Chuẩn bị mẫu có hỗ trợ bộ lọc (FASP) bằng siêu âm: Cải thiện quy trình nghiên cứu hệ protein bằng công nghệ siêu âm tiên tiến

Chuẩn bị mẫu có hỗ trợ bộ lọc (FASP) bằng siêu âm đang nổi lên như một phương pháp có hiệu quả cao và khả năng tái lập tốt trong nghiên cứu hệ protein hiện đại. Bằng cách tích hợp xử lý siêu âm có kiểm soát vào các quy trình FASP đã được thiết lập, các nhà nghiên cứu có thể cải thiện đáng kể khả năng chiết xuất protein, hiệu suất phân giải và chất lượng dữ liệu tổng thể. Với nhu cầu ngày càng tăng về chuẩn bị mẫu có năng suất cao và khả năng tái lập tốt, các thiết bị siêu âm tập trung như máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP đang ngày càng có ý nghĩa về mặt khoa học và thực tiễn.

Bối cảnh khoa học: Vì sao FASP quan trọng trong nghiên cứu hệ protein

Chuẩn bị mẫu có hỗ trợ bộ lọc (FASP) đã trở thành một tiêu chuẩn vàng trong nghiên cứu hệ protein theo phương pháp bottom-up nhờ khả năng loại bỏ chất tẩy rửa, muối và các tạp chất khác, đồng thời cho phép phân giải bằng enzyme một cách hiệu quả. Tuy nhiên, các quy trình FASP truyền thống thường gặp những hạn chế liên quan đến việc ly giải không hoàn toàn, phân giải không đồng nhất và sự biến thiên giữa các mẫu – đặc biệt khi xử lý các tế bào hoặc mô sinh học phức tạp hay khó phá vỡ.
Đây là lúc năng lượng siêu âm tập trung (xử lý siêu âm) mang lại lợi thế quyết định. Bằng cách tạo ra lực cắt cơ học và hiện tượng xâm thực, xử lý siêu âm cải thiện nhiều bước then chốt trong quy trình FASP mà không làm ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của protein.

Những tác động tích cực của xử lý siêu âm trong FASP bằng siêu âm

Xử lý siêu âm tạo ra hiện tượng xâm thực âm có kiểm soát – sự hình thành và sụp đổ của các bọt khí vi mô – từ đó tạo ra lực cắt và dòng chảy vi mô cục bộ.
Xử lý siêu âm cải thiện cả bước alkyl hóa lẫn bước phân giải trong FASP bằng siêu âm thông qua việc tăng cường truyền khối và đẩy nhanh động học phản ứng. Việc áp dụng năng lượng siêu âm tạo ra hiện tượng xâm thực, dẫn đến các dòng chảy vi mô cục bộ và lực cắt nhất thời, thúc đẩy quá trình trộn nhanh và giúp thuốc thử thâm nhập hiệu quả vào nền protein hoặc môi trường bộ lọc. Trong quá trình alkyl hóa, điều này giúp iodoacetamide biến đổi các gốc cysteine đồng đều hơn và nhanh hơn. Ở bước phân giải, xử lý siêu âm làm tăng khả năng tiếp cận các vị trí cắt phân giải protein và cải thiện tương tác enzyme–cơ chất, qua đó đẩy nhanh hoạt động của trypsin và nâng cao hiệu suất phân giải. Nhìn chung, xử lý siêu âm rút ngắn thời gian xử lý trong khi duy trì hoặc cải thiện mức độ hoàn tất phản ứng và khả năng tái lập.

Trong chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu hệ protein, FASP bằng siêu âm mang lại:

• Phá vỡ tế bào và chiết xuất protein hiệu quả hơn, ngay cả với các mô khó phá vỡ hoặc mẫu vi sinh vật
• Tăng cường khả năng hòa tan protein
• Cải thiện khả năng tiếp cận của enzyme trong quá trình phân giải
• Rút ngắn thời gian xử lý và tăng khả năng tái lập

Khác với các phương pháp ly giải cơ học hoặc hóa học thông thường, xử lý siêu âm có khả năng kiểm soát cao và có thể mở rộng quy mô, khiến phương pháp này đặc biệt phù hợp với các quy trình nghiên cứu hệ protein được chuẩn hóa.

Ưu điểm của FASP bằng siêu âm so với các phương pháp thông thường

Việc tích hợp xử lý siêu âm vào các quy trình FASP mang lại những lợi ích có thể đo lường được, tác động trực tiếp đến kết quả phân tích khối phổ ở các bước tiếp theo.
FASP bằng siêu âm cho phép thu hồi protein đầy đủ hơn, đặc biệt từ các mẫu khó xử lý như mô sợi hoặc màng sinh học. Sự phân bố năng lượng đồng đều bảo đảm việc xử lý nhất quán giữa các mẫu lặp, giảm sự biến thiên – một yêu cầu thiết yếu đối với nghiên cứu hệ protein định lượng.
Ngoài ra, xử lý siêu âm đẩy nhanh động học phân giải bằng cách cải thiện tương tác enzyme–cơ chất. Điều này thường giúp rút ngắn thời gian phân giải và tăng lượng peptide thu được, đồng thời duy trì độ bao phủ trình tự.
Xét về quy trình làm việc, các hệ thống siêu âm giảm sự can thiệp thủ công và loại bỏ nhu cầu xử lý bằng hóa chất mạnh, bảo toàn tính toàn vẹn của mẫu và đơn giản hóa việc chuẩn hóa quy trình.

Biểu đồ Venn cho thấy số lượng protein được định danh tăng lên khi sử dụng FASP bằng siêu âm so với FASP qua đêm
Hình ảnh và nghiên cứu: ©Carvalho và cộng sự, 2020

Quy trình: FASP bằng siêu âm với năng suất xử lý mẫu cao sử dụng UIP400MTP

Đối với các phòng thí nghiệm xử lý các tập hợp mẫu lớn, máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP cho phép xử lý siêu âm đồng thời các đĩa nhiều giếng tiêu chuẩn (ví dụ: đĩa 96 giếng), giúp tăng đáng kể năng suất xử lý mẫu và khả năng tái lập.
Ở định dạng này, mẫu (thường là 50–200 µL mỗi giếng) được chuẩn bị trực tiếp trong các đĩa vi giếng tương thích với quá trình siêu lọc hoặc các bước xử lý tiếp theo. Dung dịch đệm ly giải tương tự như các dung dịch được sử dụng trong quy trình FASP tiêu chuẩn.

UIP400MTP cung cấp năng lượng siêu âm đồng đều cho tất cả các giếng. Quá trình xử lý siêu âm thường được thực hiện ở biên độ 60–80% trong 2–4 phút, tùy thuộc vào loại mẫu. Theo dõi nhiệt độ bằng cảm biến nhiệt độ dạng cắm. Sử dụng siêu âm theo xung và có thể sử dụng thêm thiết bị làm lạnh phòng thí nghiệm.

Quy trình minh họa:

1. Ở bước alkyl hóa, mẫu được xử lý siêu âm bằng máy siêu âm đĩa vi giếng (UIP400MTP) ở biên độ 40% trong 7 chu kỳ (30 s BẬT, 15 s TẮT; tổng thời gian xử lý siêu âm: 5 min 45 s).
2. Sau khi xử lý siêu âm, dung dịch iodoacetamide (IAA) được loại bỏ bằng ly tâm. Trước khi phân giải bằng trypsin, mẫu phải được rửa để loại bỏ urê còn dư, một tác nhân gây hỗn loạn cấu trúc mạnh có tác dụng ức chế hoạt tính enzyme. Vì vậy, mẫu được rửa hai lần bằng 200 μL dung dịch amoni bicarbonat (AmBic) 25 mM.
3. Tiếp theo, thêm 100 μL dung dịch trypsin (tỷ lệ enzyme so với protein là 1:30) được pha trong dung dịch amoni bicarbonat 12,5 mM. Sau đó, quá trình phân giải protein được thực hiện bằng UIP400MTP trong cùng điều kiện xử lý siêu âm (biên độ 40%, 7 chu kỳ, 30 s BẬT / 15 s TẮT; tổng thời gian: 5 min 45 s).
4. Sau khi xử lý siêu âm, mẫu được chuyển sang đĩa lọc hoặc được xử lý bằng các hệ thống FASP sử dụng đĩa. Các bước khử và alkyl hóa được thực hiện ngay trong đĩa, duy trì quy trình làm việc tinh gọn.
5. Quá trình phân giải bằng trypsin được thực hiện trong các điều kiện được kiểm soát (ví dụ: 37°C, 4–16 giờ), với tùy chọn kích thích siêu âm trong thời gian ngắn để tăng tốc hoạt động của enzyme và cải thiện hiệu suất thu peptide.
6. Peptide được thu hồi bằng ly tâm và sẵn sàng cho phân tích LC-MS/MS.

Ưu điểm chính của hệ thống này nằm ở khả năng cung cấp các điều kiện xử lý giống hệt nhau cho tất cả các giếng, giảm thiểu hiệu ứng lô và cho phép thực hiện các phép so sánh định lượng vững chắc trong các nghiên cứu hệ protein quy mô lớn.

Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng sản xuất tại Đức

Các máy siêu âm Hielscher nổi tiếng với các tiêu chuẩn cao nhất về chất lượng và thiết kế. Độ bền và khả năng vận hành dễ dàng cho phép tích hợp thuận lợi các máy siêu âm của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Các máy siêu âm Hielscher dễ dàng đáp ứng những điều kiện khắc nghiệt và môi trường có yêu cầu cao.

Hielscher Ultrasonics là công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt chú trọng đến các máy siêu âm hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến nhất và dễ sử dụng. Tất nhiên, các máy siêu âm Hielscher tuân thủ CE và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.

Tài liệu / Tài liệu tham khảo

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).