Chuẩn bị mẫu FFPE năng suất cao: Chiết xuất protein và cắt axit nucleic

Câu hỏi thường gặp
Dưới đây, chúng tôi trả lời các câu hỏi thường gặp liên quan đến việc chuẩn bị mô FFPE và xử lý mẫu FFPE bằng siêu âm.

Mô FFPE được chuẩn bị như thế nào?

Các bước chuẩn bị mô FFPE: Việc thao tác và xử lý mô tươi một cách tỉ mỉ đóng vai trò then chốt trong việc tạo ra các mẫu FFPE chất lượng cao. Đảm bảo bảo tồn cấu trúc tế bào, axit nucleic và protein là điều thiết yếu để các phân tích tiếp theo đạt độ chính xác. Mỗi bước – từ thu thập đến đúc khối – đều đòi hỏi sự chính xác để duy trì tính toàn vẹn của mẫu cho các phân tích khác nhau, bao gồm kiểm tra mô học, hóa mô miễn dịch và nghiên cứu phân tử. Khi được thực hiện đúng cách, quy trình cố định và đúc khối này đảm bảo mô được bảo quản phản ánh chính xác trạng thái in vivo, giúp mang lại kết quả chẩn đoán và nghiên cứu đáng tin cậy.
Chúng tôi hướng dẫn bạn qua 6 bước chính của quy trình đúc khối mẫu mô FFPE.

• Thu thập mô
  Mẫu sinh thiết từ động vật có vú còn sống và mô nuôi cấy đều là những nguồn phù hợp để lấy mô tươi phục vụ chuẩn bị mẫu FFPE.
  Điều quan trọng là sử dụng kỹ thuật vô khuẩn: Sử dụng dụng cụ và găng tay vô trùng để tránh nhiễm bẩn. Lý tưởng nhất là thu thập mô trong môi trường vô trùng, chẳng hạn như phòng phẫu thuật hoặc tủ dòng khí một chiều.
  Vì mẫu mô rất dễ bị tổn thương, việc thao tác nhẹ nhàng là điều thiết yếu: Giảm thiểu sự chậm trễ trong xử lý và bắt đầu ngay các bước xử lý mô tiếp theo sau khi cắt lấy mô. Điều này rất quan trọng để ngăn ngừa hiện tượng tự phân và phân hủy. Giữ mô ở nhiệt độ phòng; tránh đông lạnh vì có thể gây hình thành tinh thể băng và tổn thương mô.
• Cố định mô
  Đầu tiên, mô được xử lý bằng dung dịch cố định: Sử dụng formalin đệm trung tính 10% (NBF), tương đương với formaldehyde 4% trong nước, được đệm ở pH trung tính.
  Ngâm mô ngập hoàn toàn trong formalin. Đảm bảo tỷ lệ thể tích dung dịch cố định so với mô ít nhất là 10:1. Thời gian cố định thường dao động từ 6 đến 24 giờ, tùy thuộc vào loại và kích thước mô. Điều quan trọng là chất cố định có thể thấm sâu vào toàn bộ mô. Tuy nhiên, cố định quá mức có thể dẫn đến hình thành liên kết chéo gây khó khăn cho việc phục hồi kháng nguyên, trong khi cố định chưa đủ có thể khiến mô được bảo quản kém.
• Cắt sửa mô
  Thứ hai, cắt sửa mô đến độ dày khoảng 3–5 mm để chất cố định có thể thấm vào đầy đủ. Đảm bảo định hướng mô đúng cách để thu được các cấu trúc mô học cần thiết. Điều này tạo thuận lợi cho quá trình chiết xuất khi mô được sử dụng để phân tích sau đó.
• Xử lý mẫu đã cố định
  Lúc này, mô đã cố định phải được khử nước: Sau khi cố định, mô cần được khử nước để đảm bảo sáp paraffin thấm vào toàn bộ mô. Chuyển mô lần lượt qua một dãy dung dịch ethanol có nồng độ tăng dần (70%, 80%, 90% và 100%) để loại bỏ nước.
  Làm trong bằng xylene: Sáp paraffin không tan trong nước nhưng tan trong xylene. Do đó, nước trong mô phải được thay thế bằng xylene. Tuy nhiên, bản thân xylene không tan trong nước nhưng tan trong cồn, nên cần có một bước trung gian để thay thế nước bằng cồn trước. Ngâm mô trong xylene hoặc chất thay thế xylene để loại bỏ ethanol và chuẩn bị mô cho quá trình thấm paraffin.
  Thấm paraffin: Vùi mô trong sáp paraffin nóng chảy, đảm bảo paraffin thấm hoàn toàn vào mô. Bước này thường bao gồm nhiều lần thay paraffin để đảm bảo mô được thấm kỹ.
• Đúc khối mô
  Ở bước này, mô được đúc thành một khối mô: Đặt mô vào khuôn theo hướng mong muốn và đổ paraffin nóng chảy phủ lên mô. Để paraffin đông rắn bằng cách làm nguội ở nhiệt độ phòng hoặc trên bàn lạnh.
• Cắt lát và gắn lên lam kính
  Cắt lát vi thể: Để cắt lát mô đã đúc khối, sử dụng máy cắt vi thể để cắt các lát mỏng (thường là 4–5 micromet) từ khối paraffin. Sau đó, gắn mẫu bằng cách đặt các lát cắt lên lam kính để nhuộm và phân tích dưới kính hiển vi ở các bước tiếp theo.
  Cuối cùng, kiểm tra chất lượng mô học: Đánh giá các lát cắt đầu tiên dưới kính hiển vi để đảm bảo mô được cố định và xử lý đúng cách. Điều chỉnh quy trình khi cần thiết dựa trên loại mô và chất lượng quan sát được.

 
Mô FFPE có thể được sử dụng để thu hồi RNA, DNA và protein cũng như phát hiện các dấu hiệu ung thư hoặc bệnh khác. Các mô này có thể được bảo quản trong nhiều năm và là một phần thiết yếu trong cách các nhà nghiên cứu và bác sĩ sử dụng mẫu mô để chẩn đoán và nghiên cứu.

Những vấn đề và thách thức thường gặp với mô FFPE là gì?

Các mẫu mô được cố định bằng formalin và đúc paraffin (FFPE) được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đoán, nhưng cũng đặt ra một số thách thức và vấn đề thường gặp:

• Sự phân hủy các phân tử sinh học: Cố định kéo dài có thể dẫn đến sự phân hủy DNA, RNA và protein, khiến việc chiết xuất axit nucleic hoặc protein chất lượng cao cho các ứng dụng tiếp theo trở nên khó khăn. Cố định đúng cách (tránh cố định không đủ và cố định quá mức) là điều thiết yếu để bảo quản mô.

Liên kết chéo: Cố định bằng formalin gây ra liên kết chéo giữa protein và axit nucleic, có thể cản trở phân tích phân tử và ảnh hưởng đến độ chính xác của hóa mô miễn dịch cùng các xét nghiệm khác.

• Che lấp kháng nguyên: Quá trình cố định có thể che lấp các vị trí kháng nguyên, làm giảm hiệu quả gắn kết của kháng thể trong hóa mô miễn dịch và các xét nghiệm miễn dịch khác. Điều này thường đòi hỏi bước phục hồi kháng nguyên, một quy trình giúp loại bỏ sự che lấp epitope và khôi phục sự gắn kết giữa epitope và kháng thể. Tuy nhiên, không phải lúc nào tính kháng nguyên cũng có thể được phục hồi hoàn toàn.
• Chất lượng cố định không đồng đều: Sự khác biệt về thời gian và điều kiện cố định có thể dẫn đến chất lượng mẫu không đồng nhất, ảnh hưởng đến khả năng tái lập và khả năng so sánh kết quả. Hãy sử dụng các quy trình cố định đáng tin cậy và tránh cố định không đủ cũng như cố định quá mức.
• Tổn thương và phân mảnh DNA: Cố định mẫu FFPE bằng formalin có thể gây ra nhiều loại tổn thương DNA, bao gồm khử amin cytosine (đột biến C thành T), tổn thương oxy hóa (ví dụ: 8-oxo-guanine dẫn đến đột biến G thành T), cũng như các tổn thương vật lý như đứt gãy một mạch, khoảng trống và các vị trí mất base làm cản trở hoạt động của DNA polymerase. Quá trình cố định bằng formalin có thể gây phân mảnh DNA, làm phức tạp các phân tích di truyền và hệ gen như PCR và giải trình tự.
• Chất lượng RNA: RNA được chiết xuất từ mô FFPE thường bị phân mảnh và biến đổi hóa học, khiến việc thực hiện các phân tích hệ phiên mã chất lượng cao trở nên khó khăn.
• Biến đổi protein: Formalin có thể gây ra các biến đổi hóa học ở protein, ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của chúng, từ đó có thể gây trở ngại cho các phân tích hệ protein.
• Giả ảnh do xử lý mẫu: Trong quá trình đúc và cắt lát, ứng suất cơ học và nhiệt có thể tạo ra giả ảnh và gây thêm tổn thương cho mô.
• Biến thiên giữa các lô: Sự khác biệt trong quy trình cố định và đúc giữa các lô khác nhau có thể dẫn đến biến thiên đáng kể trong kết quả, làm phức tạp việc so sánh giữa các nghiên cứu.
• Các vấn đề về bảo quản: Bảo quản lâu dài các khối FFPE có thể dẫn đến sự phân hủy thêm và làm mất tính toàn vẹn của axit nucleic theo thời gian, ảnh hưởng đến khả năng sử dụng các mẫu lưu trữ cho nghiên cứu hồi cứu.

Sử dụng các quy trình được tối ưu hóa, thao tác mẫu cẩn thận và áp dụng các kỹ thuật tiên tiến giúp cải thiện chất lượng và độ tin cậy của dữ liệu thu được từ mô FFPE.

Mô FFPE và mô đông lạnh khác nhau như thế nào?

Mô FFPE (được cố định bằng formalin và đúc paraffin) được bảo quản bằng cách sử dụng formalin để cố định mô, sau đó đúc trong sáp paraffin, cho phép bảo quản lâu dài ở nhiệt độ phòng mà vẫn duy trì hình thái mô. Ngược lại, mô đông lạnh được bảo quản nhanh chóng bằng cách đông lạnh, giúp duy trì tính toàn vẹn của axit nucleic và protein tốt hơn nhưng đòi hỏi bảo quản ở nhiệt độ rất thấp.

Những hóa chất nào được sử dụng để đúc mẫu FFPE?

Các hóa chất dùng để đúc mẫu FFPE thường bao gồm formalin để cố định và sáp paraffin để đúc mẫu. Khi đúc mẫu FFPE, mô thường được cố định bằng formalin đệm trung tính 10% (v/v) (FA) hoặc dung dịch formaldehyde 4% (w/v) (PFA) mới pha từ bột paraformaldehyde. Formalin, một dung dịch formaldehyde trong nước, được đệm đến pH trung tính để bảo tồn hình thái mô và ngăn ngừa sự tạo liên kết chéo quá mức. Dung dịch pha từ paraformaldehyde cũng giúp cố định hiệu quả bằng cách tạo liên kết chéo giữa các protein, qua đó ổn định cấu trúc mô cho bước đúc trong sáp paraffin tiếp theo. Các hóa chất này rất cần thiết để duy trì tính toàn vẹn và hình thái của mô trong quá trình cố định và đúc mẫu.

Paraffin được loại bỏ khỏi mẫu FFPE như thế nào?

Để loại bỏ paraffin khỏi mẫu FFPE, các lát cắt mô thường được rửa nhiều lần bằng xylene, sau đó được tái hydrat hóa qua một dãy dung dịch cồn có nồng độ giảm dần và cuối cùng là nước. Do xylene có độc tính cao, gây ra các nguy cơ sức khỏe như vấn đề về hô hấp, kích ứng da và các ảnh hưởng lâu dài có thể xảy ra khi tiếp xúc lặp lại, phương pháp loại bỏ paraffin bằng siêu âm đang nổi lên như một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn tại nhiều phòng thí nghiệm. Phương pháp này sử dụng sóng siêu âm cường độ cao để loại bỏ paraffin hiệu quả và an toàn mà không cần các dung môi độc hại như xylene, qua đó giảm nguy cơ cho nhân viên phòng thí nghiệm và tạo ra môi trường làm việc an toàn hơn.

Tôi nên cố định mô trong bao lâu để có mẫu FFPE chất lượng tốt?

Các khuyến nghị chung về thời gian cố định thường đề xuất cố định mẫu mô trong formalin từ 24 đến 48 giờ. Khoảng thời gian này thường đủ để bảo tồn hình thái mô và cấu trúc tế bào, đồng thời hạn chế tối đa tình trạng cố định quá mức, vốn có thể dẫn đến sự tạo liên kết chéo quá mức và sự phân hủy axit nucleic cùng protein. Tuy nhiên, thời gian cố định tối ưu có thể thay đổi tùy theo kích thước và loại mô, trong đó các mẫu nhỏ hơn hoặc dễ tổn thương hơn cần thời gian cố định ngắn hơn. Điều cốt yếu là cân bằng giữa việc cố định đầy đủ để ngăn mô tự phân giải và phân hủy với việc tránh cố định kéo dài có thể gây khó khăn cho các phân tích phân tử ở các bước tiếp theo.