Quy trình nuôi cấy và tách màng sinh học Staphylococcus
Các phương pháp được chuẩn hóa là yếu tố thiết yếu để có được kết quả nghiên cứu đáng tin cậy. Tại đây, bạn có thể tìm thấy quy trình nuôi cấy và tách màng sinh học của tụ cầu khuẩn. Quy trình này tập trung vào việc tinh giản quá trình chuẩn bị mẫu với thông lượng cao bằng thiết bị siêu âm đĩa đa giếng UIP400MTP để tách màng sinh học hiệu quả với thông lượng cao trong đĩa 96 giếng. Quy trình cũng bao gồm các bước chính để nuôi cấy, rửa và quan sát màng sinh học, chú trọng giảm thiểu sự biến thiên và bảo đảm khả năng tái lập.
Nghiên cứu màng sinh học Staphylococcus và kháng sinh
Màng sinh học Staphylococcus đóng vai trò quan trọng trong các tình trạng nhiễm trùng dai dẳng do khả năng đề kháng kháng sinh và chống lại các đáp ứng miễn dịch. Sự hình thành màng sinh học tạo ra môi trường bảo vệ vi khuẩn, khiến các tình trạng nhiễm trùng khó điều trị. Nghiên cứu về màng sinh học thường tập trung tìm hiểu sự hình thành, hành vi và tính nhạy cảm của chúng với các tác nhân kháng vi sinh vật, chú trọng các phương pháp có thông lượng cao để tinh giản quy trình thực nghiệm.
Thiết bị siêu âm đĩa đa giếng UIP400MTP mang lại lợi thế đáng kể trong nghiên cứu màng sinh học nhờ cho phép tách màng sinh học khỏi đĩa 96 giếng nhanh chóng và hiệu quả. Thiết bị này cung cấp năng lượng siêu âm đồng đều đến tất cả các giếng, bảo đảm kết quả nhất quán đồng thời giảm thiểu sự biến thiên.
Quy trình nuôi cấy và tách màng sinh học Staphylococcus
Dưới đây, chúng tôi hướng dẫn bạn từng bước trong quá trình nuôi cấy và tách màng sinh học Staphylococcus. Để minh họa một bước phân tích, chúng tôi trình bày cách định lượng sinh khối đã nuôi cấy bằng phương pháp đo quang phổ sau khi nhuộm tím tinh thể.
Nuôi cấy màng sinh học Staphylococcus
Vật liệu cần thiết:
- Đĩa vi chuẩn độ polystyrene 96 giếng đáy phẳng vô trùng, có nắp đậy, có bề mặt được xử lý để nuôi cấy mô
- Môi trường canh thang đậu nành tryptic (TSB) chứa 0,25% glucose
- Tủ an toàn sinh học
Các bước:
- Chuẩn bị môi trường làm việc vô trùng trong tủ an toàn sinh học để giảm thiểu nhiễm bẩn.
- Thêm TSB chứa 0,25% glucose vào các giếng của đĩa vi chuẩn độ. TSB không chứa glucose thường không hỗ trợ sự hình thành màng sinh học và chỉ nên được dùng làm đối chứng nếu cần.
- Cấy vào các giếng các chủng vi khuẩn được chuẩn bị như mô tả dưới đây:
- Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn, bảo đảm không có các cụm tế bào tồn tại sẵn bằng cách đồng nhất hóa huyền phù bằng siêu âm hoặc phá vỡ các cụm bằng kim cỡ 23 gauge và trộn vortex trong thời gian ngắn.
- Đậy kín đĩa bằng nắp và ủ trong điều kiện tối ưu cho sự hình thành màng sinh học (ví dụ: 37°C trong 24 giờ).
- Thực hiện thí nghiệm với ba lần lặp cho mỗi chủng vi khuẩn (ba giếng cho mỗi chủng) để bảo đảm độ tin cậy.
- Dành sáu giếng trên mỗi đĩa làm đối chứng âm. Có thể thử nghiệm tối đa 30 chủng trên mỗi đĩa 96 giếng.
Quan sát và rửa màng sinh học
- Sau khi ủ, cẩn thận loại bỏ môi trường để tránh làm xáo trộn màng sinh học.
- Rửa mỗi giếng bốn lần bằng nước muối sinh lý để loại bỏ vi khuẩn sống trôi nổi.
- Kiểm tra đáy các giếng để tìm các mảng trắng cho thấy sự hiện diện của màng sinh học.
Tách màng sinh học bằng thiết bị siêu âm đĩa đa giếng UIP400MTP
Thiết lập thiết bị và thông số:
- Thiết bị siêu âm đĩa đa giếng UIP400MTP
- Cài đặt vận hành: biên độ 60%, chế độ chu kỳ với 60 giây BẬT / 30 giây TẮT
Các bước:
- Đặt đĩa vi chuẩn độ đã rửa lên bệ của UIP400MTP.
- Xử lý các mẫu bằng siêu âm theo các cài đặt được khuyến nghị (biên độ 60%, BẬT 60 giây, TẮT 30 giây). Điều chỉnh cài đặt cho phù hợp với chủng vi khuẩn.
- Khởi động quá trình xử lý siêu âm để tách màng sinh học. Sóng siêu âm phá vỡ chất nền của màng sinh học, giải phóng các vi khuẩn bám dính.
- UIP400MTP bảo đảm tất cả các giếng được tiếp xúc với siêu âm đồng đều để đạt kết quả tách nhất quán.
Vi khuẩn Staphylococcus
Bước phân tích: Định lượng sinh khối màng sinh học Staphylococcus đã tách bằng tím tinh thể (CV)
Vật liệu cần thiết:
- Dung dịch tím tinh thể (CV) 0,1%
- Ethanol 95% hoặc axit axetic 30% (để hòa tan)
- Máy đọc vi đĩa có khả năng đo ở bước sóng 570 nm
- Vi đĩa chuẩn độ vô trùng dùng để nhuộm
Các bước:
- Chuẩn bị đĩa nhuộm: Chuyển 100 µL huyền phù màng sinh học đã tách khỏi bề mặt từ mỗi giếng của đĩa đã xử lý siêu âm sang các giếng tương ứng của một vi đĩa chuẩn độ 96 giếng sạch, vô trùng. Điều này bảo đảm môi trường sạch và đồng nhất cho quá trình nhuộm.
- Nhuộm màng sinh học đã tách khỏi bề mặt: Thêm 150 µL dung dịch tím tinh thể 0,1% vào mỗi giếng chứa huyền phù màng sinh học đã tách khỏi bề mặt. Nhẹ nhàng hút nhả bằng pipet để bảo đảm huyền phù màng sinh học và tím tinh thể được trộn đều.
- Ủ: Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 phút để tím tinh thể nhuộm sinh khối hiệu quả.
- Rửa: Sau khi ủ, cẩn thận loại bỏ dung dịch tím tinh thể khỏi các giếng mà không làm xáo trộn sinh khối. Rửa mỗi giếng ba lần bằng nước muối sinh lý vô trùng để loại bỏ thuốc nhuộm không liên kết.
- Làm khô: Để đĩa khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng hoặc dưới tủ dòng khí vô trùng. Tránh gia nhiệt vì điều này có thể làm thay đổi kết quả.
- Hòa tan: Thêm 200 µL ethanol 95% (hoặc axit axetic 30%, tùy theo quy trình thực hành tiêu chuẩn của phòng thí nghiệm) vào mỗi giếng để hòa tan tím tinh thể đã liên kết. Trộn nhẹ bằng cách hút nhả bằng pipet hoặc lắc đĩa trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Đo: Đo mật độ quang (OD) của dung dịch tím tinh thể đã hòa tan ở bước sóng 570 nm bằng máy đọc vi đĩa.
- Phân tích dữ liệu: Lấy giá trị OD570 của các giếng thí nghiệm trừ đi giá trị OD570 trung bình của các mẫu đối chứng âm (các giếng có TSB nhưng không có dịch cấy vi khuẩn) để hiệu chỉnh màu nhuộm nền. Ghi lại và phân tích dữ liệu.
Lưu ý: Thực hiện thí nghiệm với ba lần lặp lại cho mỗi điều kiện để bảo đảm khả năng tái lập. Bảo đảm thao tác đúng cách với tím tinh thể và ethanol, tuân thủ các quy trình an toàn và thải bỏ.
Tổng quan các lợi ích chính của UIP400MTP:
- Xử lý mẫu với năng suất cao: Được thiết kế chuyên biệt cho đĩa nhiều giếng, cho phép bạn xử lý đồng thời nhiều mẫu.
- Phân bố siêu âm đồng đều: Bảo đảm cường độ siêu âm như nhau giữa các giếng, mang lại kết quả nhất quán cho tất cả các mẫu.
- Sử dụng bất kỳ đĩa tiêu chuẩn nào: UIP400MTP có thể xử lý bất kỳ đĩa nhiều giếng tiêu chuẩn nào, đĩa Petri và giá đỡ ống. Không cần các đĩa độc quyền đắt tiền!
- Giao diện thân thiện với người dùng: Dễ thiết lập và điều khiển, là công cụ tuyệt vời để tăng năng suất phòng thí nghiệm. Các chế độ cài đặt có thể lập trình và khả năng tự động hóa giúp chuẩn hóa quy trình!
Tách màng sinh học khỏi bề mặt với năng suất cao bằng máy siêu âm đĩa 96 giếng UIP400MTP
Tài liệu / Tài liệu tham khảo
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Các câu hỏi thường gặp
Các chất polyme ngoại bào (EPS) là gì?
Các chất polyme ngoại bào (EPS) là hỗn hợp phức tạp của các polyme sinh học, chủ yếu gồm polysaccharide, protein, axit nucleic và lipid, do các vi sinh vật trong màng sinh học tiết ra. EPS tạo thành một chất nền bảo vệ bao bọc quần xã vi sinh vật, bảo đảm tính toàn vẹn cấu trúc, làm trung gian cho sự bám dính vào bề mặt và bảo vệ tế bào khỏi các tác nhân gây stress từ môi trường, bao gồm kháng sinh và các đáp ứng miễn dịch.
Vi khuẩn phù du có nghĩa là gì?
Vi khuẩn phù du là các vi sinh vật đơn bào trôi nổi tự do, tồn tại ở dạng huyền phù, chẳng hạn trong môi trường nuôi cấy lỏng hoặc dịch cơ thể, thay vì bám vào bề mặt hoặc hình thành các quần xã có cấu trúc như màng sinh học.
Màng sinh học và vi khuẩn phù du khác nhau như thế nào?
Sự khác biệt chính giữa màng sinh học và vi khuẩn phù du nằm ở cách tổ chức của chúng. Màng sinh học là các quần xã vi khuẩn có cấu trúc, bám vào bề mặt và nằm trong chất nền gồm các chất polyme ngoại bào (EPS), trong khi vi khuẩn phù du trôi nổi tự do và không có kiểu tổ chức cấu trúc như vậy.
Vi khuẩn trong màng sinh học có khó điều trị bằng kháng sinh hơn vi khuẩn phù du không?
Vi khuẩn trong màng sinh học khó điều trị bằng kháng sinh hơn đáng kể so với vi khuẩn sống tự do. Chất nền của màng sinh học đóng vai trò như một hàng rào vật lý, còn vi khuẩn bên trong có trạng thái chuyển hóa thay đổi và khả năng chống chịu stress tăng lên, góp phần làm giảm hiệu quả của kháng sinh.
Có thể tiêu diệt màng sinh học bằng kháng sinh không?
Đôi khi có thể loại bỏ hoàn toàn màng sinh học bằng kháng sinh, nhưng điều này rất khó khăn. Việc điều trị hiệu quả thường đòi hỏi nồng độ kháng sinh cao, các phối hợp cụ thể hoặc liệu pháp bổ trợ, vì chất nền EPS và các cơ chế đề kháng của vi khuẩn bảo vệ màng sinh học.
Staphylococcus có phải là vi khuẩn có khả năng bám dính không?
Vi khuẩn Staphylococcus nổi tiếng về khả năng bám dính. Chúng dễ dàng bám vào các bề mặt và hình thành màng sinh học, đặc biệt trên thiết bị y tế hoặc mô của vật chủ, khiến chúng trở thành một tác nhân chính gây nhiễm trùng dai dẳng.
Có những loại vi khuẩn Staphylococcus nào?
Vi khuẩn Staphylococcus gồm nhiều loại, trong đó đáng chú ý nhất là Staphylococcus aureus và Staphylococcus epidermidis. S. aureus có khả năng gây bệnh và có thể gây nhiễm trùng nặng, trong khi S. epidermidis thường liên quan đến nhiễm trùng thiết bị do màng sinh học.
Tím tinh thể là gì?
Tím tinh thể là một thuốc nhuộm bazơ thường được dùng để nhuộm vật liệu sinh học. Trong vi sinh học, thuốc nhuộm này được dùng để đánh giá sự hình thành màng sinh học bằng cách nhuộm sinh khối, sau đó có thể định lượng sinh khối bằng phương pháp quang phổ.
Hielscher Ultrasonics sản xuất máy đồng nhất siêu âm hiệu suất cao từ quy mô phòng thí nghiệm đến quy mô công nghiệp.