Giao thức xét nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Xét nghiệm Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dựa trên màng sinh học là một phương pháp cần thiết để đánh giá hiệu quả của các chất kháng khuẩn chống lại các vi sinh vật liên quan đến màng sinh học, thể hiện khả năng kháng cao do ma trận ngoại bào bảo vệ của chúng. Một bước quan trọng trong xét nghiệm này là phá vỡ cấu trúc màng sinh học để giải phóng các tế bào nhúng để đánh giá khả năng tồn tại chính xác. Máy siêu âm tấm đa giếng UIP400MTP tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình này bằng cách sử dụng siêu âm hội tụ để tạo ra sự xâm thực có kiểm soát, tách các tế bào màng sinh học một cách hiệu quả và phân tán chúng thành hỗn dịch đồng nhất. Sự phá vỡ màng sinh học chính xác và có thể tái tạo này giúp tăng cường độ tin cậy và thông lượng của các xét nghiệm MIC, làm cho UIP400MTP trở thành một công cụ thiết yếu trong việc thúc đẩy nghiên cứu màng sinh học.
Siêu âm cho tách màng sinh học
Xét nghiệm MIC dựa trên màng sinh học thường đo khả năng tồn tại của vi khuẩn hoặc ức chế sự phát triển bằng các phương pháp như mạ, đếm khuẩn lạc hoặc đo mật độ quang học. Siêu âm là một bước quan trọng trong các xét nghiệm MIC dựa trên màng sinh học khi đánh giá tính nhạy cảm với kháng khuẩn của vi sinh vật liên quan đến màng sinh học. Chức năng chính của nó là tách và phân tán các tế bào nhúng trong ma trận màng sinh học thành một huyền phù đồng nhất để phân tích chính xác.
Màng sinh học có khả năng chống lại các chất kháng khuẩn cao hơn đáng kể so với tế bào sinh vật phù du, làm cho việc tách thích hợp trở nên quan trọng để phân tích chính xác. Trong quá trình này, sóng siêu âm tạo ra sự xâm thực có kiểm soát, phá vỡ ma trận màng sinh học và giải phóng các tế bào nhúng thành huyền phù đồng nhất trong môi trường phục hồi. Bước này cho phép đánh giá chính xác khả năng tồn tại của các tế bào phân tán màng sinh học thông qua các phương pháp như mạ, pha loãng và đếm khuẩn lạc. Sự phá vỡ màng sinh học thích hợp thông qua siêu âm ngăn các thành phần ma trận còn sót lại che chắn tế bào, nếu không có thể dẫn đến đánh giá thấp hoạt động kháng khuẩn. Máy siêu âm đĩa đa giếng UIP400MTP đặc biệt phù hợp cho mục đích này, cung cấp các điều kiện siêu âm chính xác và có thể tái tạo để đảm bảo chuẩn bị các tấm xét nghiệm đáng tin cậy và thông lượng cao.
UIP400MTP siêu âm tấm vi mô để tách màng sinh học có thể kiểm soát chính xác trong các xét nghiệm MIC và MBEC.
Tại sao Sonication là cần thiết trong các xét nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu dựa trên màng sinh học
Để đo khả năng tồn tại và đếm tế bào, cần phải tách và phân tán các tế bào đơn lẻ hoàn chỉnh và đáng tin cậy. UIP400MTP thúc đẩy sự tách màng sinh học đồng đều, không gây hại và phân tán tế bào để có kết quả xét nghiệm mạnh mẽ.
- Độ phức tạp màng sinh học: Màng sinh học là các quần thể vi sinh vật có cấu trúc được bao bọc trong ma trận chất polyme ngoại bào (EPS), giúp bảo vệ vi sinh vật và làm cho chúng có khả năng chống lại các chất kháng khuẩn tốt hơn.
- Phân tán đồng đều: Để đo lường chính xác khả năng tồn tại của các tế bào nhúng màng sinh học hoặc tính nhạy cảm của chúng với thuốc kháng sinh, trước tiên màng sinh học phải được đánh bật và phân hủy thành hỗn dịch đồng nhất.
Giao thức xét nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu dựa trên màng sinh học
Xét nghiệm Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) xác định nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn cần thiết để ức chế sự phát triển có thể nhìn thấy của vi sinh vật. Giao thức này được thiết kế cho các vi sinh vật liên quan đến màng sinh học, sử dụng UIP400MTP siêu âm tấm nhiều giếng để phá vỡ màng sinh học.
Bước 1: Chuẩn bị cấy vi khuẩn
- Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn:
Phát triển vi khuẩn trong môi trường thích hợp đến giai đoạn giữa logarit.
Pha loãng môi trường nuôi cấy để đạt được mật độ tế bào tiêu chuẩn (ví dụ: 0,5 tiêu chuẩn McFarland hoặc OD600 ~ 0,1). - Chuẩn bị dung dịch kháng khuẩn:
Pha loãng chất kháng khuẩn trong môi trường thích hợp để tạo ra một loạt các nồng độ (ví dụ: pha loãng nối tiếp gấp đôi). - Phân phối vào tấm 96well:
Thêm dung dịch kháng khuẩn vào các giếng của đĩa 96 giếng tiêu chuẩn, với thể tích giếng cuối cùng là ~ 150–200 μL.
Bao gồm kiểm soát tăng trưởng (không kháng khuẩn) và kiểm soát vô trùng (không cấy vi khuẩn).
Bước 2: Hình thành màng sinh học trên nắp chốt
- Gắn nắp chốt:
Đặt nắp chốt chuyên dụng lên các giếng đã cấy, đảm bảo các chốt được ngập hoàn toàn trong hỗn dịch vi khuẩn. - Ủ đĩa:
Ủ ở nhiệt độ thích hợp (ví dụ: 37 ° C) trong một khoảng thời gian xác định (ví dụ: 24 giờ) trong điều kiện tĩnh để cho phép hình thành màng sinh học trên chốt. - Rửa sạch các chốt:
Tháo nắp chốt ra khỏi hỗn dịch vi khuẩn và nhẹ nhàng rửa sạch bằng nước muối vô trùng hoặc PBS để loại bỏ các tế bào sinh vật phù du bám lỏng lẻo. - Tiếp xúc với thuốc kháng sinh:
Chuyển nắp chốt vào một đĩa 96giếng mới có chứa các chất pha loãng kháng khuẩn đã chuẩn bị trước đó.
Ủ trong một khoảng thời gian xác định (ví dụ: 24 giờ) trong điều kiện tĩnh để cho phép chất kháng khuẩn tác động lên màng sinh học.
Bước 3: Tiếp xúc với kháng khuẩn
Sonicator tấm đa giếng UIP400MTP để chuẩn bị mẫu thông lượng cao
Bước 4: Siêu âm bằng máy siêu âm tấm siêu âm UIP400MTP
Bước siêu âm là rất quan trọng để tách màng sinh học ra khỏi nắp chốt để đánh giá khả năng tồn tại. Làm theo các bước sau cho máy siêu âm UIP400MTP:
- Chuẩn bị thiết lập:
Đổ đầy môi trường thu hồi (ví dụ: nước dùng trung hòa hoặc môi trường tăng trưởng vô trùng) vào đĩa 96 giếng tươi trong mỗi giếng. - Chuyển nắp chốt:
Tháo nắp chốt ra khỏi tấm xử lý kháng khuẩn.
Rửa sạch nắp chốt bằng nước muối vô trùng hoặc PBS để loại bỏ các chất kháng khuẩn còn sót lại. - Định vị tấm trong máy siêu âm:
Gắn nắp chốt vào đĩa môi trường phục hồi.
Đặt tấm môi trường thu hồi vào máy siêu âm UIP400MTP, đảm bảo tấm nằm ở giữa và ổn định như trong sách hướng dẫn được mô tả. - Điều chỉnh các thông số siêu âm:
Đặt các thông số siêu âm ở UIP400MTP (cài đặt có thể được điều chỉnh theo màng sinh học):
Biên độ: 70–100%.
Thời gian siêu âm: 1–3 phút (điều chỉnh dựa trên cấu trúc màng sinh học) ở chế độ chu kỳ. - Siêu âm:
Bắt đầu quá trình siêu âm. Sóng siêu âm sẽ phá vỡ ma trận màng sinh học và đánh bật các tế bào vào môi trường phục hồi. - Giám sát quá trình:
Sử dụng cảm biến nhiệt độ có thể cắm được để theo dõi sample nhiệt độ trong giếng. UIP400MTP có thể được kết nối với máy làm lạnh trong phòng thí nghiệm để làm mát. - Xử lý sau sonication:
Chuyển ngay môi trường thu hồi có chứa màng sinh học đã tách ra vào một đĩa vô trùng mới để phân tích tiếp theo.
(A) Đĩa chứa TSB với 2% glucose được sử dụng để hình thành màng sinh học, phục hồi tế bào và xác định MIC và MBEC; (B) Nắp có chốt để hình thành màng sinh học tụ cầu.
Các tế bào màng sinh học được hình thành trên các chốt được đánh bật bằng cách siêu âm (Công nghệ siêu âm Hielscher) trong 5 phút trong các đĩa 96 giếng có chứa môi trường nuôi cấy tươi để phục hồi tế bào.
(Hình ảnh và nghiên cứu: ©de Oliveira et al., 2016)
Bước 4: Đánh giá khả năng tồn tại
Màng sinh học tách rời đĩa và nuôi cấy:
- Thực hiện pha loãng nối tiếp môi trường thu hồi và đĩa lên thạch để liệt kê các đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU).
- Đánh giá MIC:
Xác định MIC là nồng độ kháng khuẩn thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật có thể nhìn thấy trong môi trường thu hồi.
Nồng độ ức chế tối thiểu MIC: Ví dụ về đĩa microtiter và giải thích kết quả pha loãng vi mô.
(Nghiên cứu và hình ảnh: ©Jaskiewicz et al. 2019)
Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng Sản xuất tại Đức
Máy siêu âm Hielscher nổi tiếng với chất lượng và tiêu chuẩn thiết kế cao nhất. Mạnh mẽ và vận hành dễ dàng cho phép tích hợp trơn tru các máy siêu âm của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Các điều kiện khắc nghiệt và môi trường khắt khe có thể dễ dàng xử lý bằng máy siêu âm Hielscher.
Hielscher Ultrasonics là một công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt nhấn mạnh vào ultrasonicators hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, Hielscher ultrasonicators là CE tuân thủ và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.
Hợp lý hóa việc chuẩn bị mẫu trong đĩa 96 giếng và đĩa xét nghiệm Sử dụng máy siêu âm tấm đa giếng UIP400MTP
Văn học / Tài liệu tham khảo
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Các câu hỏi thường gặp
Xét nghiệm MIC là gì?
Xét nghiệm Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là một thử nghiệm tiêu chuẩn được sử dụng để xác định nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn cần thiết để ức chế sự phát triển có thể nhìn thấy của vi sinh vật. Nó thường được thực hiện bằng cách sử dụng các phương pháp pha loãng vi lượng nước dùng hoặc pha loãng thạch, trong đó vi sinh vật tiếp xúc với các pha loãng hàng loạt của chất kháng khuẩn. Các xét nghiệm MIC rất quan trọng để đánh giá hiệu quả kháng sinh, hướng dẫn điều trị lâm sàng và đánh giá mức độ kháng thuốc ở cả vi sinh vật phù du và màng sinh học.
Sự khác biệt giữa Xét nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu dựa trên màng sinh học và Xét nghiệm MBIC là gì?
Xét nghiệm Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dựa trên màng sinh học và xét nghiệm Nồng độ ức chế màng sinh học tối thiểu (MBIC) có liên quan nhưng khác biệt về mục đích và phương pháp luận của chúng.
Xét nghiệm MIC dựa trên màng sinh học đánh giá nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn cần thiết để ức chế sự phát triển hoặc khả năng tồn tại của màng sinh học có thể nhìn thấy được, tập trung vào các tế bào liên quan đến màng sinh học hơn là vi khuẩn phù du. Ngược lại, xét nghiệm MBIC đo cụ thể khả năng của chất kháng khuẩn trong việc ngăn chặn sự hình thành màng sinh học, thay vì xử lý màng sinh học được hình thành trước. Trong khi cả hai xét nghiệm đều xử lý vi khuẩn liên quan đến màng sinh học, xét nghiệm MIC dựa trên màng sinh học giải quyết việc điều trị và xét nghiệm MBIC nhấn mạnh việc phòng ngừa, khiến chúng trở thành công cụ bổ sung để nghiên cứu hiệu quả kháng sinh chống lại màng sinh học.
Những màng sinh học nào được sử dụng trong xét nghiệm MIC?
Màng sinh học vi sinh vật và tế bào sinh vật phù du đều được sử dụng trong các xét nghiệm Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) để nghiên cứu hiệu quả kháng khuẩn trong các điều kiện khác nhau.
- Tế bào sinh vật phù du:
Tế bào sinh vật phù du là các tế bào vi sinh vật đơn lẻ, trôi nổi tự do đóng vai trò là mô hình tiêu chuẩn cho các xét nghiệm MIC truyền thống. Các vi sinh vật phổ biến bao gồm Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Candida albicans. Các xét nghiệm này xác định MIC cần thiết để ức chế sự phát triển của các tế bào sống tự do và rất quan trọng đối với việc sàng lọc kháng khuẩn ban đầu. - Các tế bào liên quan đến màng sinh học:
Tế bào màng sinh học là vi sinh vật được nhúng trong ma trận ngoại bào, làm tăng đáng kể khả năng chống kháng sinh của chúng. Các xét nghiệm MIC màng sinh học thường bao gồm:- Vi khuẩn gram âm: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella pneumoniae, được biết đến với sự hình thành màng sinh học trong nhiễm trùng và môi trường công nghiệp.
- Vi khuẩn gram dương: Staphylococcus aureus (bao gồm MRSA), Staphylococcus epidermis, và Enterococcus faecalis, thường liên quan đến nhiễm trùng liên quan đến thiết bị.
- Nấm: Candida albicans và các loài liên quan, quan trọng trong nhiễm nấm liên quan đến màng sinh học.
- Màng sinh học hỗn hợp loài: Chúng đôi khi được sử dụng để tái tạo màng sinh học đa vi khuẩn tự nhiên, chẳng hạn như màng sinh học được tìm thấy trong vết thương mãn tính hoặc bám bẩn sinh học công nghiệp.
Bằng cách so sánh các giá trị MIC cho tế bào sinh vật phù du và các tế bào liên quan đến màng sinh học, các nhà nghiên cứu có thể đánh giá khả năng kháng tăng cường của màng sinh học và xác định các tác nhân có hiệu quả chống lại các cộng đồng vi sinh vật có khả năng phục hồi tốt hơn này.
Sự khác biệt giữa MIC và MBEC là gì?
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ thấp nhất của một chất kháng khuẩn cần thiết để ngăn chặn sự hình thành màng sinh học, trong khi Nồng độ Loại bỏ màng sinh học tối thiểu (MBEC) là nồng độ thấp nhất cần thiết để loại bỏ màng sinh học đã được thiết lập. MIC tập trung vào phòng ngừa màng sinh học, trong khi MBEC đánh giá hiệu quả điều trị đối với màng sinh học trưởng thành.
Những tấm nào thường được sử dụng cho Xét nghiệm MBEC?
Các tấm microtiter thường được sử dụng cho các xét nghiệm MBEC thường là các tấm 96 giếng được làm từ polystyrene hoặc polypropylene. Những vật liệu này cung cấp một bề mặt thích hợp để hình thành màng sinh học và có khả năng kháng hóa chất đối với các chất kháng khuẩn được thử nghiệm trong quá trình thử nghiệm. Các tấm polystyrene được ưa chuộng rộng rãi vì độ trong quang học của chúng, có lợi cho các phân tích hạ nguồn như đo quang phổ hoặc đo dựa trên huỳnh quang. Thiết kế của các tấm này bao gồm các nắp chốt có thể tháo rời, rất cần thiết cho xét nghiệm vì màng sinh học hình thành trên các chốt được ngâm trong giếng có chứa môi trường tăng trưởng. Các tấm tiêu chuẩn, chẳng hạn như những tấm tuân thủ quy trình xét nghiệm MBEC, được thiết kế đặc biệt để đảm bảo khả năng tái tạo và khả năng tương thích với máy siêu âm UIP400MTP hoặc thiết bị xử lý khác.
Tấm nắp PEG là gì?
Tấm nắp PEG là hệ thống tấm đa giếng chuyên dụng, trong đó nắp được trang bị các chốt hoặc chốt polyetylen glycol (PEG) nhỏ kéo dài vào mỗi giếng. Những chốt này cung cấp bề mặt cho sự hình thành màng sinh học của vi sinh vật trong các điều kiện được kiểm soát, bắt chước sự phát triển màng sinh học trong thế giới thực. Thiết kế cho phép màng sinh học phát triển trên các chốt trong khi các giếng chứa môi trường tăng trưởng hoặc chất kháng khuẩn, cho phép kiểm tra thông lượng cao về tính nhạy cảm của màng sinh học đối với các phương pháp điều trị, chẳng hạn như trong các xét nghiệm MBEC, MBIC và MIC.
Ưu điểm của việc loại bỏ màng sinh học siêu âm so với cạo tế bào là gì?
Màng sinh học siêu âm mang lại lợi thế đáng kể so với việc cạo tế bào bằng cách cung cấp một phương pháp không xâm lấn, đồng đều và hiệu quả cao để loại bỏ màng sinh học khỏi bề mặt. Không giống như cạo, có thể không nhất quán và làm hỏng bề mặt hoặc tế bào bên dưới, sóng siêu âm xuyên qua ma trận màng sinh học, phá vỡ nó mà không ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của các cấu trúc lân cận. Phương pháp này đảm bảo khả năng tái tạo, giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn và đặc biệt hiệu quả đối với các ứng dụng yêu cầu loại bỏ màng sinh học chính xác, chẳng hạn như trong các nghiên cứu vi sinh hoặc thử nghiệm thiết bị y tế. Đọc thêm cách UIP400MTP Sonicator vượt trội trong việc cạo tế bào!
Hielscher Ultrasonics sản xuất homogenizers siêu âm hiệu suất cao từ phòng thí nghiệm đến quy mô công nghiệp.