Chuẩn bị mẫu hỗ trợ bằng bộ lọc siêu âm (FASP): Nâng cao quy trình làm việc trong lĩnh vực proteomics nhờ công nghệ siêu âm tiên tiến

Phương pháp chuẩn bị mẫu hỗ trợ bằng bộ lọc siêu âm (FASP) đang nổi lên như một phương pháp hiệu quả cao và có tính lặp lại trong lĩnh vực proteomics hiện đại. Bằng cách tích hợp quá trình siêu âm có kiểm soát vào các quy trình FASP đã được thiết lập, các nhà nghiên cứu có thể cải thiện đáng kể hiệu quả chiết xuất protein, hiệu suất phân giải và chất lượng dữ liệu tổng thể. Với nhu cầu ngày càng tăng về việc chuẩn bị mẫu có năng suất cao và tính lặp lại, các thiết bị siêu âm tập trung như máy siêu âm microplate UIP400MTP đang ngày càng trở nên quan trọng cả về mặt khoa học lẫn thực tiễn.

Bối cảnh khoa học: Tại sao FASP lại quan trọng trong lĩnh vực proteomics

Phương pháp chuẩn bị mẫu có sự hỗ trợ của bộ lọc (FASP) đã trở thành tiêu chuẩn vàng trong lĩnh vực proteomics theo hướng từ dưới lên nhờ khả năng loại bỏ chất tẩy rửa, muối và các tạp chất khác, đồng thời tạo điều kiện cho quá trình phân giải enzym diễn ra hiệu quả. Tuy nhiên, các quy trình FASP truyền thống thường gặp phải những hạn chế liên quan đến việc phân giải tế bào không hoàn toàn, quá trình phân giải không đồng đều và sự biến động của mẫu – đặc biệt là khi nghiên cứu các tế bào hoặc mô sinh học phức tạp hoặc có khả năng phục hồi cao.
Đây chính là lúc năng lượng siêu âm tập trung (sonication) mang lại lợi thế quyết định. Bằng cách tạo ra lực cắt cơ học và hiện tượng xâm thực, sonication giúp tối ưu hóa nhiều bước quan trọng trong quy trình FASP mà không làm ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của protein.

Những tác động tích cực của quá trình siêu âm trong phương pháp FASP siêu âm

Quá trình siêu âm tạo ra hiện tượng xâm thực âm thanh có kiểm soát – Sự hình thành và sụp đổ của các bong bóng vi mô – điều này tạo ra các lực cắt cục bộ và hiện tượng dòng chảy vi mô.
Sonication giúp tăng cường cả hai bước alkyl hóa và phân giải trong phương pháp FASP siêu âm bằng cách cải thiện quá trình truyền khối lượng và đẩy nhanh tốc độ phản ứng. Việc ứng dụng năng lượng siêu âm tạo ra hiện tượng xâm thực, dẫn đến sự hình thành các dòng chảy vi mô cục bộ và lực cắt tạm thời, từ đó thúc đẩy quá trình trộn nhanh chóng và sự thâm nhập hiệu quả của các chất phản ứng vào ma trận protein hoặc môi trường màng lọc. Trong quá trình alkyl hóa, điều này dẫn đến sự biến đổi đồng đều và nhanh hơn của các dư lượng cysteine bởi iodoacetamide. Trong bước tiêu hóa, siêu âm làm tăng khả năng tiếp cận các vị trí phân cắt proteolytic và cải thiện tương tác enzyme–chất nền, từ đó đẩy nhanh hoạt động của trypsin và tăng cường hiệu quả tiêu hóa. Nhìn chung, xử lý bằng siêu âm giúp giảm thời gian xử lý trong khi vẫn duy trì hoặc cải thiện tính hoàn chỉnh và khả năng tái tạo của phản ứng.

Trong quá trình chuẩn bị mẫu proteomics, phương pháp FASP kết hợp siêu âm có nghĩa là:

• Phá vỡ tế bào và chiết xuất protein hiệu quả hơn, ngay cả đối với các mô cứng hoặc mẫu vi sinh vật
• Tăng cường khả năng hòa tan của protein
• Tăng cường khả năng tiếp cận enzyme trong quá trình tiêu hóa
• Giảm thời gian xử lý và tăng độ lặp lại

Khác với các phương pháp phân giải cơ học hoặc hóa học truyền thống, công nghệ xử lý bằng sóng siêu âm có khả năng kiểm soát cao và dễ dàng mở rộng quy mô, khiến nó đặc biệt phù hợp với các quy trình làm việc tiêu chuẩn hóa trong lĩnh vực proteomics.

Ưu điểm của phương pháp FASP siêu âm so với các phương pháp truyền thống

Việc tích hợp kỹ thuật siêu âm vào các quy trình FASP mang lại những lợi ích rõ rệt, có tác động trực tiếp đến kết quả phân tích khối phổ ở các bước tiếp theo.
Công nghệ FASP siêu âm cho phép thu hồi protein hiệu quả hơn, đặc biệt là từ các mẫu khó xử lý như mô sợi hoặc màng sinh học. Sự phân bố năng lượng đồng đều đảm bảo quá trình xử lý nhất quán giữa các mẫu lặp lại, từ đó giảm thiểu độ biến động – một yêu cầu thiết yếu đối với proteomics định lượng.
Ngoài ra, quá trình siêu âm còn thúc đẩy quá trình tiêu hóa bằng cách cải thiện sự tương tác giữa enzyme và chất nền. Điều này thường giúp rút ngắn thời gian tiêu hóa và tăng năng suất peptide, đồng thời vẫn duy trì độ bao phủ trình tự.
Từ góc độ quy trình làm việc, các hệ thống siêu âm giúp giảm thiểu sự can thiệp thủ công và loại bỏ nhu cầu sử dụng các phương pháp xử lý hóa học mạnh, từ đó bảo toàn tính toàn vẹn của mẫu và đơn giản hóa việc tiêu chuẩn hóa quy trình.

Biểu đồ Venn cho thấy số lượng protein được xác định bằng phương pháp Ultrasonic FASP cao hơn so với phương pháp Over-Night FASP
Hình ảnh và nghiên cứu: ©Carvalho et al., 2020

Quy trình: Phương pháp FASP siêu âm công suất cao với thiết bị UIP400MTP

Đối với các phòng thí nghiệm xử lý các nhóm mẫu quy mô lớn, máy siêu âm microplate UIP400MTP cho phép thực hiện quá trình siêu âm đồng thời trên các đĩa đa giếng tiêu chuẩn (ví dụ: đĩa 96 giếng), giúp tăng đáng kể năng suất và độ lặp lại.
Trong phương pháp này, các mẫu (thường là 50–200 µL mỗi giếng) được chuẩn bị trực tiếp trong các đĩa vi giếng tương thích với quá trình siêu lọc hoặc các bước xử lý tiếp theo. Các dung dịch ly giải tương tự như những dung dịch được sử dụng trong các quy trình FASP tiêu chuẩn.

Máy UIP400MTP phân phối năng lượng siêu âm đồng đều đến tất cả các giếng. Quá trình siêu âm thường được thực hiện ở biên độ 60–80% trong 2–4 phút, tùy thuộc vào loại mẫu. Theo dõi nhiệt độ bằng cảm biến nhiệt độ có thể tháo lắp. Sử dụng chế độ siêu âm xung và có thể kết hợp với máy làm lạnh phòng thí nghiệm.

Mẫu giao thức:

1. Đối với bước alkyl hóa, các mẫu được xử lý bằng sóng siêu âm bằng máy siêu âm microplate (UIP400MTP) ở biên độ 40% trong 7 chu kỳ (30 giây bật, 15 giây tắt; tổng thời gian xử lý bằng sóng siêu âm: 5 phút 45 giây).
2. Sau khi xử lý bằng sóng siêu âm, dung dịch iodoacetamide (IAA) được loại bỏ bằng cách ly tâm. Trước khi tiến hành phân giải bằng trypsin, các mẫu phải được rửa để loại bỏ urê dư, một chất gây rối cấu trúc mạnh có tác dụng ức chế hoạt tính enzym. Do đó, các mẫu được rửa hai lần với 200 μL dung dịch ammonium bicarbonate (AmBic) nồng độ 25 mM.
3. Tiếp theo, thêm 100 μL dung dịch trypsin (tỷ lệ enzyme/protein là 1:30) được pha trong dung dịch amoni bicacbonat 12,5 mM. Quá trình phân giải protein sau đó được thực hiện bằng thiết bị UIP400MTP trong cùng điều kiện siêu âm (độ biên độ 40%, 7 chu kỳ, 30 giây bật / 15 giây tắt; tổng thời gian: 5 phút 45 giây).
4. Sau khi xử lý bằng sóng siêu âm, các mẫu được chuyển sang đĩa lọc hoặc được xử lý bằng hệ thống FASP dạng đĩa. Các bước khử và alkyl hóa được thực hiện ngay trên đĩa, giúp duy trì quy trình làm việc hiệu quả.
5. Quá trình phân giải bằng trypsin được thực hiện trong điều kiện được kiểm soát (ví dụ: 37°C, 4–16 giờ), có thể kết hợp với kích thích siêu âm ngắn để tăng cường hoạt tính enzym và nâng cao hiệu suất thu được các peptit.
6. Các peptit được thu hồi bằng phương pháp ly tâm và đã sẵn sàng để phân tích bằng LC-MS/MS.

Ưu điểm chính của hệ thống này nằm ở khả năng tạo ra các điều kiện xử lý giống hệt nhau cho tất cả các giếng, giúp giảm thiểu ảnh hưởng của lô và cho phép thực hiện các so sánh định lượng đáng tin cậy trong các nghiên cứu proteomics quy mô lớn.

Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng Sản xuất tại Đức

Hielscher ultrasonicators nổi tiếng với chất lượng cao nhất và tiêu chuẩn thiết kế của họ. Mạnh mẽ và hoạt động dễ dàng cho phép tích hợp trơn tru của ultrasonicators của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi dễ dàng được xử lý bởi Hielscher ultrasonicators.

Hielscher Ultrasonics là một công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt nhấn mạnh vào ultrasonicators hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, Hielscher ultrasonicators là CE tuân thủ và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.

Văn học / Tài liệu tham khảo