Siêu âm ly giải cho Western Blotting

• Western blot là một quy trình phân tích để phát hiện các protein cụ thể trong một mẫu mô homogenate hoặc chiết xuất tế bào.
• Để chạy Western blot hoặc để đo hoạt động của enzyme, nhiều xét nghiệm yêu cầu truy cập vào các vật liệu (ví dụ protein, DNA, các mảnh dưới tế bào) bị mắc kẹt trong tế bào.
• Sonication là một phương pháp đáng tin cậy và dễ xử lý để kiểm soát sự gián đoạn và ly giải tế bào.

Phá vỡ tế bào siêu âm

Chiết xuất protein từ các mô và tế bào nuôi cấy là bước đầu tiên cho nhiều kỹ thuật sinh học, sinh hóa và phân tích (PAGE, Western blotting, ELISA, mass spectrometry, v.v.) hoặc tinh chế protein. Để có được năng suất protein cao, vật liệu tế bào và mô phải được phá vỡ / lysed hiệu quả. Cho dù tế bào thực vật hoặc mô động vật, sonication là phương pháp để chuẩn bị lysate tế bào của bạn dễ dàng và nhanh chóng.

Ưu điểm của Sonication

• nhanh & Hiệu quả
• Hoạt động dễ dàng
• năng suất protein cao
• có thể tái tạo / lặp lại
• được kiểm soát chính xác
• Mở rộng

Giao thức kết tủa miễn dịch cho phương Tây Immunoblotting

A. Thuốc thử

Để chuẩn bị các giải pháp, sử dụng nước tinh khiết như Milli-Q.

• 1X nước muối đệm phốt phát (PBS)
• Dung dịch đệm ly giải tế bào 1X: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Natri pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
  Quan trọng: Thêm 1 mM PMSF ngay trước khi sử dụng.
• 15 μl Protein A + 15 μl Protein G là đủ cho IP, nhưng nó có thể phụ thuộc vào kháng thể chính và thể tích mẫu của bạn. Bạn cũng có thể sử dụng protein A / G agarose trộn sẵn (ví dụ: Protein A cho IgG thỏ kéo xuống và Protein G cho IgG chuột kéo xuống)
• Dung dịch đệm mẫu SDS 3X: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 ở 25°C), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromophenol xanh

B. Chuẩn bị lysates tế bào

• Thu hoạch các tế bào. Để thu hoạch các tế bào trong điều kiện không biến tính, hãy loại bỏ phương tiện và rửa sạch tế bào một lần bằng PBS lạnh như băng.
• Loại bỏ PBS và thêm 0,5 ml dung dịch đệm ly giải tế bào 1X lạnh vào mỗi đĩa (10 cm) và ủ các đĩa trên đá trong 5 phút.
• Cạo các tế bào ra khỏi các tấm và chuyển sang các ống vi ly tâm. Giữ trên băng.
• Sonicate hai lần trong 10 giây trong bộ đệm kết tủa miễn dịch lạnh (bộ đệm IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 và hỗn hợp chất ức chế protease). Đối với sonication, các LọTweeter hoặc một ultrasonicator thăm dò như UP100H or UP200Ht là phù hợp nhất.
• Máy ly tâm lysat ở 15.000 g trong 10 phút ở 4°C.
• Chuyển supernatant sang một ống mới. (Nếu cần thiết, lysate có thể được lưu trữ ở -80 ° C.)
• Thêm kháng thể chính vào supernatant. Supernatant với kháng thể chính được ủ trong 1 giờ ở 4 ° C dưới sự khuấy trộn nhẹ. Kháng thể sơ cấp thường được bổ sung với số lượng đậm đặc hơn 10 lần so với được sử dụng để làm mờ phương Tây. (Bạn có thể bắt đầu với 1μg trên 100μL.)
• Supernatant sau đó được ủ thêm với hỗn hợp một lượng bằng nhau của Protein A-agarose (Invitrogen) và Protein G agarose trong 1 giờ nữa.
• Rửa viên agarose ba lần bằng bộ đệm IP. Sau đó, chiết xuất các protein liên kết với bộ đệm tải SDS-PAGE bằng cách đun nóng ở 95 ° C trong 5 phút.

C. Kết tủa miễn dịch

• Lấy 200 μl tế bào lysate và thêm kháng thể chính. Ủ với lắc lư nhẹ nhàng qua đêm ở 4°C.
• Thêm hạt protein A hoặc G agarose (20 μl bùn hạt 50%). Ủ với lắc lư nhẹ nhàng trong 1–3 giờ ở 4°C.
• Microcentrifuge trong 30 giây ở 4°C. Rửa viên năm lần với 500 μl dung dịch đệm ly giải tế bào 1X. Giữ đá trong khi rửa.
• Treo lại viên nén bằng dung dịch đệm mẫu SDS 20 μl 3X. Xoáy, sau đó vi ly tâm trong 30 giây.
• Làm nóng mẫu đến 95–100°C trong 2–5 phút và máy vi ly tâm trong 1 phút ở 14.000 X g.
• Nạp mẫu (15–30 μl) vào gel SDS-PAGE (12–15%).
• Phân tích mẫu bằng phương Tây blotting.

Phân tích Western Blot với Sonicator UP50H

Theo giao thức sử dụng sonicator kiểu thăm dò UP50H đã được sử dụng trong nghiên cứu của Kriebisch et al. (2011):
Tổng protein được phân lập từ các tế bào MC3T3-E1 được điều trị bằng 1,25 (OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) hoặc phương tiện. Các tế bào được phân giải với dung dịch đệm chứa 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Khoa học Fisher); 0,1% natri dodecyl sulfate (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) và 0,5% natri deoxycholate (Merck). Lysate tế bào được sonicated trong 2 × 10 s ở chu kỳ 1 và biên độ 80 với Bộ xử lý siêu âm UP50H (Hielscher, Công nghệ siêu âm, Teltow, Đức). Sau đó, vật liệu được ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 14.000 vòng / phút và supernatant được sử dụng để làm mờ phương Tây. Hai mươi lăm μg protein được đun sôi trong chất đệm mẫu và chất khử (Invitrogen) và sau đó được phân tách bằng SDS-PAGE bằng cách sử dụng gel polyacrylamide 4-12% (Invitrogen) và chuyển sang màng nitrocellulose (chăm sóc sức khỏe GE). Màng bị chặn trong 1 giờ với TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) chứa 1% casein (Sigma-Aldrich) và 1% Tris (1 M). Sau khi chặn, màng được ủ với kích động nhẹ qua đêm ở 4 ° C với kháng thể chính (CBS 1/500 chống lại con người, được phát triển trong phòng thí nghiệm của Giáo sư R. Banerjee, Ann Arbor, MI, Hoa Kỳ). Ủ với kháng thể thứ cấp liên hợp peroxidase cải ngựa (HPR) (Dako) được thực hiện trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Tất cả các blots được phát triển bởi sự phát quang hóa học tăng cường (Perkin Elmer).
 

Bấm vào đây để đọc thêm về các phương pháp hay nhất để ly giải và khai thác tế bào siêu âm, chuẩn bị lysate và các khuyến nghị để cải tiến quy trình!
 
Bảng dưới đây cung cấp cho bạn một dấu hiệu về khả năng xử lý gần đúng của ultrasonicators kích thước phòng thí nghiệm của chúng tôi:

Văn học / Tài liệu tham khảo