Phương pháp chiết xuất protein hỗ trợ bằng sóng siêu âm cho phân tích phosphoproteomics

Trong lĩnh vực khoa học đời sống hiện đại, phosphoproteomics đã trở thành một công nghệ nền tảng để giải mã các con đường truyền tín hiệu tế bào và tìm hiểu cơ chế bệnh tật ở cấp độ hệ thống. Do quá trình phosphoryl hóa chi phối các chức năng sinh học quan trọng – từ hoạt tính enzym đến tương tác protein–protein – Việc đo lường chính xác các quá trình này là vô cùng quan trọng đối với cả nghiên cứu cơ bản lẫn y học chuyển giao. Những tiến bộ gần đây trong lĩnh vực phổ khối đã cho phép xác định hàng chục nghìn sự kiện phosphoryl hóa chỉ trong một thí nghiệm duy nhất, nhấn mạnh sự cần thiết của các quy trình chuẩn bị mẫu đáng tin cậy, có khả năng mở rộng và có thể tái hiện.
Một trong những bước tiến có tác động lớn nhất trong lĩnh vực này là việc áp dụng phương pháp chiết xuất protein hỗ trợ bằng sóng siêu âm, giúp cải thiện đáng kể chất lượng mẫu, năng suất và độ lặp lại. Các công nghệ siêu âm như VialTweeter và UIP400MTP hiện đang định hình lại cách các phòng thí nghiệm xử lý các nhóm mẫu lớn, đặc biệt là trong lĩnh vực phosphoproteomics năng suất cao.

Tầm quan trọng về mặt khoa học của việc chuẩn bị mẫu hiệu quả trong phosphoproteomics

Phosphoryl hóa protein là một quá trình biến đổi sau dịch mã có tính động cao và có thể đảo ngược, ảnh hưởng đến phần lớn các protein trong tế bào người. Quá trình này điều chỉnh cấu trúc, vị trí và mạng lưới tương tác của protein; sự rối loạn điều hòa của nó được cho là có liên quan đến các bệnh như ung thư và thoái hóa thần kinh.
Tuy nhiên, phân tích phosphoproteomic đặt ra những thách thức kỹ thuật đặc thù. Các peptit phosphoryl hóa thường có nồng độ thấp và đòi hỏi quá trình làm giàu cẩn thận cùng với quy trình chuẩn bị mẫu ở giai đoạn đầu có hiệu quả cao. Bất kỳ sự thiếu hiệu quả nào trong quá trình chiết xuất hoặc phân giải protein đều có thể dẫn đến mất tín hiệu, độ tái hiện kém và phạm vi bao phủ các vị trí phosphoryl hóa không đầy đủ.
Đây chính là lúc quá trình siêu âm trở nên vô cùng quan trọng.

Tại sao công nghệ siêu âm đang cách mạng hóa quá trình chiết xuất protein

Phương pháp siêu âm sử dụng sóng siêu âm cường độ cao để phá vỡ cơ học các tế bào và mô, giúp giải phóng protein một cách hiệu quả từ tế bào, mô, dịch sinh học và các túi ngoại bào. So với các kỹ thuật phân giải truyền thống, phương pháp siêu âm mang lại một số ưu điểm nổi bật:

• Thứ nhất, phương pháp này đảm bảo quá trình phá vỡ tế bào diễn ra nhanh chóng và đồng đều, điều này đặc biệt quan trọng để duy trì các trạng thái phosphoryl hóa tạm thời. Trong lĩnh vực phosphoproteomics, ngay cả những sự chậm trễ nhỏ nhất hoặc quá trình phân giải tế bào không hoàn toàn cũng có thể làm thay đổi các đặc điểm tín hiệu, do đó việc chiết xuất nhanh chóng và có thể lặp lại là điều thiết yếu.
• Thứ hai, quá trình siêu âm giúp tăng năng suất protein và khả năng hòa tan, đặc biệt đối với các mẫu khó phân giải như mô dày đặc hoặc tế bào giàu màng. Điều này trực tiếp góp phần cải thiện quá trình thủy phân ở các bước tiếp theo và tăng hiệu suất thu hồi phosphopeptide.
• Thứ ba, công nghệ xử lý bằng sóng siêu âm vốn dĩ có khả năng mở rộng quy mô. Các thiết bị như VialTweeter cho phép xử lý đồng thời nhiều ống kín bằng sóng siêu âm, đảm bảo các điều kiện xử lý giống hệt nhau cho tất cả các mẫu. Điều này giúp loại bỏ sự chênh lệch do thao tác thủ công gây ra.
• Đối với các yêu cầu về năng suất cao hơn nữa, UIP400MTP đánh dấu một bước nhảy vọt về công nghệ. Thiết bị này cho phép xử lý siêu âm trực tiếp toàn bộ các tấm vi giếng hoặc giá đựng ống, bao gồm cả các ống của bộ lấy mẫu tự động, nhờ đó trở thành giải pháp lý tưởng để xử lý hàng trăm mẫu song song. Khả năng này đặc biệt hữu ích trong lĩnh vực sinh học hệ thống và nghiên cứu lâm sàng, nơi việc xử lý các nhóm mẫu quy mô lớn là điều phổ biến.

Xử lý bằng sóng siêu âm công suất cao: Tập trung vào VialTweeter và UIP400MTP

Việc tích hợp các thiết bị siêu âm tiên tiến vào quy trình phân tích phosphoproteome không chỉ đơn thuần là để tạo sự thuận tiện – Đó là một cải tiến về phương pháp.
VialTweeter được thiết kế để xử lý đồng bộ bằng sóng siêu âm cho nhiều lọ kín, giúp giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm chéo đồng thời đảm bảo tính lặp lại. Thiết bị này đặc biệt phù hợp cho các ứng dụng có công suất trung bình và quy trình làm việc tiêu chuẩn hóa.
 

Ngược lại, UIP400MTP được tối ưu hóa cho các môi trường có công suất xử lý cao, cho phép:

• Siêu âm đồng đều trên toàn bộ các đĩa vi giếng tiêu chuẩn, ví dụ như đĩa 96 giếng hoặc 384 giếng
• Xử lý trực tiếp giá đỡ ống và lọ của bộ lấy mẫu tự động
• Giảm đáng kể thời gian thực hành
• Nâng cao khả năng tái tạo trên các tập dữ liệu quy mô lớn

Khả năng mở rộng này hoàn toàn phù hợp với các phương pháp phân tích phosphoproteomics hiện đại, trong đó các quy trình làm việc thường xuyên xử lý hàng chục đến hàng trăm mẫu song song.

Quy trình chung để chuẩn bị mẫu phosphoproteomic với sự hỗ trợ của phương pháp siêu âm

Một quy trình phân tích phosphoproteome hiệu quả kết hợp các bước chiết xuất protein, phân giải enzym và làm giàu phosphopeptide. Phác thảo sau đây phản ánh các phương pháp hay nhất đã được công nhận, được điều chỉnh để phù hợp với quy trình chuẩn bị dựa trên phương pháp siêu âm:

1. Làm nguội và thu thập mẫu nhanh chóng
   Các tế bào hoặc mô bị làm nguội nhanh chóng – thường bằng phương pháp đông lạnh nhanh – để duy trì trạng thái phosphoryl hóa. Bước này rất quan trọng do tính chất thoáng qua của các phản ứng phosphoryl hóa.
2. Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm và chiết xuất protein
   Các mẫu được rã đông và xử lý bằng sóng siêu âm, thường theo các chu kỳ ngắn. Năng lượng siêu âm phá vỡ màng tế bào và giải phóng protein một cách hiệu quả. Trong các quy trình đã được xác nhận, việc xử lý bằng sóng siêu âm được thực hiện qua nhiều chu kỳ để đảm bảo tế bào bị phá vỡ hoàn toàn.
   Ví dụ: Sau khi rã đông mẫu trên đá, quá trình phá vỡ tế bào được thực hiện bằng phương pháp siêu âm, ví dụ như sử dụng thiết bị Vialtweeter trong 2 chu kỳ, mỗi chu kỳ kéo dài 1 phút.
3. Làm trong và định lượng protein
   Sau khi phân giải, các mẫu được ly tâm để loại bỏ các mảnh vụn. Phần dịch nổi chứa các protein hòa tan được thu thập và định lượng để đảm bảo lượng đầu vào đồng nhất giữa các mẫu.
4. Phản ứng khử và alkyl hóa
   Các liên kết disulfide được khử (ví dụ: bằng DTT) và alkyl hóa (ví dụ: bằng IAA) để ổn định protein và nâng cao hiệu quả phân giải.
5. tiêu hóa phân giải protein
   Các protein được phân giải bằng enzym, thường là bằng trypsin, tạo ra các peptit phù hợp cho phân tích bằng phổ khối. Tìm hiểu thêm về quá trình phân giải protein được thúc đẩy bằng sóng siêu âm!
6. Tách chiết và khử muối peptide
   Các peptit được tinh chế bằng các phương pháp dựa trên C18 để loại bỏ các tạp chất có thể gây cản trở cho phân tích LC-MS.
7. Tăng cường phosphopeptide
   Do hàm lượng peptit phosphoryl hóa thấp, các kỹ thuật làm giàu như phương pháp Fe-NTA hoặc phương pháp liên kết với TiO₂ được áp dụng để tách chọn lọc các peptit phosphoryl hóa.
8. Phân tích LC-MS/MS và xử lý dữ liệu
   Các mẫu đã được làm giàu được phân tích bằng phương pháp quang phổ khối độ phân giải cao, thường sử dụng phương pháp thu thập dữ liệu độc lập (DIA) để nâng cao độ chính xác trong định lượng và độ lặp lại.

Đáng chú ý, các quy trình làm việc quy mô lớn có thể được điều chỉnh để phù hợp với định dạng đĩa 96 giếng, cho phép xử lý song song lên đến hàng trăm mẫu – một phương pháp hoàn toàn tương thích với quá trình siêu âm dựa trên UIP400MTP.
 

Quy trình tối ưu hóa để thực hiện quá trình làm ngưng phản ứng phosphoproteome nhanh chóng, làm giàu phosphopeptide và Phos-DIA-MS.
Phương pháp và hình ảnh: ©Die et al. 2023

Nâng cao tính tái hiện và chất lượng dữ liệu thông qua phương pháp siêu âm

Một trong những thách thức chính trong lĩnh vực phosphoproteomics là đảm bảo tính nhất quán trong việc định lượng trên các tập dữ liệu quy mô lớn. Sự biến động phát sinh trong quá trình chuẩn bị mẫu có thể làm lu mờ những khác biệt có ý nghĩa sinh học.

Công nghệ siêu âm giải quyết vấn đề này bằng cách cung cấp:

1. Đầu vào năng lượng được chuẩn hóa giữa các mẫu
2. Giảm thiểu sự biến động do yếu tố con người
3. Nâng cao độ lặp lại trong quá trình chiết xuất và phân giải protein

Khi kết hợp với các nền tảng có năng suất cao như UIP400MTP, các phòng thí nghiệm có thể đạt được mức độ nhất quán cần thiết cho các nghiên cứu sinh học hệ thống và việc phát hiện các dấu ấn sinh học lâm sàng.

Tương lai của phosphoproteomics: Tự động hóa và khả năng mở rộng

Khi lĩnh vực phosphoproteomics tiếp tục mở rộng sang các ứng dụng quy mô lớn và lâm sàng, nhu cầu về tự động hóa và năng suất xử lý sẽ ngày càng gia tăng. Quy trình chuẩn bị mẫu dựa trên siêu âm, đặc biệt khi được tích hợp với các hệ thống tương thích với đĩa vi giếng, là một công nghệ then chốt hỗ trợ cho sự phát triển này.
Bằng cách kết hợp công nghệ phân giải bằng sóng siêu âm hiệu quả, xử lý song song và khả năng tương thích với các quy trình làm việc tự động, các thiết bị như VialTweeter và UIP400MTP đang thiết lập những tiêu chuẩn mới trong lĩnh vực chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu proteomics.
Tìm hiểu thêm về việc tích hợp UIP400MTP vào quy trình làm việc tự động trong phòng thí nghiệm!

Hãy tận dụng phương pháp chuẩn bị mẫu hỗ trợ bằng sóng siêu âm trong lĩnh vực phosphoproteomics!

Phương pháp chiết xuất protein hỗ trợ bằng sóng siêu âm đã trở thành một thành phần quan trọng trong lĩnh vực phosphoproteomics hiện đại, mang lại hiệu quả, khả năng mở rộng và độ lặp lại vượt trội. Trước nhu cầu ngày càng tăng về việc phân tích các hệ thống sinh học phức tạp trên các nhóm mẫu quy mô lớn, công nghệ sóng siêu âm không chỉ mang lại nhiều lợi thế – chúng là điều không thể thiếu.
Bằng cách tạo điều kiện cho các quy trình làm việc có năng suất cao và được tiêu chuẩn hóa, các giải pháp như VialTweeter và UIP400MTP đang thúc đẩy những phát hiện mới trong lĩnh vực tín hiệu tế bào, cơ chế bệnh lý và y học chính xác.

Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng Sản xuất tại Đức

Hielscher ultrasonicators nổi tiếng với chất lượng cao nhất và tiêu chuẩn thiết kế của họ. Mạnh mẽ và hoạt động dễ dàng cho phép tích hợp trơn tru của ultrasonicators của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi dễ dàng được xử lý bởi Hielscher ultrasonicators.

Hielscher Ultrasonics là một công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt nhấn mạnh vào ultrasonicators hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, Hielscher ultrasonicators là CE tuân thủ và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.

Các mô hình máy siêu âm đa mẫu Hielscher UIP400MTP cho microplate, VialTweeter và CupHorn: chuẩn bị mẫu tốc độ cao và năng suất cao.