Giao thức sử dụng Máy siêu âm đa mẫu Hielscher trong phân tích màng sinh học và protein

Việc sử dụng máy siêu âm nhiều mẫu, chẳng hạn như Máy siêu âm đa ống VialTweeter và Máy siêu âm tấm UIP400MTP, hợp lý hóa quy trình làm việc trong phòng thí nghiệm cho các ứng dụng thông lượng cao. Cả hai thiết bị đều cho phép xử lý siêu âm chính xác và đồng nhất trên nhiều mẫu, giảm thiểu sự thay đổi và nâng cao khả năng tái tạo. Điều này đặc biệt thuận lợi trong các thí nghiệm yêu cầu ly giải mẫu nhất quán, tách màng sinh học, chiết xuất protein hoặc phân giải protein, trong đó các phương pháp thủ công hoặc một mẫu kém hiệu quả hơn và dễ bị không nhất quán.

Hợp lý hóa quy trình làm việc với Bộ siêu âm đa mẫu

Ví dụ, UIP400MTP cho phép xử lý siêu âm đồng thời các giếng tấm vi mô, đảm bảo sự tách rời đồng đều của màng sinh học hoặc vật liệu tế bào. Trong khi đó, VialTweeter cung cấp khả năng ly giải chính xác và đồng nhất nhiều mẫu ống mà không bị lây nhiễm chéo. Những máy siêu âm này làm giảm đáng kể thời gian xử lý, cải thiện khả năng tái tạo thí nghiệm và duy trì tính toàn vẹn của mẫu cao, khiến chúng trở thành công cụ không thể thiếu trong nghiên cứu vi sinh, proteomics và sinh học phân tử.
Dưới đây là một giao thức chi tiết minh họa cho việc sử dụng các mô hình siêu âm đa mẫu Hielscher, VialTweeter Multi-Tube Sonicator và Microplate Sonicator UIP400MTP, trong một nghiên cứu liên quan đến sự hình thành màng sinh học E. coli và phân tích proteomic sau đó.

Giao thức: Phân tích sự hình thành, tách rời và phân tích proteomi màng sinh học bằng máy siêu âm đa mẫu Hielscher

1. Chuẩn bị nuôi cấy vi khuẩn

• Nuôi cấy vi khuẩn E. coli (chủng W3110) ở 30 °C, nhiệt độ thuận lợi cho sự hình thành màng sinh học E. coli, trong môi trường nước dùng tryptone (TB) chứa:
  – 10 g / L tryptone
  – 5 g / L NaCl
• Bổ sung thuốc kháng sinh khi cần thiết để đảm bảo lưu giữ plasmid.
• Đối với các nghiên cứu hoạt động bằng kính hiển vi và promoter, hãy sử dụng chủng W3110 E. coli với báo cáo GFP tăng cường bộ gen (eGFP) dưới sự kiểm soát của promoter rplL.
• Sử dụng plasmid báo cáo GFP cho các chất xúc tiến khác nhau (ví dụ: csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) để đo lường các hoạt động của người quảng bá.

2. Trồng trọt và tách màng sinh học

• Hạt 1,5 mL vi khuẩn pha loãng cho mỗi giếng vào đĩa 12 giếng (đĩa 12 giếng CellStar, Greiner Bio-One).
• Ủ để cho phép hình thành màng sinh học.
• Loại bỏ nuôi cấy sinh vật phù du (không bám dính) một cách cẩn thận.

– Rửa mỗi giếng với 500 μL PBS.
– Tách các tế bào gắn vào bằng cách siêu âm tấm 12 giếng trong máy siêu âm tấm vi UIP400MTP. UIP400MTP đảm bảo sự tách rời đồng đều bằng cách cung cấp năng lượng siêu âm nhất quán trên tất cả các giếng.
– Cài đặt sonication: 60% amplitude, chế độ chu kỳ: 60 giây BẬT / 30 giây TẮT.

3. Thu hoạch tế bào và ly giải

• Ly tâm các tế bào màng sinh học đã tách ra ở 4.500 g trong 5 phút.
• Rửa các tế bào dạng viên bằng PBS.
• Treo lại các tế bào trong 100 μL natri lauroyl sarcosinate (SLS) 2% và ủ ở 95 ° C trong 15 phút.
• Siêu âm bằng VialTweeter Multi-Tube Sonicator để đảm bảo ly giải tế bào hoàn toàn.
  – Cài đặt sonication: 100% biên độ, 50 giây BẬT / 10 giây TẮT trong tổng thời gian chạy 10 phút; giữ mẫu trên đá.

4. Giảm và Alkyl hóa

• Thêm 5 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) để giảm liên kết disulfide và ủ ở 95 ° C trong 15 phút.
• Protein alkylate với 10 mM iodoacetamide trong 30 phút ở 25°C.

5. Định lượng và tiêu hóa protein

• Máy ly tâm ly giải để loại bỏ các mảnh vụn.
• Định lượng tổng hàm lượng protein bằng Bộ xét nghiệm protein Pierce BCA.
• Tiêu hóa tổng lượng 50 μg protein với 1 μg trypsin trong dung dịch chứa 2% SLS và 100 mM amoni bicarbonate.
• Ủ phản ứng tiêu hóa qua đêm ở 30°C.

6. Thanh lọc peptide

• Kết tủa SLS bằng cách thêm 1,5% axit trifluoroacetic (TFA), sau đó ly tâm.
• Làm sạch peptide bằng cách sử dụng cột microspin C18.
• Làm khô peptide tinh khiết và tạm ngưng lại trong 0,1% TFA.

7. Sắc ký lỏng-Khối phổ (LC-MS / MS)

• Phân tích peptide trên khối phổ Q-Exactive Plus kết hợp với hệ thống nano Ultimate 3000 RSLC.
• Tách các peptide bằng cách sử dụng cột HPLC pha ngược (75 μm × 42 cm) được đóng gói bằng nhựa C18 (2,4 μm).
• Áp dụng gradient từ 2% đến 35% dung môi B (acetonitrile với 0,15% axit formic) trong 140 phút.
• Thu thập dữ liệu bằng cách sử dụng quét MS độ phân giải cao, sau đó là quét MS / MS song song của 10 ion cường độ cao nhất.

8. Phân tích dữ liệu

• Xử lý dữ liệu LC-MS thô bằng phần mềm Progenesis.
• Xuất tệp .mgf và phân tích chúng bằng MASCOT.
• Thực hiện định lượng peptide bằng SafeQuant để kiểm soát chất lượng và điều chỉnh phát hiện sai.
• Tiến hành tất cả các thí nghiệm trùng lặp hoặc ba lần để đảm bảo khả năng tái tạo.

Máy siêu âm đa mẫu để chuẩn bị mẫu thông lượng cao

Các mô hình siêu âm đa mẫu VialTweeter và UIP400MTP nâng cao đáng kể độ chính xác và hiệu quả của quy trình làm việc thí nghiệm, đặc biệt là trong nghiên cứu màng sinh học và proteomics. Khả năng xử lý đồng nhất nhiều mẫu đảm bảo công suất thông lượng cao mà không ảnh hưởng đến chất lượng dữ liệu. Những lợi ích này, kết hợp với quy trình làm việc hợp lý được nêu ở trên, làm cho máy siêu âm nhiều mẫu Hielscher trở thành công cụ cần thiết cho nghiên cứu sinh học hiện đại.

Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng Sản xuất tại Đức

Hielscher ultrasonicators nổi tiếng với chất lượng cao nhất và tiêu chuẩn thiết kế của họ. Mạnh mẽ và hoạt động dễ dàng cho phép tích hợp trơn tru của ultrasonicators của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi dễ dàng được xử lý bởi Hielscher ultrasonicators.

Hielscher Ultrasonics là một công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt nhấn mạnh vào ultrasonicators hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, Hielscher ultrasonicators là CE tuân thủ và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.