Khử parafin hóa và chiết xuất protein từ FFPE

Tạo điều kiện chiết xuất protein từ các phần mô nhúng parafin cố định formalin (FFPE) bằng cách sử dụng sự kết hợp tối ưu giữa khử parafin, hòa tan và siêu âm với máy siêu âm đa ống VialTweeter. Giao thức này hỗ trợ proteomics dựa trên khối phổ hạ nguồn và tương thích với quy trình làm sạch SP3 và phân hủy enzyme.

SOP này dành cho nhân viên phòng thí nghiệm tham gia phân tích protein của mẫu mô FFPE bằng cách sử dụng siêu âm hiệu suất cao. Nó được tối ưu hóa cho tối đa mười mẫu FFPE được xử lý song song bằng cách sử dụng Máy siêu âm đa ống VialTweeter.

Giao thức: Chiết xuất protein từ các mẫu FFPE bằng VialTweeter

Vật liệu và thuốc thử

thuốc thử

• Xylene (cấp mô học)
• Ethanol (tuyệt đối 96%)
• Bộ đệm ly giải:

6 M Guanidine hydrochloride
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine)
40 mM CAA (2-Chloroacetamide)

• Chất ức chế protease (tùy chọn; ví dụ: cOmplete™ mini EDTA-free)

Thiết bị

• Máy siêu âm đa ống VialTweeter
• Ống ly tâm vi mô liên kết thấp 1,5 mL hoặc 2,0 mL
• Khối nhiệt hoặc lồng ấp (cài đặt 95 ° C và 80 ° C)
• Máy ly tâm vi mô
• Thermomixer (tùy chọn nhưng được khuyến nghị)

Đầu vào mẫu

• 1–2 phần mô FFPE dày 10 μm cho mỗi mẫu (tức là mỗi lọ)

hoặc

• Tổng cộng ~ 100 μg mô trên mỗi mẫu (tức là mỗi lọ)

Lưu ý: Sử dụng lưỡi dao mới để phẫu thuật vi cắt để giảm thiểu ô nhiễm mảnh vụn parafin.

Thủ tục

1. khử parafin hóa
   1. Chuyển các phần FFPE vào các ống ly tâm siêu nhỏ có độ liên kết thấp.
   2. Thêm 1 mL xylene, xoáy trong thời gian ngắn.
   3. Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.
   4. Ly tâm ở 14.000 × g trong 2 phút; loại bỏ phần nổi trên.
   5. Lặp lại rửa xylene một lần nữa (Bước 2–4).
   6. Rửa viên với 1 mL etanol 96%, xoáy, sau đó ly tâm ở 14.000 × g trong 2 phút. Loại bỏ phần nổi trên.
   7. Lặp lại rửa ethanol một lần nữa (tổng cộng 2 lần rửa ethanol).
   8. Hạt khô trong không khí trong 10 phút ở nhiệt độ phòng với nắp mở để làm bay hơi ethanol còn sót lại.
2. Chiết xuất protein và siêu âm
   1. Thêm 200 μL dung dịch đệm ly giải vào mỗi viên khô.
      Lưu ý: Mặc dù máy siêu âm có thể chứa tới 1 mL, nhưng 200 μL là tối ưu cho quá trình xử lý hạ lưu.

   2. Trộn bằng cách xoáy hoặc pipet nhẹ nhàng.
3. Ấp nhiệt đầu tiên
   1. Ủ các ống ở 95 ° C trong 30 phút, với sự khuấy ở tốc độ 400 vòng / phút bằng cách sử dụng bộ trộn nhiệt hoặc khối nhiệt.
   2. Để mẫu nguội ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
4. Sonication đầu tiên với VialTweeter
   1. Đặt các ống vào VialTweeter.
   2. Đặt VialTweeter UP200St thành các giá trị bên dưới và siêu âm.
Cài đặt máy siêu âm
• Đặt Amplitude (A) thành 100%
• Đặt chế độ xung (C) thành 100%
• Đồng hồ thời gian: Bật
• Đúng giờ: 60 giây
• Thời gian tắt: 30 giây
• Giá trị giới hạn: 15 phút (tương ứng với 10 chu kỳ)
(Lưu ý tính toán: (60 giây Bật + 30 giây Tắt) × 10 chu kỳ = 900 giây = 15 phút)
5. Ươm nhiệt thứ hai
   Tháo ống và ủ lại ở 95 ° C trong 15 phút, 400 vòng / phút.
6. Siêu âm thứ hai
   Lặp lại sonication trên VialTweeter bằng cách sử dụng các cài đặt tương tự (như trên) trong thêm 10 chu kỳ (tổng cộng 15 phút).
7. Làm rõ Lysate
   1. Ly tâm các mẫu ở 13.000 × g trong 10 phút ở 23 ° C (nhiệt độ phòng).
   2. Cẩn thận thu thập phần nổi vào ống Eppendorf khóa an toàn 2,0 mL mới. Tránh làm phiền viên nén.
8. Xử lý hạ nguồn
   Nước ly giải hiện đã sẵn sàng để làm sạch SP3 và tiêu hóa enzyme.

Ghi chú và phương pháp hay nhất

1. Nguy cơ quá nhiệt trong quá trình siêu âm được giảm thiểu bằng chu kỳ BẬT / TẮT được lập trình.
2. Tránh xoáy sau siêu âm để ngăn chặn sự kết tập protein.

Xử lý chất thải và an toàn

Bảng dưới đây cung cấp cho bạn một dấu hiệu về khả năng xử lý gần đúng của ultrasonicators kích thước phòng thí nghiệm của chúng tôi: