Chuẩn bị mẫu thông lượng cao FFPE: Chiết xuất protein và cắt axit nucleic

FAQ
Dưới đây, chúng tôi trả lời các câu hỏi thường gặp, có liên quan đến việc chuẩn bị mô FFPE và siêu âm các mẫu FFPE.

Mô FFPE được chuẩn bị như thế nào?

Các bước chuẩn bị mô FFPE: Việc xử lý và xử lý tỉ mỉ mô tươi là rất quan trọng để tạo ra mẫu FFPE chất lượng cao. Đảm bảo bảo tồn cấu trúc tế bào, axit nucleic và protein là điều cần thiết để phân tích hạ nguồn chính xác. Mỗi bước - từ thu thập đến nhúng - đòi hỏi độ chính xác để duy trì tính toàn vẹn của mẫu cho các phân tích khác nhau, bao gồm kiểm tra mô học, hóa mô miễn dịch và nghiên cứu phân tử. Được thực hiện đúng cách, quá trình cố định và nhúng này đảm bảo rằng mô được bảo quản phản ánh chính xác trạng thái in vivo, cho phép kết quả chẩn đoán và nghiên cứu đáng tin cậy.
Chúng tôi hướng dẫn bạn 6 bước chính của quy trình nhúng mẫu mô FFPE.

• Thu thập mô
  Sinh thiết từ động vật có vú sống và nuôi cấy mô đều là nguồn khả thi để lấy mô tươi để chuẩn bị mẫu FFPE.
  Điều quan trọng là sử dụng kỹ thuật vô trùng: Sử dụng dụng cụ và găng tay vô trùng để tránh nhiễm bẩn. Tốt nhất, hãy thu thập các mô trong môi trường vô trùng, chẳng hạn như phòng phẫu thuật hoặc máy hút mùi dòng chảy tầng.
  Vì mẫu bệnh phẩm rất dễ vỡ nên việc xử lý nhạy cảm của nó là điều cần thiết: Giảm thiểu sự chậm trễ trong quá trình xử lý và ngay lập tức bắt đầu xử lý mô sau khi cắt bỏ. Điều này rất quan trọng để ngăn ngừa tự phân giải và suy thoái. Giữ khăn giấy ở nhiệt độ phòng; Tránh đóng băng vì nó có thể gây ra sự hình thành tinh thể băng và tổn thương mô.
• Cố định mô
  Đầu tiên, mô được xử lý bằng dung dịch cố định: Sử dụng 10% formalin đệm trung tính (NBF), tương đương với 4% formaldehyde trong nước, đệm đến pH trung tính.
  Ngâm hoàn toàn mô trong formalin. Đảm bảo tỷ lệ thể tích cố định trên mô ít nhất là 10:1. Thời gian cố định thường dao động từ 6 đến 24 giờ, tùy thuộc vào loại và kích thước mô. Điều quan trọng là chất cố định có thể thâm nhập mô một cách triệt để. Tuy nhiên, cố định quá mức có thể dẫn đến liên kết ngang làm phức tạp việc lấy kháng nguyên, trong khi cố định thiếu có thể dẫn đến bảo quản mô kém.
• Cắt tỉa mô
  Thứ hai, cắt mô đến độ dày khoảng 3-5 mm để chất cố định thâm nhập đầy đủ. Đảm bảo định hướng thích hợp của mô để nắm bắt các cấu trúc mô học có liên quan. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất khi mô sau này được sử dụng để phân tích.
• Xử lý mẫu cố định
  Bây giờ, các mô cố định phải được mất nước: Sau khi cố định, mô cần được khử nước để đảm bảo sự thâm nhập triệt để của sáp parafin. Đưa mô qua một loạt ethanol được phân loại (70%, 80%, 90% và 100%) để loại bỏ nước.
  Làm sạch bằng xylene: Sáp parafin không hòa tan trong nước, nhưng hòa tan trong xylene. Do đó, nước trong mô phải được thay thế bằng xylene. Tuy nhiên, bản thân xylene không hòa tan trong nước nhưng hòa tan trong rượu, đòi hỏi một bước trung gian đầu tiên nước được thay thế bằng rượu. Nhúng mô vào xylene hoặc chất thay thế xylene để loại bỏ etanol và chuẩn bị mô cho sự xâm nhập parafin.
  Thâm nhiễm bằng parafin: Nhúng mô vào sáp parafin nóng chảy, đảm bảo thâm nhập hoàn toàn. Bước này thường liên quan đến một số thay đổi parafin để đảm bảo ngâm tẩm kỹ lưỡng.
• Nhúng mô
  Trong bước này, mô được đúc thành một khối mô: Đặt mô vào khuôn theo hướng mong muốn và đổ parafin nóng chảy lên trên. Để parafin đông đặc bằng cách để nguội ở nhiệt độ phòng hoặc trên đĩa lạnh.
• Phân đoạn và gắn kết
  Microtomy: Để cắt mô nhúng, hãy sử dụng microtome để cắt các phần mỏng (thường là 4-5 micromet) từ khối parafin. Sau đó, mẫu được gắn kết, đặt các phần trên các slide thủy tinh để nhuộm tiếp theo và phân tích bằng kính hiển vi.
  Cuối cùng, kiểm tra chất lượng của mô học: Đánh giá các phần đầu tiên dưới kính hiển vi để đảm bảo cố định và xử lý thích hợp. Điều chỉnh các giao thức khi cần thiết dựa trên loại mô và chất lượng quan sát được.

 
Các mô FFPE có thể được sử dụng để phục hồi RNA, DNA và protein cũng như phát hiện các dấu hiệu của ung thư hoặc các bệnh khác. Chúng có thể được lưu trữ trong nhiều năm và là một phần thiết yếu trong cách các nhà nghiên cứu và bác sĩ tận dụng các mẫu mô để chẩn đoán và nghiên cứu.

Các vấn đề và thách thức phổ biến với mô FFPE là gì?

Các mẫu mô Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đoán, nhưng chúng đưa ra một số thách thức và vấn đề phổ biến:

• Sự phân hủy của các phân tử sinh học: Cố định kéo dài có thể dẫn đến sự suy thoái DNA, RNA và protein, gây khó khăn cho việc chiết xuất axit nucleic hoặc protein chất lượng cao cho các ứng dụng hạ nguồn. Cố định đúng cách (tránh cố định quá mức và quá mức) là điều cần thiết để bảo tồn mô.

Liên kết chéo: Cố định formalin gây ra liên kết chéo của protein và axit nucleic, có thể cản trở phân tích phân tử và ảnh hưởng đến độ chính xác của hóa mô miễn dịch và các xét nghiệm khác.

• Mặt nạ kháng nguyên: Quá trình cố định có thể che giấu các vị trí kháng nguyên, làm giảm hiệu quả liên kết kháng thể trong hóa mô miễn dịch và các xét nghiệm miễn dịch khác. Điều này thường đòi hỏi truy xuất kháng nguyên, một quy trình thông qua đó việc che giấu epitope được đảo ngược và liên kết epitope-kháng thể được khôi phục. Tuy nhiên, khả năng kháng nguyên đầy đủ không phải lúc nào cũng có thể được phục hồi.
• Chất lượng cố định thay đổi: Sự khác biệt về thời gian và điều kiện cố định có thể dẫn đến chất lượng mẫu không nhất quán, ảnh hưởng đến khả năng tái tạo và khả năng so sánh của kết quả. Sử dụng các quy trình cố định đáng tin cậy và tránh cố định quá mức và quá mức.
• Tổn thương và phân mảnh DNA: Cố định formalin của các mẫu FFPE có thể gây ra nhiều loại tổn thương DNA khác nhau, bao gồm khử amin cytosine (đột biến C đến T), tổn thương oxy hóa (ví dụ: 8-oxo-guanine dẫn đến đột biến G đến T), cũng như gián đoạn vật lý như vết nứt, khe hở và các vị trí cơ bản cản trở hoạt động của DNA polymerase. Quá trình cố định formalin có thể gây ra sự phân mảnh DNA, làm phức tạp các phân tích di truyền và bộ gen như PCR và giải trình tự.
• Chất lượng RNA: RNA được chiết xuất từ các mô FFPE thường bị phân mảnh và biến đổi về mặt hóa học, gây khó khăn cho việc thực hiện các phân tích phiên mã chất lượng cao.
• Biến đổi protein: Formalin có thể gây ra các biến đổi hóa học trong protein, ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của chúng, có thể cản trở các phân tích proteomi.
• Đồ tạo tác xử lý mẫu: Trong quá trình nhúng và cắt, ứng suất cơ học và nhiệt có thể gây ra hiện vật và gây tổn thương thêm cho mô.
• Sự thay đổi từ lô này sang lô khác: Sự thay đổi trong các giao thức cố định và nhúng giữa các lô khác nhau có thể dẫn đến sự thay đổi đáng kể trong kết quả, làm phức tạp việc so sánh giữa các nghiên cứu.
• Vấn đề lưu trữ: Việc lưu trữ các khối FFPE trong thời gian dài có thể dẫn đến sự suy giảm thêm và mất tính toàn vẹn của axit nucleic theo thời gian, ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của các mẫu lưu trữ cho các nghiên cứu hồi cứu.

Sử dụng các giao thức được tối ưu hóa, xử lý mẫu cẩn thận và áp dụng các kỹ thuật tiên tiến giúp cải thiện chất lượng và độ tin cậy của dữ liệu thu được từ các mô FFPE.

Sự khác biệt giữa FFPE và mô đông lạnh là gì?

Mô FFPE (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) được bảo quản bằng cách sử dụng formalin để cố định mô và sau đó nhúng vào sáp parafin, cho phép bảo quản lâu dài ở nhiệt độ phòng trong khi vẫn duy trì hình thái mô. Ngược lại, mô đông lạnh được bảo quản nhanh chóng bằng cách đông lạnh, giúp duy trì tính toàn vẹn của axit nucleic và protein tốt hơn nhưng cần bảo quản ở nhiệt độ rất thấp.

Những hóa chất nào được sử dụng để nhúng FFPE?

Các hóa chất được sử dụng để nhúng FFPE thường bao gồm formalin để cố định và sáp parafin để nhúng. Đối với nhúng FFPE, các mô thường được cố định bằng cách sử dụng formalin đệm trung tính (FA) 10% (v? v) hoặc dung dịch formaldehyde 4% (w? v) mới chuẩn bị (PFA) được làm từ bột paraformaldehyd. Formalin, là dung dịch formaldehyde trong nước, được đệm đến độ pH trung tính để bảo tồn hình thái mô và ngăn ngừa liên kết ngang quá mức. Dung dịch dựa trên paraformaldehyde cũng cung cấp sự cố định hiệu quả bằng cách liên kết ngang các protein, do đó ổn định cấu trúc mô để nhúng tiếp theo vào sáp parafin. Những hóa chất này rất cần thiết để duy trì tính toàn vẹn và hình thái của mô trong quá trình cố định và nhúng.

Parafin được loại bỏ khỏi mẫu FFPE như thế nào?

Để loại bỏ parafin khỏi các mẫu FFPE, các phần mô thường được trải qua một loạt các lần rửa xylene, sau đó bù nước qua một loạt các loại rượu và cuối cùng là nước. Vì xylene có độc tính cao, gây ra những rủi ro sức khỏe như các vấn đề về hô hấp, kích ứng da và các tác động lâu dài tiềm ẩn khi tiếp xúc nhiều lần, loại bỏ parafin bằng sóng siêu âm đang nổi lên như một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn trong nhiều phòng thí nghiệm. Phương pháp này sử dụng sóng siêu âm cường độ cao để loại bỏ parafin một cách hiệu quả và an toàn mà không cần dung môi độc hại như xylene, do đó giảm rủi ro cho nhân viên phòng thí nghiệm và tạo ra một môi trường làm việc an toàn hơn.

Tôi nên cố định mô của mình trong bao lâu để có chất lượng mẫu FFPE tốt?

Các khuyến cáo chung về thời gian cố định thường đề nghị cố định các mẫu mô trong formalin trong 24 đến 48 giờ. Thời gian này thường đủ để bảo tồn hình thái mô và cấu trúc tế bào trong khi giảm thiểu cố định quá mức, có thể dẫn đến liên kết ngang quá mức và thoái hóa axit nucleic và protein. Tuy nhiên, thời gian cố định tối ưu có thể khác nhau tùy thuộc vào kích thước và loại mô, với các mẫu nhỏ hơn hoặc mỏng manh hơn yêu cầu thời gian cố định ngắn hơn. Điều quan trọng là phải cân bằng sự cố định đầy đủ để ngăn chặn sự tự phân giải và thoái hóa mô đồng thời tránh cố định kéo dài có thể làm phức tạp các phân tích phân tử hạ lưu.