• Blot phía tây là một thủ tục phân tích để phát hiện các protein cụ thể trong một mẫu mô homogenate hoặc chiết xuất tế bào.
• Để chạy một blot phương Tây hoặc để đo lường hoạt động của enzyme, nhiều xét nghiệm yêu cầu quyền truy cập vào các vật liệu (ví dụ như protein, DNA, các mảnh tế bào con) bị kẹt trong tế bào.
• Sonication là một phương pháp đáng tin cậy và dễ xử lý để phá vỡ tế bào bị kiểm soát và lysis.

Sự gián đoạn tế bào siêu âm

Chiết xuất protein từ các mô và các tế bào nuôi cấy là bước đầu tiên cho nhiều kỹ thuật sinh học và phân tích (trang, blotting Tây, ELISA, Mass spectrometry, vv) hoặc lọc protein. Để có được một năng suất protein cao, vật liệu tế bào và mô phải có hiệu quả bị gián đoạn/lysed. Cho dù tế bào thực vật hoặc mô động vật, sonication là phương pháp để chuẩn bị lysate tế bào của bạn dễ dàng và nhanh chóng.

Ưu điểm của Sonication

• Nhanh & Hiệu quả
• hoạt động dễ dàng
• năng suất protein cao
• Tái sanh
• kiểm soát chính xác
• Mở rộng

Immunoprecipitation Protocol đối với Tây Immunoblotting

A. thuốc thử

Để chuẩn bị các giải pháp, sử dụng nước tinh khiết như Milli-Q.

• 1X muối phosphat (PBS)
• 1X Cell lysis đệm: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
  Quan trọng: thêm 1 mM PMSF ngay trước khi sử dụng.
• 15 μL protein A + 15 μL protein G là đủ cho IP, nhưng nó có thể phụ thuộc vào kháng thể chính và khối lượng mẫu của bạn. Bạn cũng có thể sử dụng pre-hỗn hợp protein A/G phát sinh (ví dụ như protein A cho thỏ IgG kéo xuống và protein G cho chuột IgG kéo xuống)
• 3X bộ đệm mẫu SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 ở 25 ° c), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromophenol Blue

B. chuẩn bị tế bào Lysates

• Thu hoạch các tế bào. Để thu hoạch các tế bào trong điều kiện nondenaturing, loại bỏ phương tiện truyền thông và rửa sạch các tế bào một lần với PBS lạnh.
• Hủy bỏ PBS và thêm 0,5 ml băng-lạnh 1X tế bào đệm cho mỗi tấm (10 cm) và ấp trứng các tấm trên băng trong 5 phút.
• Cạo các tế bào ra khỏi các tấm và chuyển sang các ống vi ly tâm. Giữ trên băng.
• Sonicate hai lần trong 10 giây trong băng-lạnh immunoprecipitation đệm (bộ đệm IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 và hỗn hợp chất ức chế protease). Đối với sonication, VialTweeter hoặc một ultrasonicator thăm dò như UP100H hoặc là UP200Ht phù hợp nhất.
• Máy ly tâm lysates ở 15.000 g trong 10 phút ở 4 ° c.
• Chuyển supernatant đến một ống mới. (Nếu cần thiết, lysate có thể được lưu trữ ở-80 ° c.)
• Thêm kháng thể chính vào phần phía trên. Phần nổi lên với các kháng thể chính được ấp cho 1 h ở 4 ° c dưới kích động ánh sáng. Kháng thể chính thường được thêm vào trong một lượng 10x tập trung hơn được sử dụng cho blotting phương Tây. (Bạn có thể bắt đầu với 1μg mỗi 100 μL.)
• Các supernatant sau đó được ủ thêm với hỗn hợp của số tiền bằng nhau của protein A-agnảy (Invitrogen) và protein G agnảy cho 1 h khác.
• Rửa các viên nén phát sinh ba lần với bộ đệm IP. Sau đó, trích xuất các protein bị ràng buộc với bộ đệm tải SDS-PAGE bằng cách sưởi ấm ở 95 ° c trong 5 phút.

C. Immunoprecipitation

• Lấy 200 μL tế bào lysate và thêm kháng thể chính. Ấp trứng với rocking nhẹ nhàng qua đêm ở 4 ° c.
• Thêm protein A hoặc G phát sinh hạt (20 μL 50% hạt bùn). Tủ ấm với rocking nhẹ nhàng trong 1 – 3 giờ ở 4 ° c.
• Máy ly tâm trong 30 giây ở 4 ° c. Rửa pellet năm lần với 500 μL của 1X tế bào lysis đệm. Giữ băng trong khi rửa.
• Resuspend các viên pellet với 20 μL 3X SDS mẫu đệm. Vortex, sau đó máy ly tâm trong 30 giây.
• Đun nóng mẫu đến 95 – 100 ° c trong 2 – 5 phút và máy ly tâm trong 1 phút ở 14.000 X g.
• Nạp các mẫu (15 – 30 μL) trên SDS-PAGE gel (12 – 15%).
• Phân tích mẫu của blotting phương Tây.

Phân tích Western blot với ultrasonicator UP50H

Sau giao thức được sử dụng trong nghiên cứu của Kriebisch et al. (2011):
Tổng protein được phân lập từ các tế bào MC3T3-E1 điều trị bằng 1, 25 (OH)₂D₃ (10^{− 8} M) hoặc xe. Các tế bào được lysed với một bộ đệm có chứa 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher khoa học); 0,1% natri dodecyl sulfate (SDS) (Fisher khoa học); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) và 0,5% natri deoxycholate (Merck). Các lysate tế bào được sonicated cho 2 × 10 s ở chu kỳ 1 và biên độ 80 với Bộ vi xử lý siêu âm UP50H (Hielscher, công nghệ siêu âm, Teltow, Đức). Sau đó các vật liệu được ly tâm trong 10 phút ở 14.000 rpm và supernatant được sử dụng cho blotting phương Tây. Hai mươi lăm μg protein đã được đun sôi trong bộ đệm mẫu và chất khử (Invitrogen) và sau đó tách ra bởi SDS-PAGE bằng cách sử dụng 4 – 12% gel polyacrylamide (Invitrogen) và chuyển sang màng nitrocellulose (chăm sóc sức khỏe GE). Màng đã bị chặn trong 1 h với TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) chứa 1% casein (Sigma-Aldrich) và 1% Tris (1 M). Sau khi chặn, màng được ấp với kích động nhẹ qua đêm ở 4 ° c với các kháng thể chính (thỏ chống con người 1/500 CBS, phát triển trong phòng thí nghiệm của prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, Hoa Kỳ). Ủ với một peroxidase cải ngựa (hpr)-kháng thể thứ cấp liên hợp (dako) được thực hiện cho 1 h ở nhiệt độ phòng. Tất cả các blot được phát triển bởi Enhanced chemiluminescence (Perkin Elmer).

Văn học/tài liệu tham khảo