Quy trình thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dựa trên màng sinh học là phương pháp thiết yếu để đánh giá hiệu quả của các tác nhân kháng vi sinh vật đối với vi sinh vật gắn với màng sinh học, vốn có khả năng đề kháng cao hơn nhờ chất nền ngoại bào bảo vệ chúng. Một bước then chốt trong thử nghiệm này là tách các cấu trúc màng sinh học để giải phóng các tế bào nằm bên trong nhằm đánh giá chính xác khả năng sống của tế bào. Máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP hỗ trợ quá trình này bằng cách sử dụng siêu âm hội tụ để tạo ra hiện tượng xâm thực có kiểm soát, tách hiệu quả các tế bào màng sinh học và phân tán chúng thành huyền phù đồng nhất. Việc phá vỡ màng sinh học chính xác và có khả năng tái lập này nâng cao độ tin cậy và năng suất xử lý mẫu của các thử nghiệm MIC, khiến UIP400MTP trở thành công cụ thiết yếu để thúc đẩy nghiên cứu màng sinh học.

Tại sao tôi nên sử dụng siêu âm trong các thử nghiệm MIC?

• Dữ liệu chính xác, có khả năng tái lập: Thu được các huyền phù tế bào đồng nhất, loại bỏ tác dụng che chắn của chất nền, bảo đảm số lượng khuẩn lạc và kết quả đo mật độ quang phản ánh đúng hiệu quả kháng vi sinh vật.
• Hiệu quả xử lý mẫu với năng suất cao: Xử lý đồng thời toàn bộ đĩa 96 giếng chỉ trong 1–3 phút, thay thế thao tác cạo thủ công chậm và thiếu nhất quán bằng quy trình làm việc tinh gọn.
• Bảo toàn khả năng sống của tế bào: Nhẹ nhàng tách các tế bào nằm trong màng sinh học mà không gây tổn thương vật lý như khi cạo, duy trì tỷ lệ sống cao hơn để tính toán MIC/MBEC đáng tin cậy.
• Không có nguy cơ nhiễm chéo: Tận dụng thiết kế đầu siêu âm dạng cốc không tiếp xúc, xử lý đồng đều tất cả các giếng mà không để đầu dò chạm vào từng mẫu hoặc giếng.
• Sẵn sàng đáp ứng tiêu chuẩn: Điều chỉnh phương pháp của bạn theo các quy trình đã được thẩm định trong ngành như ASTM E2799-22, giúp dữ liệu có độ tin cậy cao hơn khi dùng cho mục đích đáp ứng yêu cầu quản lý hoặc công bố.
• Tự tin sàng lọc thuốc và phương pháp điều trị: Tin tưởng vào kết quả đánh giá độ nhạy cảm để đưa ra quyết định sáng suốt hơn về hiệu quả kháng vi sinh vật, xác định đặc điểm đề kháng hoặc phát triển liệu pháp.

Siêu âm để tách màng sinh học

Thử nghiệm MIC dựa trên màng sinh học thường đo khả năng sống của vi khuẩn hoặc mức độ ức chế sinh trưởng bằng các phương pháp như cấy đĩa, đếm khuẩn lạc hoặc đo mật độ quang. Xử lý siêu âm là bước then chốt trong các thử nghiệm MIC dựa trên màng sinh học khi đánh giá độ nhạy cảm với tác nhân kháng vi sinh vật của các vi sinh vật gắn với màng sinh học. Chức năng chính của bước này là tách và phân tán các tế bào nằm trong chất nền màng sinh học thành huyền phù đồng nhất để phân tích chính xác.
Màng sinh học có khả năng đề kháng với các tác nhân kháng vi sinh vật cao hơn đáng kể so với các tế bào sống tự do, vì vậy việc tách đúng cách là yếu tố then chốt để phân tích chính xác. Trong quá trình này, sóng siêu âm tạo ra hiện tượng xâm thực có kiểm soát, phá vỡ chất nền màng sinh học và giải phóng các tế bào nằm bên trong thành huyền phù đồng nhất trong môi trường phục hồi. Bước này cho phép đánh giá chính xác khả năng sống của các tế bào được phân tán từ màng sinh học thông qua các phương pháp như cấy đĩa, pha loãng và đếm khuẩn lạc. Việc phá vỡ màng sinh học đúng cách bằng siêu âm ngăn các thành phần chất nền còn sót lại che chắn tế bào, vì sự che chắn này có thể dẫn đến việc đánh giá thấp hoạt tính kháng vi sinh vật. Máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP đặc biệt phù hợp cho mục đích này, cung cấp các điều kiện xử lý siêu âm chính xác và có khả năng tái lập để bảo đảm việc chuẩn bị đĩa thử nghiệm đáng tin cậy với năng suất xử lý mẫu cao.

Tại sao siêu âm là cần thiết trong các thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu dựa trên màng sinh học

Để đo khả năng sống và đếm tế bào, cần tách và phân tán hoàn toàn, đáng tin cậy các tế bào riêng lẻ. UIP400MTP thúc đẩy quá trình tách màng sinh học và phân tán tế bào đồng đều, không gây tổn thương, giúp thu được kết quả thử nghiệm vững chắc.

• Tính phức tạp của màng sinh học: Màng sinh học là các cộng đồng vi sinh vật có cấu trúc, được bao bọc trong một chất nền gồm các chất polyme ngoại bào (EPS), giúp bảo vệ vi sinh vật và làm tăng khả năng đề kháng của chúng với các tác nhân kháng vi sinh vật.
• Phân tán đồng đều: Để đo chính xác khả năng sống của các tế bào nằm trong màng sinh học hoặc độ nhạy của chúng với các tác nhân kháng vi sinh vật, trước tiên phải tách màng sinh học khỏi bề mặt và phá vỡ thành một huyền phù đồng nhất.

Quy trình thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu dựa trên màng sinh học

Phép thử nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) xác định nồng độ thấp nhất của một tác nhân kháng vi sinh vật cần thiết để ức chế sự phát triển có thể quan sát được của vi sinh vật. Quy trình này được thiết kế cho các vi sinh vật liên quan đến màng sinh học, sử dụng máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP để phá vỡ màng sinh học.

Bước 1: Chuẩn bị dịch cấy vi khuẩn

1. Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn:
   Nuôi vi khuẩn trong môi trường thích hợp đến giữa pha tăng trưởng lũy thừa.
   Pha loãng dịch nuôi cấy để đạt mật độ tế bào chuẩn hóa (ví dụ: chuẩn McFarland 0,5 hoặc OD600 ~0,1).
2. Chuẩn bị các dung dịch kháng vi sinh vật:
   Pha loãng tác nhân kháng vi sinh vật trong môi trường thích hợp để tạo một dãy nồng độ (ví dụ: pha loãng nối tiếp với hệ số 2).
3. Phân phối vào đĩa 96 giếng:
   Thêm các dung dịch kháng vi sinh vật vào các giếng của đĩa 96 giếng tiêu chuẩn, với thể tích cuối cùng trong mỗi giếng là ~150–200 µL.
   Bố trí các mẫu đối chứng tăng trưởng (không có tác nhân kháng vi sinh vật) và đối chứng vô trùng (không có dịch cấy vi khuẩn).

Bước 2: Hình thành màng sinh học trên nắp có chốt

• Lắp nắp có chốt:
  Đặt nắp có chốt chuyên dụng lên các giếng đã cấy vi khuẩn, đảm bảo các chốt ngập hoàn toàn trong huyền phù vi khuẩn.
• Ủ đĩa:
  Ủ ở nhiệt độ thích hợp (ví dụ: 37°C) trong thời gian quy định (ví dụ: 24 giờ) trong điều kiện tĩnh để màng sinh học hình thành trên các chốt.

Bước 3: Tiếp xúc với tác nhân kháng vi sinh vật

• Rửa các chốt:
  Lấy nắp có chốt ra khỏi huyền phù vi khuẩn và rửa nhẹ bằng dung dịch nước muối vô trùng hoặc PBS để loại bỏ các tế bào sống trôi nổi bám lỏng lẻo.
• Cho tiếp xúc với các tác nhân kháng vi sinh vật:
  Chuyển nắp có chốt sang một đĩa 96 giếng mới chứa các dung dịch kháng vi sinh vật đã pha loãng trước đó.
  Ủ trong một khoảng thời gian xác định (ví dụ: 24 giờ) trong điều kiện tĩnh để tác nhân kháng vi sinh vật tác động lên các màng sinh học.

Bước 4: Xử lý siêu âm bằng máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP

Bước xử lý siêu âm đóng vai trò then chốt trong việc tách màng sinh học khỏi các nắp có chốt để đánh giá khả năng sống. Thực hiện các bước sau với máy siêu âm UIP400MTP:

1. Chuẩn bị hệ thống:
   Cho môi trường phục hồi (ví dụ: canh thang trung hòa hoặc môi trường nuôi cấy vô trùng) vào từng giếng của một đĩa 96 giếng mới.
2. Chuyển nắp có chốt:
   Lấy nắp có chốt ra khỏi đĩa xử lý bằng tác nhân kháng vi sinh vật.
   Rửa nắp có chốt bằng dung dịch nước muối vô trùng hoặc PBS để loại bỏ các tác nhân kháng vi sinh vật còn dư.
3. Đặt đĩa vào máy siêu âm:
   Lắp nắp có chốt lên đĩa chứa môi trường phục hồi.
   Đặt đĩa chứa môi trường phục hồi vào máy siêu âm UIP400MTP, đảm bảo đĩa nằm chính giữa và ổn định như mô tả trong hướng dẫn sử dụng.
4. Điều chỉnh các thông số xử lý siêu âm:
   Thiết lập các thông số xử lý siêu âm trên UIP400MTP (có thể điều chỉnh các thiết lập cho phù hợp với màng sinh học):
   Biên độ: 70–100%.
   Thời gian xử lý siêu âm: 1–3 phút (điều chỉnh dựa trên cấu trúc màng sinh học) ở chế độ chu kỳ.
5. Xử lý siêu âm:
   Bắt đầu quá trình xử lý siêu âm. Sóng siêu âm sẽ phá vỡ chất nền của màng sinh học và tách các tế bào vào môi trường phục hồi.
6. Theo dõi quá trình:
   Sử dụng cảm biến nhiệt độ dạng cắm để theo dõi nhiệt độ mẫu trong các giếng. Có thể kết nối UIP400MTP với máy làm lạnh phòng thí nghiệm để làm mát.
7. Xử lý sau siêu âm:
   Chuyển ngay môi trường phục hồi chứa các màng sinh học đã được tách ra sang một đĩa vô trùng mới để phân tích tiếp theo.

(A) Đĩa chứa TSB với 2% glucose được sử dụng để hình thành màng sinh học, thu hồi tế bào và xác định MIC và MBEC; (B) Nắp có chốt để hình thành màng sinh học của tụ cầu khuẩn.
Các tế bào màng sinh học hình thành trên các chốt được tách ra bằng xử lý siêu âm (Hielscher Ultrasound Technology) trong 5 min trong các đĩa 96 giếng chứa môi trường nuôi cấy mới để thu hồi tế bào.
(Hình ảnh và nghiên cứu: ©de Oliveira et al., 2016)

Bước 4: Đánh giá khả năng sống

Cấy đĩa và nuôi cấy các màng sinh học đã tách:

1. Thực hiện pha loãng nối tiếp môi trường thu hồi và cấy lên thạch để đếm các đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU).
2. Đánh giá MIC:
   Xác định MIC là nồng độ chất kháng vi sinh vật thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển có thể quan sát được của vi sinh vật trong môi trường thu hồi.

MIC – Nồng độ ức chế tối thiểu: Ví dụ về đĩa vi chuẩn độ và cách diễn giải kết quả vi pha loãng.
(Nghiên cứu và hình ảnh: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Ai được hưởng lợi từ việc xử lý siêu âm trong các phép thử MIC?

• Các nhà sản xuất thiết bị y tế: Để kiểm tra hiệu quả của các lớp phủ bề mặt và thẩm định quy trình làm sạch cho các thiết bị dễ hình thành màng sinh học.
• Các nhà vi sinh học lâm sàng: Để chẩn đoán chính xác các nhiễm trùng liên quan đến vật cấy ghép (như PJI) bằng cách thu hồi vi khuẩn từ các dụng cụ và bộ phận y tế.
• Các nhà phát triển dược phẩm: Để đánh giá hiệu quả của các chất kháng vi sinh vật mới đối với các tác nhân gây bệnh có sức chống chịu cao nằm trong màng sinh học.
• Các nhà nghiên cứu học thuật: Để thực hiện các nghiên cứu có năng suất xử lý mẫu cao và khả năng tái lập về sinh học màng sinh học và cơ chế đề kháng với chất kháng vi sinh vật.
• Các nhóm kiểm soát chất lượng công nghiệp: Để đánh giá sự bám bẩn sinh học và hiệu quả của chất khử trùng trong môi trường công nghiệp (ví dụ: sử dụng các tiêu chuẩn ASTM E2799-22).

Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng sản xuất tại Đức

Các thiết bị siêu âm Hielscher nổi tiếng với các tiêu chuẩn cao nhất về chất lượng và thiết kế. Độ bền và khả năng vận hành dễ dàng cho phép tích hợp thuận lợi các thiết bị siêu âm của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Các thiết bị siêu âm Hielscher dễ dàng đáp ứng những điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi cao.

Hielscher Ultrasonics là công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt chú trọng đến các thiết bị siêu âm hiệu năng cao với công nghệ tiên tiến nhất và tính thân thiện với người dùng. Tất nhiên, các thiết bị siêu âm Hielscher tuân thủ CE và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.

Đọc tại đây về cách sử dụng UIP400MTP để tách màng sinh học trong quy trình ASTM E2799 – Kiểm tra hiệu quả của chất khử trùng đối với màng sinh học Pseudomonas aeruginosa bằng phép thử MBEC.