Quy trình thử nghiệm MBEC sử dụng máy siêu âm đĩa 96 giếng UIP400MTP

Thử nghiệm MBEC được sử dụng để xác định nồng độ chất kháng vi sinh vật cần thiết để loại bỏ màng sinh học hình thành trên nắp có chốt. Để đánh giá khả năng sống của màng sinh học, trước tiên phải tách màng sinh học khỏi nắp có chốt của đĩa 96 giếng. Xử lý siêu âm là phương pháp đáng tin cậy và hiệu quả nhất để thực hiện việc tách này. Máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP được thiết kế chuyên biệt để xử lý các đĩa thử nghiệm với hiệu quả và sự thuận tiện tối đa, giúp đơn giản hóa và đẩy nhanh các thử nghiệm MBEC thông lượng cao.

Xử lý siêu âm để tách màng sinh học

Xử lý siêu âm là bước quan trọng trong các thử nghiệm nồng độ diệt trừ màng sinh học tối thiểu (MBEC), giúp tách hiệu quả các tế bào màng sinh học khỏi bề mặt mà chúng bám vào. Về bản chất, màng sinh học là các quần thể vi sinh vật có cấu trúc, được bao bọc trong một chất nền ngoại bào, khiến chúng có khả năng chống chịu các chất kháng vi sinh vật cao hơn đáng kể so với tế bào sống tự do. Trong các thử nghiệm MBEC, quá trình xử lý siêu âm sử dụng sóng siêu âm để tạo ra hiện tượng xâm thực có kiểm soát, phá vỡ chất nền màng sinh học và giải phóng các tế bào nằm trong đó vào huyền phù. Bước này bảo đảm các tế bào màng sinh học phân tán đồng đều trong môi trường phục hồi, tạo điều kiện đánh giá chính xác khả năng sống bằng phương pháp cấy trên đĩa, pha loãng hoặc đo quang phổ. Nếu màng sinh học không được tách đúng cách, các thành phần chất nền còn sót lại có thể che chắn tế bào, dẫn đến đánh giá thấp hiệu quả kháng vi sinh vật. Vì vậy, xử lý siêu âm là bước không thể thiếu để thu được các giá trị MBEC đáng tin cậy và có khả năng tái lập, phản ánh đúng khả năng diệt trừ của các chất được thử nghiệm. Máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP cho phép chuẩn bị mẫu thông lượng cao một cách dễ dàng trong các đĩa thử nghiệm.

Quy trình thử nghiệm nồng độ diệt trừ màng sinh học tối thiểu (MBEC)

Bước 1: Hình thành màng sinh học

1. Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn:
   Nuôi vi khuẩn trong môi trường thích hợp đến pha sinh trưởng lũy thừa.
   Pha loãng dịch nuôi cấy vi khuẩn đến mật độ quang xác định (ví dụ: OD600 ~0,1).
2. Cấy vào đĩa 96 giếng:
   Thêm huyền phù vi khuẩn (ví dụ: 150–200 µL) vào từng giếng của đĩa vi chuẩn độ 96 giếng tiêu chuẩn.
3. Gắn nắp có chốt:
   Đặt nắp có chốt lên đĩa đã cấy để màng sinh học có thể hình thành trên bề mặt các chốt.
4. Ủ đĩa:
   Ủ hệ thống ở nhiệt độ thích hợp (ví dụ: 37°C) trong 24–48 giờ, không lắc, để thúc đẩy sự phát triển của màng sinh học.

Bước 2: Xử lý bằng các chất kháng vi sinh vật

• Chuẩn bị các dung dịch kháng vi sinh vật:
  Chuẩn bị một dải nồng độ chất kháng vi sinh vật trong môi trường mới.
  Cho màng sinh học tiếp xúc với các chất kháng vi sinh vật:
  Lấy nắp có chốt ra khỏi dịch nuôi cấy vi khuẩn và rửa bằng nước muối sinh lý vô trùng hoặc PBS để loại bỏ các tế bào sống tự do.
  Đặt nắp có chốt vào một đĩa 96 giếng mới chứa các dung dịch kháng vi sinh vật.
• Ủ đĩa:
  Ủ trong một khoảng thời gian xác định (ví dụ: 24 giờ) để màng sinh học tiếp xúc với chất kháng vi sinh vật.

Bước 3: Xử lý siêu âm bằng máy siêu âm đĩa 96 giếng UIP400MTP

Bước xử lý siêu âm có vai trò thiết yếu trong việc tách màng sinh học khỏi nắp có chốt để đánh giá khả năng sống. Thực hiện các bước sau với máy siêu âm UIP400MTP:

1. Chuẩn bị hệ thống:
   Cho môi trường phục hồi (ví dụ: canh thang trung hòa hoặc môi trường nuôi cấy mới) vào từng giếng của một đĩa 96 giếng mới.
2. Chuyển nắp có chốt:
   Lấy nắp có chốt ra khỏi đĩa xử lý bằng chất kháng vi sinh vật.
   Rửa nắp có chốt bằng nước muối sinh lý vô trùng hoặc PBS để loại bỏ các chất kháng vi sinh vật còn sót lại.
3. Định vị đĩa và máy siêu âm:
   Gắn nắp có chốt vào đĩa chứa môi trường phục hồi.
   Đặt đĩa chứa môi trường phục hồi lên bệ của máy siêu âm UIP400MTP, bảo đảm đĩa nằm ở chính giữa và ổn định.
4. Điều chỉnh các thông số siêu âm:
   Thiết lập các thông số siêu âm trên UIP400MTP (có thể điều chỉnh các thiết lập cho phù hợp với màng sinh học):
   Biên độ: 70–100%.
   Thời gian xử lý siêu âm: 1–3 phút (điều chỉnh theo độ bền chắc của màng sinh học) ở chế độ chu kỳ.
5. Xử lý siêu âm:
   Bắt đầu quá trình xử lý siêu âm. Dao động siêu âm sẽ tách màng sinh học khỏi bề mặt các chốt vào môi trường phục hồi.
6. Theo dõi quá trình:
   Sử dụng cảm biến nhiệt độ dạng cắm để theo dõi nhiệt độ mẫu trong các giếng. Có thể kết nối UIP400MTP với bộ làm lạnh phòng thí nghiệm để làm mát.
7. Xử lý sau siêu âm:
   Chuyển ngay môi trường phục hồi (lúc này chứa màng sinh học đã được tách ra) sang một đĩa vô trùng mới để thực hiện các phân tích tiếp theo.

(A) Đĩa chứa TSB với 2% glucose được sử dụng để hình thành màng sinh học, thu hồi tế bào và
xác định MIC và MBCB; (B) Nắp có các chốt để hình thành màng sinh học của tụ cầu khuẩn. xác định MIC và MBCB; (B) Nắp có các chốt để hình thành màng sinh học của tụ cầu khuẩn.
Các tế bào màng sinh học hình thành trên các chốt được tách ra bằng xử lý siêu âm (Hielscher Ultrasound Technology) trong 5 min trong các đĩa 96 giếng chứa môi trường nuôi cấy mới để thu hồi tế bào.
(Hình ảnh và nghiên cứu: ©de Oliveira et al., 2016)

Bước 4: Đánh giá khả năng sống

Cấy trên đĩa và nuôi cấy màng sinh học đã tách:

1. Pha loãng nối tiếp môi trường phục hồi và cấy lên thạch để đếm số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU).
   Hoặc sử dụng phép thử khả năng sống dựa trên đo màu hoặc huỳnh quang.
2. Ghi nhận kết quả:
   Xác định MBEC là nồng độ chất kháng vi sinh vật thấp nhất đã diệt trừ khả năng sống có thể phát hiện được của màng sinh học.

Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng sản xuất tại Đức

Các máy siêu âm Hielscher nổi tiếng với chất lượng và tiêu chuẩn thiết kế cao nhất. Độ bền và khả năng vận hành dễ dàng cho phép tích hợp thuận lợi các máy siêu âm của chúng tôi vào cơ sở công nghiệp. Các máy siêu âm Hielscher dễ dàng đáp ứng điều kiện khắc nghiệt và môi trường có yêu cầu cao.

Hielscher Ultrasonics là công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt chú trọng đến các máy siêu âm hiệu suất cao tích hợp công nghệ tiên tiến nhất và dễ sử dụng. Tất nhiên, các máy siêu âm Hielscher tuân thủ CE và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.

Đọc tại đây để tìm hiểu cách sử dụng UIP400MTP để tách màng sinh học trong bước chuẩn bị mẫu của quy trình ASTM E2799 nhằm kiểm tra hiệu quả của chất khử trùng đối với màng sinh học Pseudomonas aeruginosa bằng thử nghiệm MBEC.