Chiết xuất protein có hỗ trợ siêu âm cho nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa
Trong khoa học sự sống hiện đại, nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa đã trở thành một công nghệ nền tảng để giải mã các con đường truyền tín hiệu tế bào và tìm hiểu cơ chế bệnh ở cấp độ hệ thống. Do quá trình phosphoryl hóa chi phối các chức năng sinh học thiết yếu – từ hoạt tính enzyme đến tương tác protein–protein – việc đo lường chính xác quá trình này là điều cần thiết cho cả nghiên cứu cơ bản và y học chuyển giao. Những tiến bộ gần đây trong khối phổ đã cho phép xác định hàng chục nghìn sự kiện phosphoryl hóa trong một thí nghiệm duy nhất, cho thấy nhu cầu về các quy trình chuẩn bị mẫu ổn định, có khả năng mở rộng quy mô và có độ tái lập cao.
Một trong những bước phát triển có tác động lớn nhất trong lĩnh vực này là việc áp dụng chiết xuất protein có hỗ trợ siêu âm, giúp cải thiện đáng kể chất lượng mẫu, năng suất xử lý mẫu và độ tái lập. Các công nghệ siêu âm như VialTweeter và UIP400MTP hiện đang định hình lại cách các phòng thí nghiệm xử lý những tập hợp mẫu lớn, đặc biệt trong nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa với năng suất xử lý mẫu cao.
Tầm quan trọng về mặt khoa học của việc chuẩn bị mẫu hiệu quả trong nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa
Phosphoryl hóa protein là một biến đổi sau dịch mã có tính động cao và có thể đảo ngược, ảnh hưởng đến phần lớn protein trong tế bào người. Quá trình này điều hòa cấu trúc, sự định vị và các mạng lưới tương tác của protein; sự rối loạn điều hòa quá trình này có liên quan đến các bệnh như ung thư và thoái hóa thần kinh.
Tuy nhiên, phân tích hệ protein phosphoryl hóa đặt ra những thách thức kỹ thuật đặc thù. Các peptide được phosphoryl hóa thường có hàm lượng thấp và đòi hỏi quá trình làm giàu cẩn thận cùng bước chuẩn bị mẫu ban đầu có hiệu quả cao. Bất kỳ sự kém hiệu quả nào trong quá trình chiết xuất hoặc phân giải protein đều có thể dẫn đến mất tín hiệu, độ tái lập kém và độ bao phủ không đầy đủ các vị trí phosphoryl hóa.
Đây chính là lúc xử lý siêu âm trở nên thiết yếu.
Xử lý siêu âm 40 lọ đựng mẫu cho bộ lấy mẫu tự động bằng UIP400MTP để chiết xuất protein
Vì sao xử lý siêu âm đang làm thay đổi phương pháp chiết xuất protein
Xử lý siêu âm sử dụng sóng siêu âm cường độ cao để phá vỡ tế bào và mô bằng tác động cơ học, giúp giải phóng protein hiệu quả từ tế bào, mô, dịch sinh học và túi ngoại bào. So với các kỹ thuật ly giải thông thường, xử lý siêu âm mang lại một số ưu điểm rõ rệt:
- Thứ nhất, phương pháp này bảo đảm phá vỡ tế bào nhanh chóng và đồng đều, điều này đặc biệt quan trọng để bảo toàn các trạng thái phosphoryl hóa thoáng qua. Trong nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa, ngay cả sự chậm trễ nhỏ hoặc ly giải không hoàn toàn cũng có thể làm thay đổi các đặc trưng truyền tín hiệu, khiến việc chiết xuất nhanh và có độ tái lập cao trở nên thiết yếu.
- Thứ hai, xử lý siêu âm cải thiện lượng protein thu được và khả năng hòa tan protein, đặc biệt đối với các mẫu khó ly giải như mô đặc hoặc tế bào có nhiều màng. Điều này trực tiếp giúp cải thiện quá trình phân giải ở các bước sau và khả năng thu hồi phosphopeptide.
- Thứ ba, xử lý siêu âm vốn có khả năng mở rộng quy mô. Các thiết bị như VialTweeter cho phép xử lý siêu âm đồng thời nhiều ống kín, bảo đảm điều kiện xử lý giống hệt nhau giữa các mẫu. Điều này loại bỏ sự biến thiên do thao tác thủ công gây ra.
- Đối với nhu cầu về năng suất xử lý mẫu cao hơn nữa, UIP400MTP là một bước tiến lớn về công nghệ. Thiết bị cho phép xử lý siêu âm trực tiếp toàn bộ đĩa vi giếng hoặc giá ống nghiệm, bao gồm cả lọ đựng mẫu cho bộ lấy mẫu tự động, khiến thiết bị trở thành lựa chọn lý tưởng để xử lý song song hàng trăm mẫu. Khả năng này đặc biệt có giá trị trong sinh học hệ thống và nghiên cứu lâm sàng, nơi các tập hợp mẫu lớn là tiêu chuẩn.
VialTweeter: Xử lý siêu âm đồng thời nhiều mẫu với các thông số quá trình được kiểm soát
Xử lý siêu âm với năng suất xử lý mẫu cao: Tiêu điểm VialTweeter và UIP400MTP
Việc tích hợp các thiết bị siêu âm tiên tiến vào quy trình nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa không chỉ mang lại sự thuận tiện – đó còn là một cải tiến về phương pháp.
VialTweeter được thiết kế để xử lý siêu âm đồng bộ nhiều lọ kín, giảm thiểu nhiễm chéo đồng thời bảo đảm độ tái lập. Thiết bị đặc biệt phù hợp với các ứng dụng có năng suất xử lý mẫu trung bình và các quy trình được chuẩn hóa.
Ngược lại, UIP400MTP được tối ưu hóa cho môi trường có năng suất xử lý mẫu cao, cho phép:
- Xử lý siêu âm đồng đều trên toàn bộ các đĩa vi giếng tiêu chuẩn, ví dụ đĩa 96 giếng hoặc 384 giếng
- Xử lý trực tiếp giá ống nghiệm và lọ dùng cho bộ lấy mẫu tự động
- Giảm đáng kể thời gian thao tác trực tiếp
- Tăng khả năng tái lập trên các tập dữ liệu lớn
Khả năng mở rộng quy mô này hoàn toàn phù hợp với các phương pháp nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa hiện đại, trong đó các quy trình thường xuyên xử lý song song từ hàng chục đến hàng trăm mẫu.
Quy trình tổng quát để chuẩn bị mẫu nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa có hỗ trợ siêu âm
Một quy trình nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa vững chắc tích hợp việc chiết xuất protein hiệu quả, phân giải bằng enzyme và làm giàu phosphopeptide. Đề cương sau đây phản ánh các thực hành tốt nhất đã được xác lập và điều chỉnh cho việc chuẩn bị mẫu bằng siêu âm:
- Dập tắt nhanh các phản ứng trong mẫu và thu mẫu
Các phản ứng trong tế bào hoặc mô được dập tắt nhanh chóng – thường bằng cách đông lạnh tức thời – để bảo toàn trạng thái phosphoryl hóa. Bước này rất quan trọng do tính chất thoáng qua của các sự kiện phosphoryl hóa. - Ly giải tế bào và chiết xuất protein bằng siêu âm
Mẫu được rã đông và xử lý bằng siêu âm, thường theo các chu kỳ ngắn. Năng lượng siêu âm phá vỡ màng tế bào và giải phóng protein hiệu quả. Trong các quy trình đã được thẩm định, việc xử lý siêu âm được thực hiện qua nhiều chu kỳ để đảm bảo ly giải hoàn toàn.
Ví dụ: Sau khi rã đông mẫu trên đá, tế bào được ly giải bằng siêu âm, chẳng hạn sử dụng thiết bị Vialtweeter trong 2 chu kỳ, mỗi chu kỳ 1 min. - Làm trong mẫu và định lượng protein
Sau khi ly giải, mẫu được ly tâm để loại bỏ các mảnh vụn. Phần dịch nổi chứa protein hòa tan được thu và định lượng để đảm bảo lượng đầu vào nhất quán giữa các mẫu. - Khử và alkyl hóa
Các liên kết disulfide được khử (ví dụ bằng DTT) và alkyl hóa (ví dụ bằng IAA) để ổn định protein và cải thiện hiệu quả phân giải. - Phân giải protein
Protein được phân giải bằng enzyme, thường là trypsin, tạo ra các peptide phù hợp để phân tích bằng khối phổ. Đọc thêm về phân giải protein được tăng tốc bằng siêu âm! - Tinh sạch và khử muối peptide
Peptide được tinh sạch bằng các phương pháp dựa trên C18 để loại bỏ các tạp chất có thể gây nhiễu cho phân tích LC-MS. - Làm giàu phosphopeptide
Do hàm lượng peptide phosphoryl hóa thấp, các kỹ thuật làm giàu như phương pháp ái lực Fe-NTA hoặc TiO₂ được áp dụng để phân lập chọn lọc phosphopeptide. - Phân tích LC-MS/MS và xử lý dữ liệu
Các mẫu đã làm giàu được phân tích bằng khối phổ có độ phân giải cao, thường sử dụng phương pháp thu nhận dữ liệu độc lập (DIA) để cải thiện khả năng định lượng và tái lập.
Đáng chú ý, các quy trình quy mô lớn có thể được điều chỉnh để sử dụng định dạng đĩa 96 giếng, cho phép xử lý song song lên đến hàng trăm mẫu – một phương pháp hoàn toàn tương thích với việc xử lý siêu âm bằng UIP400MTP.
Quy trình được tối ưu hóa để dập tắt nhanh các phản ứng trong hệ protein phosphoryl hóa, làm giàu phosphopeptide và thực hiện Phos-DIA-MS.
Quy trình và hình ảnh: ©Die và cộng sự 2023
Giá ống nghiệm được xử lý siêu âm trong UIP400MTP để chiết xuất protein và phân giải protein
Nâng cao khả năng tái lập và chất lượng dữ liệu thông qua xử lý siêu âm
Một trong những thách thức chính trong nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa là đạt được khả năng định lượng nhất quán trên các tập dữ liệu lớn. Sự biến thiên phát sinh trong quá trình chuẩn bị mẫu có thể che khuất những khác biệt có ý nghĩa sinh học.
Xử lý siêu âm giải quyết vấn đề này bằng cách cung cấp:
- Năng lượng đầu vào được chuẩn hóa giữa các mẫu
- Giảm sự biến thiên do thao tác thủ công
- Cải thiện khả năng tái lập trong chiết xuất và phân giải protein
Khi kết hợp với các nền tảng có năng suất xử lý mẫu cao như UIP400MTP, các phòng thí nghiệm có thể đạt được mức độ nhất quán thiết yếu cho các nghiên cứu sinh học hệ thống và việc khám phá dấu ấn sinh học lâm sàng.
Tương lai của nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa: Tự động hóa và khả năng mở rộng quy mô
Khi nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa tiếp tục mở rộng sang các ứng dụng quy mô lớn và lâm sàng, nhu cầu về tự động hóa và năng suất xử lý mẫu sẽ chỉ ngày càng tăng. Chuẩn bị mẫu bằng siêu âm, đặc biệt khi tích hợp với các hệ thống tương thích với đĩa vi giếng, là một công nghệ then chốt giúp đáp ứng nhu cầu này.
Bằng cách kết hợp khả năng ly giải bằng siêu âm hiệu quả, xử lý song song và tính tương thích với các quy trình tự động, các thiết bị như VialTweeter và UIP400MTP đang thiết lập những tiêu chuẩn mới trong chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu hệ protein.
Đọc thêm về việc tích hợp UIP400MTP vào các quy trình phòng thí nghiệm tự động!
Tận dụng phương pháp chuẩn bị mẫu có hỗ trợ siêu âm trong nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa!
Chiết xuất protein có hỗ trợ siêu âm đã trở thành một thành phần thiết yếu của nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa hiện đại, mang lại hiệu quả, khả năng mở rộng quy mô và độ tái lập vượt trội chưa có phương pháp nào sánh bằng. Với nhu cầu ngày càng tăng về phân tích các hệ thống sinh học phức tạp trên các tập hợp mẫu lớn, công nghệ siêu âm không chỉ mang lại lợi thế – mà còn đóng vai trò thiết yếu.
Bằng cách cho phép triển khai các quy trình được chuẩn hóa với năng suất xử lý mẫu cao, các giải pháp như VialTweeter và UIP400MTP đang đẩy nhanh những khám phá về truyền tín hiệu tế bào, cơ chế bệnh và y học chính xác.
Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng sản xuất tại Đức
Các thiết bị siêu âm Hielscher nổi tiếng với chất lượng và tiêu chuẩn thiết kế cao nhất. Độ bền và khả năng vận hành dễ dàng cho phép tích hợp thuận lợi các thiết bị siêu âm của chúng tôi vào cơ sở công nghiệp. Các thiết bị siêu âm Hielscher dễ dàng đáp ứng các điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi cao.
Hielscher Ultrasonics là công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt chú trọng đến các thiết bị siêu âm hiệu suất cao, ứng dụng công nghệ tiên tiến nhất và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, các thiết bị siêu âm Hielscher tuân thủ CE và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.
Các mẫu thiết bị siêu âm xử lý nhiều mẫu của Hielscher gồm UIP400MTP dành cho đĩa vi giếng, VialTweeter và CupHorn: chuẩn bị mẫu tốc độ cao với năng suất xử lý mẫu cao
Câu hỏi thường gặp
Nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa là gì?
Nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa là một chuyên ngành của nghiên cứu hệ protein, tập trung vào việc nhận diện, xác định vị trí và định lượng các vị trí phosphoryl hóa protein trên quy mô lớn. Chuyên ngành này phân tích các protein và peptide được phosphoryl hóa để tìm hiểu các con đường truyền tín hiệu tế bào, cơ chế điều hòa và các biến đổi động sau dịch mã kiểm soát chức năng protein.
Tại sao việc xác định sự phosphoryl hóa lại khó khăn?
Việc xác định sự phosphoryl hóa gặp nhiều khó khăn vì các sự kiện phosphoryl hóa thường diễn ra thoáng qua, có mức độ hiện diện thấp và xảy ra với tỷ lệ phosphoryl hóa thấp. Ngoài ra, các peptide được phosphoryl hóa có thể khó phát hiện do tính không ổn định về mặt hóa học, sự biến thiên khả năng ion hóa trong phép đo khối phổ và tính phức tạp của việc xác định chính xác các vị trí phosphoryl hóa trong trình tự peptide.
Phosphoprotein là gì?
Phosphoprotein là các protein đã trải qua quá trình phosphoryl hóa, nghĩa là một hoặc nhiều nhóm phosphate đã được gắn bằng liên kết cộng hóa trị vào các gốc axit amin cụ thể, thường là serine, threonine hoặc tyrosine. Biến đổi này có thể làm thay đổi hoạt tính, cấu trúc, vị trí phân bố của protein hoặc tương tác của protein với các phân tử khác.
Nghiên cứu hệ protein và nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa khác nhau như thế nào?
Nghiên cứu hệ protein là việc nghiên cứu toàn diện tất cả các protein được biểu hiện trong một hệ thống sinh học, bao gồm mức độ hiện diện, cấu trúc và tương tác của chúng. Ngược lại, nghiên cứu hệ protein phosphoryl hóa tập trung cụ thể vào tập hợp con gồm các protein được phosphoryl hóa, chú trọng phân tích các vị trí phosphoryl hóa và vai trò điều hòa của chúng trong các quá trình tế bào.
Tài liệu / Tài liệu tham khảo
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator für die High-Throughput Probenvorbereitung in 96-Well-Platten – deutsch – Hielscher Ultrasonics
- Di Y, Li W, Salovska B, Ba Q, Hu Z, Wang S, Liu Y. (2023): A basic phosphoproteomic-DIA workflow integrating precise quantification of phosphosites in systems biology. Biophysics Reports. 2023 Apr 30;9(2):82-98.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- Gao, Erli; Li, Wenxue; Wu, Chongde; Shao, Wenguang; di, Yi; Liu, Yansheng (2021): Data-independent Acquisition-based Proteome and Phosphoproteome Profiling across Six Melanoma Cell Lines Reveals Determinants of Proteotypes. Molecular Omics. 2021
Hielscher Ultrasonics sản xuất các thiết bị đồng nhất hóa bằng siêu âm hiệu suất cao từ quy mô phòng thí nghiệm đến quy mô công nghiệp.