Ly giải bằng siêu âm cho Western blot

• Western blot là một quy trình phân tích để phát hiện các protein đặc hiệu trong mẫu mô đồng nhất hoặc dịch chiết tế bào.
• Để thực hiện Western blot hoặc đo hoạt tính enzyme, nhiều phép thử đòi hỏi phải tiếp cận các thành phần (ví dụ: protein, DNA, các mảnh dưới tế bào) bị giữ bên trong tế bào.
• Xử lý siêu âm là phương pháp đáng tin cậy và dễ thao tác để phá vỡ và ly giải tế bào có kiểm soát.

Phá vỡ tế bào bằng siêu âm

Chiết xuất protein từ mô và tế bào nuôi cấy là bước đầu tiên trong nhiều kỹ thuật sinh học, hóa sinh và phân tích (PAGE, Western blot, ELISA, khối phổ, v.v.) hoặc trong quá trình tinh sạch protein. Để thu được lượng protein cao, vật liệu tế bào và mô phải được phá vỡ/ ly giải hiệu quả. Dù là tế bào thực vật hay mô động vật, xử lý siêu âm là phương pháp giúp bạn chuẩn bị dịch ly giải tế bào dễ dàng và nhanh chóng.

Ưu điểm của xử lý siêu âm

• nhanh & hiệu quả
• vận hành dễ dàng
• lượng protein thu được cao
• có khả năng tái lập/ lặp lại
• được kiểm soát chính xác
• có thể mở rộng quy mô

Quy trình kết tủa miễn dịch cho kỹ thuật thấm miễn dịch Western

A. Thuốc thử

Để pha các dung dịch, sử dụng nước tinh khiết như Milli-Q.

• Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) 1X
• Đệm ly giải tế bào 1X: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natri pyrophosphat, 1 mM β-glycerophosphat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
  Quan trọng: Thêm 1 mM PMSF ngay trước khi sử dụng.
• 15 μl Protein A+15 μl Protein G là đủ cho IP, nhưng lượng này có thể phụ thuộc vào kháng thể sơ cấp và thể tích mẫu của bạn. Bạn cũng có thể sử dụng agarose gắn protein A/ G trộn sẵn (ví dụ: Protein A để kéo xuống IgG thỏ và Protein G để kéo xuống IgG chuột)
• Đệm mẫu SDS 3X: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 ở 25°C), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v xanh bromophenol

B. Chuẩn bị dịch ly giải tế bào

• Thu hoạch tế bào. Để thu hoạch tế bào trong điều kiện không gây biến tính, loại bỏ môi trường và rửa tế bào một lần bằng PBS lạnh như đá.
• Loại bỏ PBS và thêm 0,5 ml đệm ly giải tế bào 1X lạnh như đá vào mỗi đĩa (10 cm), rồi ủ các đĩa trên đá trong 5 phút.
• Cạo tế bào khỏi đĩa và chuyển vào các ống ly tâm vi lượng. Giữ trên đá.
• Xử lý siêu âm hai lần, mỗi lần 10 giây trong đệm kết tủa miễn dịch lạnh như đá (đệm IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 và hỗn hợp chất ức chế protease). Để xử lý siêu âm, VialTweeter hoặc máy siêu âm đầu dò như UP100H hoặc UP200Ht là phù hợp nhất.
• Ly tâm dịch ly giải ở 15.000 g trong 10 phút tại 4°C.
• Chuyển dịch nổi sang một ống mới. (Nếu cần, có thể bảo quản dịch ly giải ở –80°C.)
• Thêm kháng thể sơ cấp vào dịch nổi. Ủ dịch nổi có kháng thể sơ cấp trong 1 h ở 4°C và khuấy nhẹ. Kháng thể sơ cấp thường được thêm ở nồng độ cao gấp 10x so với nồng độ dùng cho Western blot. (Bạn có thể bắt đầu với 1μg cho mỗi 100μL.)
• Sau đó tiếp tục ủ dịch nổi với hỗn hợp gồm các lượng bằng nhau của Protein A-agarose (Invitrogen) và agarose gắn Protein G trong thêm 1 h.
• Rửa cặn agarose ba lần bằng đệm IP. Sau đó, chiết các protein đã liên kết bằng đệm nạp mẫu SDS-PAGE bằng cách gia nhiệt ở 95°C trong 5 phút.

C. Kết tủa miễn dịch

• Lấy 200 μl dịch ly giải tế bào và thêm kháng thể sơ cấp. Ủ qua đêm ở 4°C với chuyển động lắc bập bênh nhẹ.
• Thêm hạt agarose gắn protein A hoặc G (20 μl huyền phù hạt 50%). Ủ trong 1–3 giờ ở 4°C với chuyển động lắc bập bênh nhẹ.
• Ly tâm vi lượng trong 30 giây ở 4°C. Rửa cặn năm lần bằng 500 µl đệm ly giải tế bào 1X. Giữ trên đá trong các lần rửa.
• Tái huyền phù cặn bằng 20 μl đệm mẫu SDS 3X. Trộn bằng máy vortex, sau đó ly tâm vi lượng trong 30 giây.
• Gia nhiệt mẫu đến 95–100°C trong 2–5 phút và ly tâm vi lượng trong 1 phút ở 14.000 X g.
• Nạp mẫu (15–30 μl) lên gel SDS-PAGE (12–15%).
• Phân tích mẫu bằng Western blot.

Phân tích Western blot bằng máy siêu âm UP50H

Quy trình sau đây sử dụng máy siêu âm đầu dò UP50H đã được áp dụng trong nghiên cứu của Kriebisch và cộng sự (2011):
Protein tổng số được phân lập từ tế bào MC3T3-E1 được xử lý bằng 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) hoặc dung môi mang. Tế bào được ly giải bằng đệm chứa 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natri dodecyl sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) và 0,5% natri deoxycholat (Merck). Dịch ly giải tế bào được xử lý siêu âm trong 2 × 10 s ở chu kỳ 1 và biên độ 80 bằng bộ xử lý siêu âm UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Đức). Sau đó, vật liệu được ly tâm trong 10 min ở 14.000 rpm và dịch nổi được sử dụng cho Western blot. Hai mươi lăm μg protein được đun sôi trong đệm mẫu và chất khử (Invitrogen), sau đó được phân tách bằng SDS-PAGE sử dụng gel polyacrylamide 4–12% (Invitrogen) và chuyển lên màng nitrocellulose (GE health care). Màng được chặn trong 1 h bằng TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) chứa 1% casein (Sigma-Aldrich) và 1% Tris (1 M). Sau khi chặn, màng được ủ qua đêm ở 4°C với kháng thể sơ cấp và khuấy nhẹ (kháng thể thỏ kháng CBS người 1/500, được phát triển tại phòng thí nghiệm của GS. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, Hoa Kỳ). Việc ủ với kháng thể thứ cấp liên hợp peroxidase cải ngựa (HPR) (Dako) được thực hiện trong 1 h ở nhiệt độ phòng. Tất cả các màng blot được hiện tín hiệu bằng phương pháp hóa phát quang tăng cường (Perkin Elmer).
 

Nhấp vào đây để đọc thêm về các thực hành tốt nhất trong ly giải và chiết xuất tế bào bằng siêu âm, chuẩn bị dịch ly giải và các khuyến nghị cải tiến quy trình!
 
Bảng dưới đây cho biết công suất xử lý gần đúng của các máy siêu âm quy mô phòng thí nghiệm của chúng tôi:

Tài liệu / Tài liệu tham khảo

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.