Khử parafin và chiết xuất protein từ FFPE

Hỗ trợ chiết xuất protein từ các lát cắt mô cố định bằng formalin và đúc parafin (FFPE) bằng cách kết hợp tối ưu việc khử parafin, hòa tan và xử lý siêu âm với máy siêu âm đa ống VialTweeter. Quy trình này hỗ trợ phân tích hệ protein dựa trên khối phổ ở các bước tiếp theo và tương thích với các quy trình làm sạch bằng SP3 và phân giải bằng enzyme.

Quy trình thao tác chuẩn (SOP) này dành cho nhân viên phòng thí nghiệm thực hiện phân tích hệ protein của mẫu mô FFPE bằng xử lý siêu âm hiệu năng cao. Quy trình được tối ưu hóa để xử lý song song tối đa mười mẫu FFPE bằng máy siêu âm đa ống VialTweeter.

VialTweeter trên bộ xử lý siêu âm UP200ST

Máy siêu âm VialTweeter để xử lý siêu âm đồng thời 10 mẫu, ví dụ như để ly giải và chiết xuất protein từ mẫu FFPE

Quy trình: Chiết xuất protein từ mẫu FFPE bằng VialTweeter

Vật liệu và thuốc thử

Thuốc thử

Xylen (cấp dùng cho mô học)
Ethanol (tuyệt đối 96%)
Đệm ly giải:

6 M guanidin hydroclorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin)
40 mM CAA (2-cloroacetamid)

Chất ức chế protease (tùy chọn; ví dụ: cOmplete™ mini không chứa EDTA)

Thiết bị

Máy siêu âm đa ống VialTweeter
Ống vi ly tâm có độ hấp phụ thấp, dung tích 1,5 mL hoặc 2,0 mL
Khối gia nhiệt hoặc tủ ủ (cài đặt ở 95°C và 80°C)
Máy vi ly tâm
Máy trộn ổn nhiệt (tùy chọn nhưng được khuyến nghị)

Lượng mẫu đầu vào

1–2 lát cắt mô FFPE dày 10 µm cho mỗi mẫu (tức là mỗi lọ)

HOẶC

Tổng cộng ~100 µg mô cho mỗi mẫu (tức là mỗi lọ)

Lưu ý: Sử dụng lưỡi dao mới khi cắt lát vi thể để giảm thiểu nhiễm bẩn do vụn parafin.

Các bước thực hiện

Khử parafin
1. Chuyển các lát cắt FFPE vào ống vi ly tâm có độ hấp phụ thấp.
2. Thêm 1 mL xylen, trộn vortex trong thời gian ngắn.
3. Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.
4. Ly tâm ở 14.000 × g trong 2 phút; loại bỏ dịch nổi.
5. Lặp lại bước rửa bằng xylen thêm một lần nữa (Bước 2–4).
6. Rửa cặn bằng 1 mL ethanol 96%, trộn vortex, sau đó ly tâm ở 14.000 × g trong 2 phút. Loại bỏ dịch nổi.
7. Lặp lại bước rửa bằng ethanol thêm một lần nữa (tổng cộng 2 lần rửa bằng ethanol).
8. Mở nắp ống và để cặn khô tự nhiên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để ethanol còn dư bay hơi.
Chiết xuất protein và xử lý siêu âm
1. Thêm 200 µL đệm ly giải vào mỗi phần cặn khô. 
  Lưu ý: Mặc dù máy siêu âm có thể xử lý thể tích lên đến 1 mL, 200 µL là thể tích tối ưu cho các bước xử lý tiếp theo.
2. Trộn bằng cách vortex hoặc hút nhả nhẹ nhàng bằng pipet.
Ủ nhiệt lần thứ nhất
1. Ủ các ống ở 95 °C trong 30 min, đồng thời lắc ở 400 rpm bằng máy trộn ổn nhiệt hoặc khối gia nhiệt.
2. Để mẫu nguội ở nhiệt độ phòng trong 5 min.
Xử lý siêu âm lần thứ nhất bằng VialTweeter
1. Đặt các ống vào VialTweeter.
2. Cài đặt VialTweeter UP200St theo các giá trị bên dưới và xử lý siêu âm.

Cài đặt máy siêu âm
• Đặt biên độ (A) ở 100%
• Đặt chế độ xung (C) ở 100%
• Bộ định thời chu kỳ: Bật
• Thời gian bật: 60s
• Thời gian tắt: 30s
• Giá trị giới hạn: 15 min (tương ứng với 10 chu kỳ)
(Ghi chú tính toán: (60 s bật + 30 s tắt) × 10 chu kỳ = 900 s = 15 min)

Ủ nhiệt lần thứ hai
Lấy các ống ra và ủ lại ở 95 °C trong 15 min, 400 rpm.
Xử lý siêu âm lần thứ hai
Lặp lại xử lý siêu âm bằng VialTweeter với cùng các cài đặt (như trên) thêm 10 chu kỳ nữa (tổng thời gian 15 min).
Làm trong dịch ly giải
1. Ly tâm các mẫu ở 13.000 × g trong 10 min tại 23°C (nhiệt độ phòng).
2. Cẩn thận thu dịch nổi vào một ống Eppendorf Safe-lock 2,0 mL mới. Tránh làm xáo trộn cặn.
Xử lý tiếp theo
Dịch ly giải hiện đã sẵn sàng để làm sạch bằng SP3 và phân giải bằng enzyme.

VialTweeter là hệ thống siêu âm độc đáo cho phép xử lý đồng thời tối đa 10 lọ trong các điều kiện hoàn toàn giống nhau mà không gây nhiễm chéo.

VialTweeter với các ống Eppendorf 2,0mL để chuẩn bị mẫu đáng tin cậy trong điều kiện vô trùng

Hielscher VialTweeter với 10 ống Eppendorf

Lưu ý và thực hành tốt nhất

Nguy cơ quá nhiệt trong quá trình xử lý siêu âm được giảm thiểu nhờ chu kỳ BẬT/TẮT đã lập trình.
Tránh trộn vortex sau khi xử lý siêu âm để ngăn protein kết tụ.

Xử lý chất thải và an toàn

Xylen và guanidin hydroclorid là các hóa chất nguy hại; thao tác trong tủ hút khí độc.

Thải bỏ toàn bộ chất thải dung môi và chất thải sinh học theo các quy trình an toàn sinh học và vệ sinh hóa chất của cơ sở.

Bảng dưới đây cho biết năng lực xử lý gần đúng của các máy siêu âm quy mô phòng thí nghiệm của chúng tôi:

Thiết bị được khuyến nghị	Thể tích mẻ	Lưu lượng
Máy siêu âm đĩa 96 giếng UIP400MTP	đĩa nhiều giếng / đĩa vi chuẩn độ	n.a.
CupHorn siêu âm	CupHorn dùng cho lọ hoặc cốc có mỏ	n.a.
GDmini2	thiết bị phản ứng vi dòng siêu âm	n.a.
VialTweeter	0,5 đến 1,5mL	n.a.
UP100H	1 đến 500mL	10 đến 200mL/min
UP200Ht, UP200St	10 đến 1000mL	20 đến 200mL/min
UP400St	10 đến 2000mL	20 đến 400mL/min
Máy lắc sàng siêu âm	n.a.	n.a.

Máy đồng nhất hóa siêu âm có lực cắt cao được sử dụng trong xử lý ở quy mô phòng thí nghiệm, trên bàn thí nghiệm, thí điểm và công nghiệp.

Hielscher Ultrasonics sản xuất máy đồng nhất hóa siêu âm hiệu năng cao cho các ứng dụng trộn, phân tán, nhũ hóa và chiết xuất ở quy mô phòng thí nghiệm, thí điểm và công nghiệp.

Chủ đề liên quan

Tài liệu / Tài liệu tham khảo

Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao mẫu mô được cố định dưới dạng FFPE?

Phương pháp bảo quản bằng cách cố định với formalin và đúc parafin (FFPE) giúp ổn định hình thái mô và cấu trúc protein bằng cách hình thành các liên kết chéo cộng hóa trị thông qua formaldehyd. Đúc trong parafin cho phép bảo quản lâu dài ở nhiệt độ phòng, đồng thời duy trì tính toàn vẹn về mô học và phân tử cho các phân tích hồi cứu.

Làm thế nào để khử parafin cho mẫu FFPE?

Khử parafin bao gồm các bước rửa bằng dung môi liên tiếp để loại bỏ parafin: thường là hai lần ủ với xylen, tiếp theo là hai lần rửa bằng ethanol (96%). Sau khi ly tâm và làm khô, mô sẵn sàng cho bước chiết xuất tiếp theo. Quá trình này khôi phục khả năng tiếp cận mẫu để ly giải và phân giải bằng enzyme.

Mục đích của việc ủ nhiệt là gì?

Ủ nhiệt là việc cho mẫu tiếp xúc có kiểm soát với một nhiệt độ xác định trong một khoảng thời gian cụ thể để gây ra các biến đổi sinh hóa hoặc vật lý. Trong nghiên cứu hệ protein, phương pháp này thường được sử dụng để làm biến tính protein, phá bỏ các liên kết chéo do formaldehyd tạo ra trong mô FFPE hoặc tăng hiệu quả của đệm ly giải. Nhiệt độ và thời gian là các thông số then chốt, được điều chỉnh phù hợp với phản ứng mục tiêu hoặc loại mẫu.

Phân giải bằng SP3 là gì?

Chuẩn bị mẫu tăng cường bằng pha rắn trong một bình duy nhất (SP3) là một quy trình phân tích hệ protein dựa trên hạt. Quy trình này sử dụng các hạt thuận từ để liên kết protein, cho phép làm sạch, cô đặc và phân giải bằng enzyme ngay trên hạt một cách hiệu quả trong điều kiện gây biến tính. SP3 giảm thiểu thất thoát mẫu và có độ tương thích cao với các mẫu có lượng đầu vào thấp và mẫu FFPE.

Siêu âm hiệu năng cao! Dải sản phẩm Hielscher bao quát toàn bộ phạm vi, từ máy siêu âm phòng thí nghiệm nhỏ gọn, qua các thiết bị để bàn, đến các hệ thống siêu âm hoàn toàn ở quy mô công nghiệp.

Hielscher Ultrasonics sản xuất máy đồng nhất hóa siêu âm hiệu năng cao từ quy mô phòng thí nghiệm đến quy mô công nghiệp.