệu quả. Đối với tất cả các thiết bị, đầu ra năng lượng và biên độ có thể được kiểm soát chính xác. Nhiều loại phụ kiện mở ra các tùy chọn thiết lập khác. Các máy siêu âm kỹ thuật số như VialTweeter, UP200Ht, UP200St và UP400St có bộ điều khiển nhiệt độ tích hợp và thẻ SD tích hợp để ghi dữ liệu tự động.
Để siêu âm gián tiếp, không lây nhiễm chéo và đồng thời của nhiều mẫu, chúng tôi cung cấp VialTweeter hoặc CupHorn siêu âm.
Bảng dưới đây cung cấp cho bạn cái nhìn tổng quan về máy siêu âm của chúng tôi để chuẩn bị mẫu, phá vỡ tế bào và chiết xuất. Nhấp vào loại thiết bị để biết thêm thông tin về từng máy đồng nhất siêu âm. Đội ngũ nhân viên kỹ thuật được đào tạo bài bản và có kinh nghiệm lâu năm của chúng tôi sẽ sẵn lòng giúp bạn lựa chọn máy siêu âm phù hợp nhất để chuẩn bị mẫu!
| Khối lượng hàng loạt | Tốc độ dòng chảy | Thiết bị được đề xuất |
|---|---|---|
| lên đến 10 lọ hoặc ống | N.A. | LọTweeter |
| Tấm multigiếng / microtiter | N.A. | UIP400MTP |
| nhiều ống / tàu | N.A. | Cuphorn |
| 1 đến 500mL | 10 đến 200ml / phút | UP100H |
| 10 đến 1000mL | 20 đến 200ml / phút | UP200Ht, UP200St |
| 10 đến 2000mL | 20 đến 400ml / phút | UP400ST |
Tùy thuộc vào ứng dụng, vật liệu và khối lượng mẫu của bạn, chúng tôi sẽ đề xuất cho bạn thiết lập phù hợp nhất cho việc chuẩn bị mẫu của mình. Liên hệ với chúng tôi ngay hôm nay!
Liên hệ với chúng tôi! / Hãy hỏi chúng tôi!
Máy siêu âm kỹ thuật số Hielscher có điều khiển từ xa của trình duyệt và giao thức dữ liệu tự động trên thẻ SD tích hợp.
LọTweeter để siêu âm gián tiếp.
Sự thật đáng biết
Proteomics
Proteomics là lĩnh vực nghiên cứu nghiên cứu protein và proteome. Protein hoàn thành một loạt các chức năng quan trọng trong các sinh vật. Proteome là toàn bộ tập hợp các protein được biểu hiện bởi một bộ gen, tế bào, mô hoặc sinh vật tại một thời điểm nhất định. Proteome thay đổi theo thời gian và các yêu cầu riêng biệt, hoặc căng thẳng, mà một tế bào hoặc sinh vật phải trải qua. Cụ thể hơn, nó là tập hợp các protein biểu hiện trong một loại tế bào hoặc sinh vật nhất định, tại một thời điểm nhất định, trong các điều kiện xác định. Thuật ngữ này là sự pha trộn của protein và bộ gen. Proteomics là nghiên cứu về proteome.
Protein
Protein là các phân tử sinh học lớn, được gọi là đại phân tử – được cấu tạo từ một hoặc nhiều chuỗi dài dư lượng axit amin. Protein có mặt trong tất cả các sinh vật có nguồn gốc thực vật và động vật và chúng rất quan trọng đối với hầu hết các chức năng sinh học. Vì protein chứa rất nhiều thông tin sinh học, chúng được chiết xuất cho mục đích phân tích, ví dụ như cho nghiên cứu proteomic. Chức năng quan trọng nhất được thực hiện bởi protein bao gồm xúc tác các phản ứng trao đổi chất, sao chép DNA, phản ứng với các kích thích và vận chuyển các phân tử từ vị trí này sang vị trí khác. Các protein khác nhau chủ yếu ở trình tự axit amin của chúng, được quyết định bởi trình tự nucleotide của gen của chúng và thường dẫn đến việc protein gấp thành một cấu trúc ba chiều cụ thể xác định hoạt động của nó. Protein là – Bên cạnh peptide – một trong những thành phần quan trọng của thực phẩm. Do đó, proteomics là một công cụ mạnh mẽ trong khoa học thực phẩm để tối ưu hóa quy trình, an toàn thực phẩm và đánh giá dinh dưỡng.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction là một quy trình tiền phân tích để tách và xác nhận trước các chất phân tích. Kết hợp với siêu âm, chiết xuất điểm đám mây có thể được tăng cường làm cho quá trình hiệu quả hơn, nhanh hơn và thân thiện với môi trường hơn. Với siêu âm, chiết xuất điểm đục là một phương pháp chuẩn bị chất phân tích hiệu quả hơn đáng kể. Đọc thêm về trích xuất điểm đám mây được hỗ trợ siêu âm!Điện di gel
Điện di gel là phương pháp chính để tách và phân tích các đại phân tử như DNA, RNA và protein cũng như các mảnh của chúng, dựa trên kích thước và điện tích của chúng. Nó được sử dụng trong hóa học lâm sàng để tách protein theo điện tích và / hoặc kích thước (IEF agarose, về cơ bản không phụ thuộc vào kích thước) và trong hóa sinh, sinh học phân tử và proteomics để tách một quần thể hỗn hợp các đoạn DNA và RNA theo chiều dài, để ước tính kích thước của các đoạn DNA và RNA hoặc để tách protein theo điện tích.
nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào là quá trình phát triển có kiểm soát mà các tế bào được nuôi cấy trong điều kiện được kiểm soát. Điều kiện nuôi cấy tế bào khác nhau tùy theo từng loại tế bào. Nói chung, môi trường nuôi cấy tế bào bao gồm một bình thích hợp (ví dụ: đĩa Petri) với chất nền hoặc môi trường cung cấp các chất dinh dưỡng thiết yếu (axit amin, carbohydrate, vitamin, khoáng chất), các yếu tố tăng trưởng, hormone và khí (CO2, O2), và điều chỉnh môi trường hóa lý (đệm pH, áp suất thẩm thấu, nhiệt độ). Hầu hết các tế bào cần bề mặt hoặc chất nền nhân tạo, trong khi các tế bào nuôi cấy khác có thể được nuôi cấy nổi tự do trong môi trường nuôi cấy (nuôi cấy huyền phù, huyền phù tế bào).
Nuôi cấy hàng loạt các dòng tế bào động vật được sử dụng trong sản xuất công nghiệp vắc-xin virus và các sản phẩm có nguồn gốc công nghệ sinh học khác. Tế bào gốc của con người được nuôi cấy để mở rộng số lượng tế bào và biệt hóa các tế bào thành các loại tế bào soma khác nhau cho mục đích cấy ghép.
Mẫu mô
Thuật ngữ mô mô tả một tế bào trung gian, trong đó vật liệu tế bào ở cấp độ tổ chức giữa các tế bào và một cơ quan hoàn chỉnh. Trong mô, các tế bào tương tự, từ cùng một nguồn gốc cùng nhau thực hiện một chức năng cụ thể, được lắp ráp. Bằng cách nhóm chức năng của nhiều mô, các cấu trúc phức tạp của các cơ quan được hình thành.
Mô được lấy mẫu để nghiên cứu về sinh học, mô học / mô bệnh học, ký sinh trùng học, hóa sinh, hóa mô miễn dịch cũng như nuôi cấy và chiết xuất DNA. Nó có thể được phân biệt giữa động vật (phân khu: mô động vật có vú) và mô thực vật. Các mô động vật được nhóm thành bốn loại cơ bản là mô liên kết, cơ, thần kinh và biểu mô. Mô thực vật được chia thành ba hệ thống mô sau: biểu bì, mô mặt đất và mô mạch.
Các mẫu mô có thể được chuẩn bị từ các bộ phận động vật hoặc thực vật, ví dụ như xương, cơ, lá, v.v.
Chất lỏng cơ thể
Máu, huyết thanh, huyết tương, dịch não tủy, nước bọt và dịch hoạt dịch là dịch cơ thể, cung cấp một nguồn thông tin tuyệt vời có liên quan đến chẩn đoán. Do đó, việc chuẩn bị tinh vi các mẫu dịch cơ thể để phân tích là rất quan trọng. Khó khăn đầu tiên liên quan đến phạm vi động rộng của các thành phần có trong dịch cơ thể.
Xác định nồng độ protein
Xét nghiệm Bradford, xét nghiệm Lowry và xét nghiệm axit bicinchoninic (BCA) là các xét nghiệm phổ biến để xác định nồng độ protein. Albumin huyết thanh bò (BSA) là một trong những tiêu chuẩn protein được sử dụng thường xuyên nhất.
Dung dịch đệm ly giải
Dung dịch đệm ly giải phải được lựa chọn phù hợp với vật liệu hoặc mô tế bào (nuôi cấy mô, thực vật, vi khuẩn, nấm, v.v.) và liệu các tế bào có ở trong cấu trúc và loại cấu trúc hay không. Một loạt các chất đệm ly giải để chiết xuất protein, màng và bào quan được pha chế với một hoặc nhiều chất tẩy rửa. Chất tẩy rửa thường được lựa chọn thông qua các thử nghiệm thử và sai hoặc – Nếu có – theo quy trình chiết xuất protein hiện có. Chất tẩy rửa phải tương thích với nguồn mô và protein. Nói chung, chất tẩy rửa nhẹ nhất hoạt động cho một mô / protein cụ thể, được chọn để duy trì chức năng tối đa của chiết xuất. Hơn nữa, trong trường hợp chiết xuất màng và bào quan, chất tẩy rửa nhẹ giữ cho màng nguyên vẹn. Chất tẩy rửa thường được sử dụng trong dung dịch đệm ly giải chủ yếu là không ion hoặc zwitterionic, ví dụ như CHAPS, deoxycholate, Triton™ X-100, NP40 và Tween 20.
Ví dụ, các mô như não, gan, ruột, thận, lá lách, v.v. có thể được đệm đơn giản bằng RIPA – tuy nhiên, nên bao gồm các chất ức chế protease và DTT (ví dụ: điện di gel).
Dung dịch đệm ly giải cho mô cơ xương (đá lạnh): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol bổ sung protease và cocktail ức chế phosphatase
Bảng dung dịch đệm phổ biến và phạm vi pH của chúng. Nói chung, các dung dịch đệm này thường được sử dụng ở nồng độ 20-50 mM.
| bộ đệm | Phạm vi pH |
|---|---|
| Axit xitric – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Natri citrate – Axit xitric | 3.0 – 6.2 |
| Natri axetat – axit axetic | 3.6 – 5.6 |
| Muối natri axit Cacodylic – Hcl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Natri dihydro photphat – Dinatri hydro photphat | 5.8 – 8.0 |
| imidazole – Hcl | 6.2 – 7.8 |
| Cây lau nhà – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Triethanolamine hydrochloride – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – Hcl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Natri tetraborat – axit boric | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| Glycine – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Hầu hết các dung dịch đệm đều cho thấy sự phụ thuộc vào độ pH với nhiệt độ. Điều này đặc biệt đúng đối với bộ đệm Tris. pKa thay đổi từ 8,06 ở 25 ° C thành 8,85 ở 0 ° C.
(pH và pKa của dung dịch đệm: pH đo nồng độ các ion hydro trong dung dịch nước. pKa (= hằng số phân ly axit) là một phép đo có liên quan, nhưng cụ thể hơn, trong đó nó giúp dự đoán cách một phân tử sẽ hoạt động ở một giá trị pH cụ thể.)
TRIzol
TRIzol là một dung dịch hóa học được sử dụng để chiết xuất RNA / DNA / protein trong quá trình chiết xuất guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform. Việc sử dụng chiết xuất TRIzol hỗ trợ siêu âm dẫn đến năng suất DNA, RNA và protein cao từ cùng một mẫu và vượt trội so với các phương pháp chiết xuất khác.
Văn học/Tài liệu tham khảo
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.