Chiết xuất protein từ mô và các hệ nuôi cấy tế bào bằng siêu âm
- Chiết xuất protein là một bước chuẩn bị mẫu thiết yếu trong nghiên cứu hệ protein.
- Protein có thể được chiết xuất từ mô thực vật và động vật, nấm men và vi sinh vật.
- Xử lý siêu âm là phương pháp chiết xuất protein đáng tin cậy, hiệu quả, cho lượng protein thu được cao trong thời gian chiết xuất ngắn.
Chiết xuất protein từ mô và tế bào
Chiết xuất protein từ mô và tế bào nuôi cấy là một bước chuẩn bị mẫu thiết yếu được thực hiện trong nhiều kỹ thuật sinh hóa và phân tích như ELISA, PAGE, Western blot, khối phổ hoặc tinh sạch protein. Phá vỡ tế bào, ly giải và chiết xuất bằng siêu âm là kỹ thuật phi nhiệt có thể kiểm soát chính xác để bảo đảm thu được lượng protein cao.
Chiết xuất protein từ tế bào bằng đầu dò siêu âm UP200St
- Nhanh chóng
- Lượng thu được cao
- Hiệu quả cao
- Kiểm soát chính xác các thông số
- Kết quả có thể tái lập
- Khả năng mở rộng quy mô tuyến tính
Hướng dẫn chung về ly giải và chiết xuất protein bằng siêu âm
- Kiểm soát nhiệt độ: Để bảo đảm thu được lượng protein cao mà không gây biến tính do nhiệt, phải kiểm soát nhiệt độ trong quá trình chiết xuất. Các máy đồng nhất hóa siêu âm tiên tiến của Hielscher – còn được gọi là máy phá vỡ bằng siêu âm hoặc máy xử lý siêu âm – có thể được kiểm soát chính xác. Các máy được trang bị cảm biến nhiệt độ dạng cắm. Trong các tùy chọn cài đặt của máy đồng nhất hóa siêu âm, có thể đặt nhiệt độ tối đa. Khi đạt đến nhiệt độ tối đa này, máy siêu âm tự động dừng cho đến khi mẫu nguội xuống.
- Dung dịch đệm: Việc lựa chọn dung dịch đệm phù hợp và thể tích dung dịch đệm thích hợp thay đổi tùy theo từng loại mô và phải được xác định thông qua thử nghiệm theo phương pháp thử và sai.
- Phân lập / tinh sạch: Dịch ly giải chứa protein có thể chứa dư các phân tử sinh học như DNA hoặc carbohydrate; các thành phần này có thể được loại bỏ bằng cách kết tủa protein (deoxycholate–axit trichloroacetic) hoặc thay dung dịch đệm.
Chittapalo và Noomhorm (2009) đã báo cáo trong nghiên cứu của họ rằng lượng protein thu được tăng lên khi sử dụng siêu âm và quá trình đồng nhất hóa mô và ly giải bằng siêu âm có thể cải thiện đáng kể các quy trình chiết xuất hiện có – mở ra những cơ hội chiết xuất thương mại mới.
CupHorn siêu âm để chuẩn bị đồng thời nhiều mẫu với hiệu quả rất cao trong cùng điều kiện nhằm phân lập protein và phân mảnh DNA.
Chiết xuất protein từ mô động vật
Để chuẩn bị mô nguyên khối (ví dụ: thận, tim, phổi, cơ, v.v.), cần dùng dụng cụ sạch cắt mô thành những mảnh rất nhỏ, tốt nhất là trên đá và càng nhanh càng tốt để ngăn ngừa sự phân hủy bởi protease (ví dụ: dung dịch đệm ly giải như RIPA hoặc dung dịch đệm ly giải nhược trương có chứa hỗn hợp chất ức chế protease và phosphatase). Sau khi cắt, mẫu được nhúng vào nitơ lỏng để đông lạnh nhanh. Mẫu có thể được bảo quản ở -80°C để sử dụng sau hoặc giữ trên đá để đồng nhất hóa ngay. Ngay trước khi chiết xuất bằng siêu âm, nhanh chóng thêm dung dịch đệm ly giải lạnh như đá (với các chất ức chế protease DTT, leupeptin và aprotinin) vào ống mẫu (khuyến nghị khoảng ~600 μL dung dịch đệm cho mỗi ~10 mg mô). Khuyến nghị dùng khoảng 20–60mg mô cho mỗi ống mẫu.
Quá trình đồng nhất hóa, ly giải và chiết xuất bằng siêu âm được thực hiện bằng máy đồng nhất hóa siêu âm như UP100H hoặc UP200Ht, được trang bị đầu phát siêu âm có đầu mút siêu nhỏ. Thời gian xử lý siêu âm là 60–90 giây ở chế độ siêu âm theo chu kỳ gồm 15 giây xử lý siêu âm và 10 giây nghỉ. Mẫu phải được giữ trong đá suốt quá trình.
Sau khi đồng nhất hóa / chiết xuất bằng siêu âm, dịch ly giải được ly tâm ở 27.000g trong khoảng 20 phút. Sau đó, thu dịch nổi để xác định nồng độ protein bằng phép thử protein như phép thử protein BCA của Pierce.
Chiết xuất protein từ huyết thanh
Để thu được hỗn hợp đồng nhất giữa huyết thanh và đệm phosphat, trước tiên mẫu được trộn bằng máy vortex trước khi ly giải tế bào bằng siêu âm. Để ly giải bằng siêu âm, mẫu được xử lý bằng máy đồng nhất siêu âm dùng trong phòng thí nghiệm như UP100H trong 8 chu kỳ ở biên độ 20%, mỗi chu kỳ gồm 5 giây bật và 15 giây tắt. Quá trình chiết xuất protein được thực hiện bằng cách xử lý siêu âm theo chu kỳ (chế độ xung) và đặt mẫu trên đá để tránh mẫu bị quá nhiệt và phân hủy do nhiệt. Vì huyết thanh chứa một lượng lớn protein có khối lượng phân tử cao (như albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobin, immunoglobulin G và immunoglobulin A), gây cản trở việc phân tách các protein có khối lượng phân tử thấp trong quá trình hội tụ đẳng điện (IEF), nên khuyến nghị loại bớt chúng khỏi huyết thanh bằng cột loại bỏ protein.
Chiết xuất protein từ mô thực vật
Mô thực vật tươi, mềm, ví dụ như rêu, v.v., có thể dễ dàng được phá vỡ chỉ bằng cách đặt vật liệu mẫu đã cắt nhỏ vào đệm ly giải để xử lý siêu âm. Các mô thực vật dai, hóa gỗ, như hạt, lá kim của cây linh sam, v.v., nên được nghiền khô. Một số vật liệu thực vật cứng, hóa gỗ phải được đông lạnh và nghiền trong nitơ lỏng trước khi chiết xuất bằng siêu âm. Đối với huyền phù tế bào thực vật nuôi cấy, xử lý siêu âm trong đệm ly giải từ 30 đến 150 giây thường là đủ. Vật liệu dai hơn như hạt bí ngô cần được xử lý siêu âm mạnh hơn như mô tả bên dưới.
Quy trình chiết xuất albumin từ hạt bí ngô bằng siêu âm
Để chiết xuất protein albumin từ bột hạt bí ngô nghiền mịn bằng siêu âm, cho 10 g bột hạt bí ngô đã khử chất béo và 100 mL nước khử ion làm dung môi vào cốc thủy tinh 250mL. Quá trình chiết xuất protein gồm hai bước: Đầu tiên, mẫu được xử lý siêu âm bằng máy siêu âm dạng đầu dò UP400St (400W, 24kHz) được trang bị đầu phát siêu âm S24d7. Cốc thủy tinh được đặt trong bể nước lạnh trong suốt quá trình đồng nhất bằng siêu âm. Cảm biến nhiệt độ dạng cắm và các thiết lập kiểm soát nhiệt độ của máy siêu âm UP400St đảm bảo nhiệt độ mẫu luôn được giữ dưới 30°C. Việc kiểm soát nhiệt độ chính xác trong quá trình xử lý siêu âm giúp tránh biến tính albumin. Ở bước thứ hai, quá trình chiết xuất được thực hiện bằng máy trộn ở tốc độ 200 rpm và nhiệt độ 30°C. Sau đó, cốc được chuyển vào máy lắc ổn nhiệt. Globulin được loại bỏ bằng cách thẩm tích với nước cất. Sau khi loại bỏ globulin, có thể lấy mẫu dịch chiết protein để xác định đặc trưng albumin, rồi dịch chiết được điều chỉnh về pI=3,0 bằng 0,1 M HCl để làm đông tụ albumin. Pha rắn được tách bằng ly tâm ở 5000g, 20°C và hòa tan lại trong nước khử ion. Quá trình đông tụ albumin được thực hiện hai lần để tăng tỷ lệ protein trong sản phẩm albumin cô đặc.
Quá trình chiết xuất protein bằng kiềm có hỗ trợ siêu âm để điều chế sản phẩm protein cô đặc từ cám gạo cho thấy xử lý siêu âm mang lại hiệu suất thu hồi protein cao hơn trong thời gian chiết xuất ngắn hơn đáng kể – so với các phương pháp chiết xuất thông thường.
Quy trình chuẩn bị mẫu để thu enzyme iNOS có hoạt tính
Để thu được enzyme iNOS có đầy đủ hoạt tính (ví dụ để sàng lọc thuốc), khuyến nghị áp dụng quy trình sau: Huyền phù tế bào nên được đặt trên đá và xử lý siêu âm bằng UP100H ở biên độ 10µm theo chế độ chu kỳ gồm 5 giây xử lý siêu âm và 25 giây nghỉ trên đá. Quy trình này nên được lặp lại khoảng 3 lần. Thời gian nghỉ giữa các chu kỳ xử lý siêu âm làm giảm mức tăng nhiệt độ và do đó sẽ giảm nguy cơ biến tính.
Hòa tan protein bằng siêu âm
Xử lý siêu âm có thể đẩy nhanh quá trình hòa tan protein, vốn thường cần vài giờ. Để tránh làm mẫu quá nhiệt và ngăn ngừa sự phân hủy cũng như biến đổi protein trong các dung dịch chứa urê, mỗi đợt phát siêu âm không nên kéo dài quá vài giây.
Máy siêu âm UP200Ht với đầu siêu nhỏ S26d2 2mm để xử lý siêu âm các mẫu nhỏ.
Thiết bị siêu âm để chiết xuất protein
Hielscher Ultrasonics cung cấp nhiều loại máy đồng nhất siêu âm để phá vỡ tế bào, mô, vi khuẩn, vi sinh vật, nấm men và bào tử.
Các máy siêu âm phòng thí nghiệm của Hielscher có công suất mạnh và dễ vận hành. Được chế tạo để hoạt động 24/7, các thiết bị này có thiết kế bền chắc và hiệu quả, phù hợp sử dụng trong phòng thí nghiệm và trên bàn thí nghiệm. Với tất cả các thiết bị, năng lượng đầu ra và biên độ đều có thể được kiểm soát chính xác. Danh mục phụ kiện phong phú mang đến thêm nhiều tùy chọn cấu hình. Các máy siêu âm kỹ thuật số như VialTweeter, UP200Ht, UP200St và UP400St được tích hợp chức năng kiểm soát nhiệt độ và thẻ SD để tự động ghi dữ liệu.
Để xử lý đồng thời nhiều mẫu bằng siêu âm gián tiếp và không gây nhiễm chéo, chúng tôi cung cấp VialTweeter hoặc CupHorn siêu âm.
Bảng dưới đây cung cấp thông tin tổng quan về các máy siêu âm của chúng tôi dùng để chuẩn bị mẫu, phá vỡ tế bào và chiết xuất. Nhấp vào loại thiết bị để biết thêm thông tin về từng máy đồng nhất siêu âm. Đội ngũ kỹ thuật được đào tạo bài bản và có nhiều năm kinh nghiệm của chúng tôi sẽ sẵn lòng giúp bạn lựa chọn máy siêu âm phù hợp nhất cho công việc chuẩn bị mẫu!
| Thể tích mẻ | Lưu lượng | Thiết bị được khuyến nghị |
|---|---|---|
| tối đa 10 lọ hoặc ống | không áp dụng | VialTweeter |
| đĩa nhiều giếng / đĩa vi chuẩn độ | không áp dụng | UIP400MTP |
| nhiều ống / bình chứa | không áp dụng | CupHorn |
| 1 đến 500mL | 10 đến 200mL/min | UP100H |
| 10 đến 1000mL | 20 đến 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 đến 2000mL | 20 đến 400mL/min | UP400St |
Tùy theo ứng dụng, vật liệu và thể tích mẫu của bạn, chúng tôi sẽ đề xuất cấu hình phù hợp nhất cho công việc chuẩn bị mẫu. Hãy liên hệ với chúng tôi ngay hôm nay!
Liên hệ với chúng tôi! / Đặt câu hỏi cho chúng tôi!
Các máy siêu âm kỹ thuật số của Hielscher có chức năng điều khiển từ xa qua trình duyệt và tự động ghi dữ liệu vào thẻ SD tích hợp.
VialTweeter để xử lý bằng siêu âm gián tiếp.
Những điều cần biết
Hệ protein học
Hệ protein học là lĩnh vực nghiên cứu về protein và hệ protein. Protein thực hiện rất nhiều chức năng thiết yếu trong cơ thể sinh vật. Hệ protein là toàn bộ tập hợp các protein được biểu hiện bởi một bộ gen, tế bào, mô hoặc cơ thể sinh vật tại một thời điểm nhất định. Hệ protein thay đổi theo thời gian và theo các nhu cầu cụ thể hoặc các tác động gây stress mà tế bào hoặc cơ thể sinh vật trải qua. Cụ thể hơn, đó là tập hợp các protein được biểu hiện trong một loại tế bào hoặc cơ thể sinh vật nhất định, tại một thời điểm nhất định, trong những điều kiện xác định. Thuật ngữ này được ghép từ các từ chỉ protein và bộ gen. Hệ protein học là ngành nghiên cứu về hệ protein.
Protein
Protein là những phân tử sinh học lớn, được gọi là đại phân tử – được cấu tạo từ một hoặc nhiều chuỗi dài các gốc axit amin. Protein có mặt trong mọi sinh vật có nguồn gốc thực vật và động vật, đồng thời giữ vai trò thiết yếu đối với hầu hết các chức năng sinh học. Vì protein chứa nhiều thông tin sinh học nên chúng được chiết xuất phục vụ mục đích phân tích, ví dụ như nghiên cứu hệ protein học. Các chức năng quan trọng nhất của protein bao gồm xúc tác các phản ứng trao đổi chất, sao chép DNA, đáp ứng với các kích thích và vận chuyển các phân tử từ vị trí này sang vị trí khác. Các protein khác nhau chủ yếu ở trình tự axit amin, được quy định bởi trình tự nucleotide của các gen mã hóa chúng và thường khiến protein gấp cuộn thành một cấu trúc ba chiều đặc hiệu quyết định hoạt tính của protein đó. Bên cạnh peptide, protein là một trong những thành phần chủ chốt của thực phẩm. Do đó, hệ protein học là một công cụ mạnh mẽ trong khoa học thực phẩm để tối ưu hóa các quy trình, an toàn thực phẩm và đánh giá dinh dưỡng.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction là một quy trình trước phân tích nhằm tách và làm giàu sơ bộ các chất phân tích. Khi kết hợp với xử lý siêu âm, quá trình chiết điểm đục có thể được tăng cường, giúp quy trình hiệu quả hơn, nhanh hơn và thân thiện hơn với môi trường. Với siêu âm, chiết điểm đục là một phương pháp chuẩn bị chất phân tích hiệu quả hơn đáng kể. Tìm hiểu thêm về chiết điểm đục có hỗ trợ siêu âm!
Điện di gel
Điện di gel là phương pháp chủ yếu để phân tách và phân tích các đại phân tử như DNA, RNA và protein cũng như các đoạn của chúng, dựa trên kích thước và điện tích. Phương pháp này được sử dụng trong hóa học lâm sàng để phân tách protein theo điện tích và/hoặc kích thước (IEF trên agarose, về cơ bản không phụ thuộc vào kích thước), và trong hóa sinh, sinh học phân tử và nghiên cứu hệ protein để phân tách hỗn hợp các đoạn DNA và RNA theo chiều dài, ước tính kích thước các đoạn DNA và RNA hoặc phân tách protein theo điện tích.
Nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào là quá trình tăng trưởng có kiểm soát, trong đó tế bào được nuôi trong các điều kiện được kiểm soát. Điều kiện nuôi cấy tế bào khác nhau tùy theo từng loại tế bào. Nhìn chung, môi trường nuôi cấy tế bào bao gồm một dụng cụ chứa phù hợp (ví dụ: đĩa Petri) cùng với giá thể hoặc môi trường nuôi cấy cung cấp các chất dinh dưỡng thiết yếu (axit amin, carbohydrate, vitamin, khoáng chất), các yếu tố tăng trưởng, hormone và khí (CO2, O2), đồng thời điều hòa môi trường lý hóa (đệm pH, áp suất thẩm thấu, nhiệt độ). Hầu hết tế bào cần một bề mặt hoặc giá thể nhân tạo, trong khi các tế bào nuôi cấy khác có thể được nuôi ở trạng thái lơ lửng tự do trong môi trường nuôi cấy (nuôi cấy huyền phù, huyền phù tế bào).
Việc nuôi cấy quy mô lớn các dòng tế bào động vật được ứng dụng trong sản xuất công nghiệp vắc-xin vi-rút và các sản phẩm khác có nguồn gốc từ công nghệ sinh học. Tế bào gốc người được nuôi cấy để tăng số lượng tế bào và biệt hóa thành nhiều loại tế bào soma khác nhau nhằm mục đích cấy ghép.
Mẫu mô
Thuật ngữ mô mô tả một cấp trung gian trong tổ chức tế bào, trong đó vật chất tế bào nằm ở cấp độ tổ chức giữa tế bào và một cơ quan hoàn chỉnh. Trong mô, các tế bào tương tự nhau, có cùng nguồn gốc và cùng thực hiện một chức năng cụ thể, tập hợp lại với nhau. Sự kết hợp nhiều mô theo chức năng tạo thành các cấu trúc phức tạp của cơ quan.
Mô được lấy mẫu để nghiên cứu trong sinh học, mô học/mô bệnh học, ký sinh trùng học, hóa sinh, hóa mô miễn dịch cũng như phục vụ nuôi cấy và chiết xuất DNA. Có thể phân biệt mô động vật (phân nhóm: mô động vật có vú) và mô thực vật. Mô động vật được chia thành bốn loại cơ bản: mô liên kết, mô cơ, mô thần kinh và mô biểu mô. Mô thực vật được chia thành ba hệ mô sau: hệ mô biểu bì, hệ mô cơ bản và hệ mô dẫn.
Mẫu mô có thể được chuẩn bị từ các bộ phận của động vật hoặc thực vật, ví dụ: xương, cơ, lá, v.v.
Dịch cơ thể
Máu, huyết thanh, huyết tương, dịch não tủy, nước bọt và dịch khớp là những dịch cơ thể cung cấp nguồn thông tin phong phú có giá trị chẩn đoán. Vì vậy, việc chuẩn bị kỹ lưỡng các mẫu dịch cơ thể để phân tích là rất quan trọng. Khó khăn đầu tiên liên quan đến dải biến thiên nồng độ rộng của các thành phần có trong dịch cơ thể.
Xác định nồng độ protein
Phép thử Bradford, phép thử Lowry và phép thử axit bicinchoninic (BCA) là các phép thử phổ biến để xác định nồng độ protein. Albumin huyết thanh bò (BSA) là một trong những chất chuẩn protein được sử dụng thường xuyên nhất.
Dung dịch đệm ly giải
Dung dịch đệm ly giải phải được lựa chọn phù hợp với vật liệu tế bào hoặc mô (mô nuôi cấy, thực vật, vi khuẩn, nấm, v.v.), đồng thời xét đến việc các tế bào có nằm trong một cấu trúc hay không và loại cấu trúc đó. Nhiều loại dung dịch đệm ly giải dùng để chiết xuất protein, màng và bào quan được pha chế với một hoặc nhiều chất tẩy rửa. Chất tẩy rửa thường được lựa chọn qua các thử nghiệm thử và sai hoặc – nếu có – theo một quy trình chiết xuất protein hiện có. Chất tẩy rửa phải tương thích với nguồn mô và các protein. Nhìn chung, chất tẩy rửa dịu nhẹ nhất có hiệu quả đối với một mô / protein cụ thể được lựa chọn nhằm duy trì tối đa chức năng của dịch chiết. Ngoài ra, khi chiết xuất màng và bào quan, chất tẩy rửa dịu nhẹ giúp giữ nguyên vẹn màng. Các chất tẩy rửa thường dùng trong dung dịch đệm ly giải chủ yếu là loại không ion hoặc ion lưỡng cực, ví dụ CHAPS, deoxycholate, Triton™ X-100, NP40 và Tween 20.
Ví dụ, các mô như não, gan, ruột, thận, lách, v.v. có thể được xử lý đơn giản bằng dung dịch đệm RIPA – tuy nhiên cần bổ sung các chất ức chế protease và DTT (ví dụ để điện di gel).
Dung dịch đệm ly giải cho mô cơ xương (lạnh như nước đá): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, bổ sung hỗn hợp chất ức chế protease và phosphatase
Bảng các dung dịch đệm thông dụng và khoảng pH của chúng. Nhìn chung, các dung dịch đệm này thường được sử dụng ở nồng độ 20–50 mM.
| Dung dịch đệm | Khoảng pH |
|---|---|
| Axit citric – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Natri citrat – axit citric | 3,0 – 6,2 |
| Natri acetat – axit acetic | 3,6 – 5,6 |
| Muối natri của axit cacodylic – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Natri dihydrogen phosphat – dinatri hydrogen phosphat | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Triethanolamin hydrochlorid – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricin – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Natri tetraborat – axit boric | 7,6 – 9,2 |
| Bicin – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glycin – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Phần lớn các dung dịch đệm có pH phụ thuộc vào nhiệt độ. Điều này đặc biệt đúng với các dung dịch đệm Tris. pKa thay đổi từ 8,06 ở 25°C đến 8,85 ở 0°C.
(pH và pKa của dung dịch đệm: pH đo nồng độ ion hydro trong dung dịch nước. pKa (= hằng số phân ly axit) là một đại lượng có liên quan nhưng cụ thể hơn, vì nó giúp dự đoán cách một phân tử sẽ hoạt động tại một giá trị pH cụ thể.)
TRIzol
TRIzol là một dung dịch hóa chất được sử dụng để chiết xuất RNA/DNA/protein trong quá trình chiết xuất bằng guanidinium thiocyanat–phenol–chloroform. Việc sử dụng phương pháp chiết xuất TRIzol có hỗ trợ siêu âm mang lại hiệu suất thu hồi DNA, RNA và protein cao từ cùng một mẫu, qua đó vượt trội hơn các phương pháp chiết xuất khác.
Tài liệu/Tài liệu tham khảo
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.