Chiết xuất Protein Siêu âm từ Tissue và Cell Cultures
- Chiết xuất protein là một bước chuẩn bị mẫu thiết yếu trong Proteomics.
- Protein có thể được chiết xuất từ thực vật và mô động vật, nấm men và vi sinh vật.
- Sonication là một phương pháp chiết xuất protein đáng tin cậy, hiệu quả cho năng suất protein cao trong một thời gian ngắn khai thác.
Chiết xuất protein từ các mô và tế bào
Chiết xuất protein từ các mô và tế bào nuôi cấy là một bước chuẩn bị mẫu thiết yếu được thực hiện trong nhiều kỹ thuật sinh hóa và phân tích như ELISA, PAGE, Western blotting, khối phổ hoặc tinh chế protein. Phá vỡ tế bào siêu âm, ly giải và khai thác là một kỹ thuật không nhiệt có thể kiểm soát chính xác để đảm bảo năng suất cao của protein.
Chiết xuất protein từ các tế bào với đầu dò siêu âm UP200St
- Nhanh chóng
- năng suất cao
- hiệu quả cao
- Kiểm soát chính xác các thông số
- Kết quả tái sanh
- Khả năng mở rộng tuyến tính
Hướng dẫn chung cho ly giải siêu âm và khai thác protein
- Kiểm soát nhiệt độ: Để đảm bảo năng suất protein cao mà không có tính biến tính nhiệt, nhiệt độ trong quá trình chiết xuất phải được kiểm soát. Hielscher của nhà nước-of-nghệ thuật siêu âm homogenizers – Còn được gọi là máy tan rã siêu âm hoặc siêu âm – có thể kiểm soát chính xác. Họ đi kèm với một cảm biến nhiệt độ có thể cắm. Trong các tùy chọn cài đặt của homogenizer siêu âm, nhiệt độ tối đa có thể được thiết lập. Khi đạt đến nhiệt độ tối đa này, ultrasonicator tự động dừng lại cho đến khi mẫu đã nguội đi.
- Bộ đệm: Việc choise của một bộ đệm phù hợp và khối lượng đúng của bộ đệm thay đổi từ mô đến mô và phải được figured-out bằng thử nghiệm và-lỗi kiểm tra.
- Cách ly/thanh lọc: Protein lysates có thể chứa một dư thừa của các phân tử sinh học như DNA hoặc carbohydrate, mà có thể được loại bỏ bởi lượng mưa protein (deoxycholate-trichloroacetic acid) hoặc đệm trao đổi.
Chittapalo và Noomhorm (2009) đã báo cáo trong nghiên cứu của họ rằng năng suất protein tăng lên bằng cách sử dụng sonication và quá trình đồng nhất hóa và ly giải mô siêu âm có thể tăng cường đáng kể các quá trình khai thác hiện có – cho phép các cơ hội khai thác thương mại mới.
Siêu âm CupHorn để chuẩn bị mẫu đồng thời, hiệu quả cao của nhiều mẫu trong cùng điều kiện để phân lập protein và phân mảnh DNA.
Chiết xuất protein từ mô động vật
Đối với việc chuẩn bị các mô toàn bộ kích thước (ví dụ như thận, tim, phổi, cơ vv), mô nên được chia cắt thành miếng rất nhỏ với các công cụ sạch, trên băng tốt, và càng nhanh càng tốt để ngăn ngừa sự suy thoái của protease (ví dụ như lysis đệm như RIPA hoặc hạ huyết áp lysis bộ đệm có chứa protease và cocktail chất ức chế Phosphatase). Sau khi mổ xẻ, mẫu được đắm mình vào nitơ lỏng để đóng băng. Các mẫu có thể được lưu trữ ở-80 ° c để sử dụng sau này hoặc được keept trên băng để đồng nhất ngay lập tức. Ngay trước khi khai thác siêu âm, băng lysis lạnh đệm (với các chất ức chế protease DTT, leupeptin và aprotinin) nhanh chóng được thêm vào ống mẫu (mỗi ~ 10 mg của mô xấp xỉ ~ 600 μL bộ đệm được khuyến cáo). Xấp xỉ 20-60mg mô được khuyến cáo trên mỗi ống mẫu.
Siêu âm đồng nhất, ly giải và khai thác được thực hiện với một homogenizer siêu âm như UP100H hoặc UP200Ht, được trang bị một sonotrode micro-tip. Thời gian sonication là 60-90 giây. ở chế độ chu kỳ siêu âm 15 giây. sonication và 10 giây thời gian nghỉ ngơi. Mẫu nên được giữ trong đá mọi lúc.
Sau khi đồng nhất siêu âm/khai thác, lysate được ly tâm ở 27, 000g trong khoảng 20 phút. sau đó các supernatent được thu thập, do đó nồng độ protein có thể được xác định bởi một khảo nghiệm protein như Pierce khảo nghiệm protein BCA.
Chiết xuất protein từ huyết thanh
Đối với hỗn hợp đồng nhất của huyết thanh và đệm phốt phát, mẫu được xoáy trước khi ly giải tế bào siêu âm. Đối với ly giải siêu âm, mẫu được sonicated với một homogenizer phòng thí nghiệm siêu âm như UP100H cho 8 chu kỳ ở biên độ 20%, cho chu kỳ của mỗi 5 giây trên và 15 giây tắt. Khai thác protein được thực hiện bằng cách sonicating theo chu kỳ (chế độ xung) và bằng cách đặt mẫu lên băng để tránh quá nhiệt và suy thoái nhiệt của mẫu. Vì huyết thanh chứa một lượng lớn protein trọng lượng phân tử cao (như albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunoglobulin G và immunoglobulin A), cản trở việc tách protein trọng lượng phân tử thấp trong IEF, nên làm cạn kiệt chúng khỏi huyết thanh bằng cách sử dụng cột cạn kiệt.
Chiết xuất protein từ mô thực vật
Tươi, mô thực vật mềm, ví dụ như rêu vv, có thể dễ dàng bị gián đoạn bằng cách đơn giản là đặt các vật liệu mẫu xắt nhỏ trong lysis đệm cho sonication. Cứng rắn, các mô thực vật, chẳng hạn như hạt, kim linh sam vv, nên được mặt đất khô. Một số cứng, vật liệu thực vật thân gỗ phải được đông lạnh và mặt đất trong nitơ lỏng trước khi chiết xuất bởi sonication. Đối với thực vật đình chỉ văn hóa tế bào, một điều trị bằng siêu âm giữa 30 và 150 giây trong một bộ đệm lysis là chủ yếu là đủ. Vật liệu khó khăn hơn như hạt bí ngô đòi hỏi một sonication dữ dội hơn như mô tả dưới đây.
Giao thức khai thác siêu âm albumin từ hạt bí ngô
Đối với việc chiết xuất protein siêu âm của albumin từ bột hạt bí ngô nghiền mịn, 10 g bột hạt bí ngô khử mỡ và 100 ml nước khử ion làm dung môi được thêm vào cốc thủy tinh 250ml. Việc chiết xuất protein bao gồm hai bước: Đầu tiên, mẫu được sonicated với một ultrasonicator loại thăm dò UP400St (400W, 24kHz) được trang bị sonotrode S24d7. Cốc thủy tinh được đặt trong bồn nước lạnh trong quá trình đồng nhất siêu âm. Cảm biến nhiệt độ có thể cắm và cài đặt kiểm soát nhiệt độ của ultrasonicator UP400St đảm bảo rằng nhiệt độ mẫu luôn được giữ dưới 30 °C. Bằng cách kiểm soát nhiệt độ chính xác trong quá trình sonication, tránh được sự biến tính của albumin. Thứ hai, việc chiết xuất được thực hiện bằng máy trộn ở tốc độ 200 vòng / phút và ở 30 ° C. Sau đó, cốc được chuyển vào máy lắc tĩnh nhiệt. Globulin được loại bỏ thông qua lọc máu bằng nước cất. Sau khi loại bỏ globulin, chiết xuất protein có thể được lấy mẫu để xác định cấu hình albumin và sau đó được điều chỉnh thành pI = 3,0 bằng cách sử dụng 0,1 M HCl để đông albumin. Pha rắn được tách ra bằng cách ly tâm ở 5000g, 20 ° C và hòa tan lại trong nước khử ion. Đông máu albumin được thực hiện hai lần để tăng tỷ lệ protein trong albumin cô đặc.
Chiết xuất protein kiềm siêu âm để chuẩn bị protein tập trung từ cám gạo cho thấy kết quả điều trị bằng siêu âm trong năng suất protein cao hơn trong thời gian khai thác ngắn hơn đáng kể – so với phương pháp khai thác thông thường.
Giao thức chuẩn bị mẫu cho enzyme iNOS chức năng
Để có được enzyme iNOS đầy đủ chức năng (ví dụ: để sàng lọc thuốc), nên thực hiện giao thức sau: Hệ thống treo tế bào nên được đặt trên băng và được sonicated với UP100H ở biên độ 10μm ở chế độ chu kỳ 5 giây sonication và 25 giây nghỉ ngơi trên băng. Thủ tục nên được lặp lại khoảng 3 lần. Thời gian nghỉ ngơi giữa các chu kỳ sonication làm giảm sự gia tăng nhiệt độ và do đó sẽ làm giảm nguy cơ biến tính.
Siêu âm protein solubilization
Sonication có thể đẩy nhanh quá trình hòa tan protein, thường đòi hỏi vài giờ. Để không quá nóng mẫu và ngăn chặn sự suy thoái protein và sửa đổi trong các giải pháp có chứa urê, các bùng nổ siêu âm không nên kéo dài hơn vài giây.
Siêu âm UP200Ht với 2mm microtip S26d2 cho sonication của các mẫu nhỏ.
Thiết bị siêu âm để chiết xuất protein
Hielscher Ultrasonics cung cấp một loạt các siêu âm homogenizers cho sự tan rã của các tế bào, mô, vi khuẩn, vi sinh vật, men, và bào tử.
Hielscher phòng thí nghiệm ultrasonicators là mạnh mẽ và dễ dàng để hoạt động. Được xây dựng để hoạt động 24/7, chúng được thiết kế như các thiết bị phòng thí nghiệm và băng ghế dự bị mạnh mẽ và hiệu quả. Đối với tất cả các thiết bị, năng lượng đầu ra và biên độ có thể được kiểm soát chính xác. Một loạt các phụ kiện mở ra các tùy chọn thiết lập khác. Các ultrasonicators kỹ thuật số như VialTweeter, UP200Ht, UP200St, và UP400St có một điều khiển nhiệt độ tích hợp và một thẻ SD tích hợp để ghi dữ liệu tự động.
Đối với sonication gián tiếp, không ô nhiễm chéo và đồng thời của nhiều mẫu, chúng tôi cung cấp VialTweeter hoặc siêu âm CupHorn.
Bảng dưới đây cung cấp cho bạn một cái nhìn tổng quan về ultrasonicators của chúng tôi để chuẩn bị mẫu, phá vỡ tế bào và khai thác. Nhấp vào loại thiết bị để biết thêm thông tin về từng máy đồng nhất siêu âm. Nhân viên kỹ thuật được đào tạo tốt và kinh nghiệm lâu năm của chúng tôi sẽ sẵn lòng giúp bạn lựa chọn ultrasonicator phù hợp nhất để chuẩn bị mẫu của bạn!
| batch Khối lượng | Tốc độ dòng | Thiết bị khuyến nghị |
|---|---|---|
| lên đến 10 lọ hoặc ống | N.A. | VialTweeter |
| tấm multiwell / microtiter | N.A. | UIP400MTP (UIP400MTP) |
| nhiều ống / tàu | N.A. | Cuphorn |
| 1 đến 500ml | 10 đến 200mL / phút | UP100H |
| 10 đến 1000mL | 20 đến 200mL / phút | UP200Ht, UP200ST |
| 10 đến 2000mL | 20 đến 400mL / phút | UP400St |
Tùy thuộc vào ứng dụng, vật liệu và khối lượng mẫu của bạn, chúng tôi sẽ đề nghị bạn thiết lập phù hợp nhất cho chuẩn bị mẫu của bạn. Liên hệ với chúng tôi hôm nay!
Liên hệ chúng tôi! / Hỏi chúng tôi!
Hielscher ultrasonicators kỹ thuật số tính năng một trình duyệt điều khiển từ xa và giao thức dữ liệu tự động trên một thẻ SD tích hợp.
VialTweeter cho sonication gián tiếp.
Sự kiện đáng biết
Proteomic
Proteomics là lĩnh vực nghiên cứu điều tra protein và proteome. Protein fullfil một loạt các chức năng quan trọng trong sinh vật. Proteome là toàn bộ các protein được thể hiện bằng một bộ gen, tế bào, mô, hoặc sinh vật tại một thời gian nhất định. Các proteome thay đổi theo thời gian và yêu cầu riêng biệt, hoặc nhấn mạnh, rằng một tế bào hoặc sinh vật trải qua. Cụ thể hơn, nó là tập hợp các protein bày tỏ trong một loại tế bào hoặc sinh vật nhất định, tại một thời gian nhất định, trong điều kiện xác định. Thuật ngữ này là một sự pha trộn của protein và bộ gen. Proteomics là nghiên cứu của các proteome.
Protein
Protein là các phân tử sinh học lớn, được gọi là các phân tử vĩ mô – trong đó bao gồm từ một hoặc nhiều chuỗi dài của dư lượng axit amin. Protein có mặt trong tất cả các sinh vật của cả hai thực vật và động vật có nguồn gốc và họ là rất quan trọng đối với hầu hết các chức năng. Vì các protein chứa rất nhiều thông tin sinh học, chúng được chiết xuất cho mục đích phân tích, ví dụ như đối với nghiên cứu proteomic. Chức năng quan trọng nhất được thực hiện bởi các protein bao gồm các xúc tác của các phản ứng trao đổi chất, sao chép DNA, phản ứng với các kích thích, và vận chuyển các phân tử từ một địa chỉ khác. Protein khác với nhau chủ yếu trong chuỗi các axit amin, được quyết định bởi chuỗi nucleotide của gen của chúng, và thường kết quả trong việc xếp protein thành một cấu trúc ba chiều cụ thể xác định hoạt động của nó. Protein là – ngoài peptide – một trong những thành phần chính của thực phẩm. Do đó, proteomic là một công cụ mạnh mẽ trong khoa học thực phẩm để tối ưu hóa các quy trình, an toàn thực phẩm và đánh giá dinh dưỡng.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction là một thủ tục tiền phân tích để tách và phân tích trước. Kết hợp với ultrasonication, khai thác điểm đám mây có thể được tăng cường làm cho quá trình hiệu quả hơn, nhanh hơn, và thân thiện với môi trường hơn. Với ultrasonication, khai thác điểm đám mây là một phương pháp hiệu quả hơn đáng kể của chuẩn bị phân tích. Đọc thêm về siêu âm hỗ trợ khai thác điểm đám mây!Gel electrophoresis
Điện di gel là phương pháp chính để chia tách và phân tích các phân tử vĩ mô như DNA, RNA và protein cũng như các mảnh vỡ của chúng, dựa trên kích thước và tính phí của chúng. Nó được sử dụng trong hóa học lâm sàng cho các protein riêng biệt bằng cách sạc và/hoặc kích thước (ief phát sinh, về cơ bản kích thước độc lập) và trong ngành hóa học, phân tử và các proteomic để tách một dân số hỗn hợp của DNA và các mảnh RNA theo chiều dài, để ước tính kích thước của Phân đoạn DNA và RNA hoặc để tách các protein theo phí.
Tế bào văn hóa
Văn hóa tế bào là quá trình phát triển kiểm soát mà các tế bào được trồng trong điều kiện kiểm soát. Điều kiện văn hóa tế bào khác nhau cho mỗi loại tế bào. Nói chung, môi trường của một nền văn hóa tế bào bao gồm một con tàu phù hợp (ví dụ: món Petri) với bề mặt hoặc phương tiện cung cấp các chất dinh dưỡng thiết yếu (axit amin, carbohydrate, vitamin, khoáng chất), yếu tố tăng trưởng, kích thích tố, và khí (CO2O2), và điều chỉnh môi trường vật lý hóa học (đệm pH, áp suất thẩm thấu, nhiệt độ). Hầu hết các tế bào cần một bề mặt hoặc chất nền nhân tạo, trong khi các nền văn hóa tế bào khác có thể được canh tác miễn phí nổi trong môi trường văn hóa (văn hoá đình chỉ, đình chỉ tế bào).
Văn hóa đại chúng của dòng tế bào động vật được sử dụng trong sản xuất công nghiệp của các loại vắc-xin virus và các sản phẩm khác có nguồn gốc biotechnologically. Tế bào gốc của con người được nuôi cấy để mở rộng số lượng tế bào và phân biệt các tế bào thành các loại tế bào Soma khác nhau cho các mục đích transplantation.
Mẫu mô
Thuật ngữ mô mô tả một tế bào trung gian, nơi mà các vật liệu tế bào là trên một mức độ tổ chức giữa các tế bào và một cơ quan hoàn chỉnh. Trong mô, các tế bào tương tự, từ cùng một nguồn gốc mà cùng nhau thực hiện một chức năng cụ thể, được lắp ráp. Bởi các nhóm chức năng của nhiều mô, các cấu trúc phức tạp của các cơ quan được hình thành.
Mô được lấy mẫu cho các nghiên cứu trong sinh học, histology/bệnh, ký sinh trùng, khoa hóa học, Pháp cũng như để trồng và chiết xuất DNA. Nó có thể được phân biệt giữa động vật (phân ngành: mô có vú) và mô thực vật. Mô động vật được nhóm lại thành bốn loại cơ bản của liên kết, cơ bắp, thần kinh, và mô biểu mô. Mô thực vật được chia thành ba hệ thống mô sau đây: lớp biểu bì, mô mặt đất, và mô mạch.
Các mẫu mô có thể được chuẩn bị từ các bộ phận của động vật hoặc thực vật, ví dụ như xương, cơ, lá, vv
Chất lỏng cơ thể
Máu, huyết thanh, huyết tương, Dịch não tủy, nước bọt và dịch khớp là chất dịch cơ thể, cung cấp một nguồn thông tin có liên quan đến chẩn đoán tuyệt vời. Vì vậy, một chuẩn bị tinh vi của các mẫu chất lỏng cơ thể để phân tích là quan trọng. Khó khăn đầu tiên có liên quan đến phạm vi năng động rộng của các thành phần hiện diện trong dịch cơ thể.
Xác định nồng độ protein
Bradford Assay, Lowry khảo nghiệm và axit bicinchoninic (BCA) khảo nghiệm được phổ biến xét nghiệm để xác định nồng độ protein. Albumin huyết thanh bò (BSA) là một trong những tiêu chuẩn protein được sử dụng thường xuyên nhất.
Lysis đệm
Lysis đệm phải được chọn phù hợp với các vật liệu tế bào hoặc mô (mô văn hóa, thực vật, vi khuẩn, nấm, vv), và cho dù các tế bào có trong một cấu trúc và các loại cấu trúc. Một loạt các chất đệm lysis để khai thác các protein, màng, và các bào quan được xây dựng với một hoặc nhiều chất tẩy rửa. Chất tẩy rửa thường được lựa chọn qua các xét nghiệm thử và lỗi – Nếu có – theo một giao thức chiết xuất protein hiện có. Các chất tẩy rửa phải tương thích với các nguồn mô và các protein. Nói chung, các chất tẩy rửa nhẹ nhất mà làm việc cho một mô cụ thể/protein, được chọn để duy trì chức năng tối đa của chiết xuất. Hơn nữa, trong trường hợp khai thác màng và các chất hữu cơ, một chất tẩy nhẹ giữ nguyên vẹn màng. Các chất tẩy rửa thường được sử dụng trong bộ đệm lysis chủ yếu là không hoặc Zwitterion, ví dụ chaps, deoxycholate, Triton™ X-100, NP40, và tween 20.
Ví dụ:, các mô như não, gan, ruột, thận, lá lách, vv có thể được chỉ đơn giản là buffered với RIPA – Tuy nhiên thuốc ức chế protease và DTT (ví dụ như cho điện di gel) nên được bao gồm.
Lysis đệm cho mô cơ xương (băng lạnh): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol bổ sung với protease và cocktail chất ức chế Phosphatase
Bảng các bộ đệm thông thường và phạm vi pH của chúng. Nói chung, các bộ đệm này thường được sử dụng ở nồng độ 20-50 mM.
| Bộ đệm | phạm vi pH |
|---|---|
| Axít citric – Naoh | 2,2 – 6,5 |
| Natri citrat – Axít citric | 3,0 – 6,2 |
| Natri axetat – axit axetic | 3,6 – 5,6 |
| Muối natri axit cacodylic – Hcl | 5,0 – 7,4 |
| Mes – Naoh | 5,6 – 6,8 |
| Natri dihydrogen phosphate – Disodium Hydrogen phosphate | 5,8 – 8,0 |
| Imidazole – Hcl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – Koh | 6,6 – 7,8 |
| Triethanolamine Hiđrôclorua – Naoh | 6,8 – 8,8 |
| Tris – Hcl | 7,0 – 9,0 |
| Các HEPES – Naoh | 7,2 – 8,2 |
| Tricine là – Naoh | 7,6 – 8,6 |
| Natri tetraborat – axit boric | 7,6 – 9,2 |
| Tiếng bicine – Naoh | 7,7 – 8,9 |
| Glycine – Naoh | 8,6 – 10,6 |
Hầu hết các bộ đệm Hiển thị pH-phụ thuộc với nhiệt độ. Điều này đặc biệt đúng đối với các bộ đệm Tris. PKa thay đổi từ 8,06 ở 25 ° c đến 8,85 ở 0 ° c.
(pH và pKa của một bộ đệm: pH các biện pháp nồng độ của các ion hydro trong một dung dịch nước. pKa (= liên tục phân ly axit) là một biện pháp liên quan, nhưng cụ thể hơn, trong đó nó giúp để dự đoán làm thế nào một loại vi khuẩn sẽ hoạt động ở một giá trị pH cụ thể.)
TRIzol
TRIzol là một giải pháp hóa học được sử dụng để chiết xuất RNA/DNA/protein trong quá trình khai thác guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform. Việc sử dụng ultrasonically hỗ trợ TRIzol kết quả khai thác trong DNA cao, RNA, và năng suất protein từ cùng một mẫu và trội do đó phương pháp khai thác khác.
Văn học / Tài liệu tham khảo
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.