Giao thức xét nghiệm MBEC sử dụng Máy siêu âm tấm 96 giếng UIP400MTP

Xét nghiệm MBEC được sử dụng để xác định nồng độ các chất kháng khuẩn cần thiết để loại bỏ màng sinh học hình thành trên nắp chốt. Để đánh giá khả năng tồn tại của màng sinh học, trước tiên các màng sinh học phải được tách ra khỏi nắp chốt của đĩa 96 giếng. Sonication là phương pháp đáng tin cậy và hiệu quả nhất cho sự tách rời này. Máy siêu âm đĩa đa giếng UIP400MTP được thiết kế đặc biệt để xử lý các tấm xét nghiệm với hiệu quả và tiện lợi tối đa, hợp lý hóa và tăng tốc các xét nghiệm MBEC thông lượng cao.

Siêu âm cho tách màng sinh học

Siêu âm là một bước quan trọng trong các xét nghiệm Nồng độ Loại bỏ màng sinh học tối thiểu (MBEC), cho phép loại bỏ hiệu quả các tế bào màng sinh học khỏi sự gắn kết bề mặt của chúng. Màng sinh học vốn là các quần thể vi sinh vật có cấu trúc được bao bọc trong một ma trận ngoại bào, điều này làm cho chúng có khả năng chống lại các chất kháng khuẩn tốt hơn đáng kể so với các tế bào phù du. Trong các xét nghiệm MBEC, siêu âm sử dụng sóng siêu âm để tạo ra sự xâm thực có kiểm soát, phá vỡ ma trận màng sinh học và giải phóng các tế bào nhúng vào hỗn dịch. Bước này đảm bảo rằng các tế bào màng sinh học được phân tán đều trong môi trường thu hồi, tạo điều kiện đánh giá khả năng tồn tại chính xác thông qua các phương pháp mạ, pha loãng hoặc quang phổ. Nếu không có sự tách màng sinh học thích hợp, các thành phần ma trận còn lại có thể bảo vệ tế bào, dẫn đến đánh giá thấp hiệu quả kháng khuẩn. Do đó, siêu âm là không thể thiếu để có được các giá trị MBEC đáng tin cậy và có thể tái tạo, phản ánh tiềm năng diệt trừ thực sự của các tác nhân được thử nghiệm. Máy siêu âm đĩa đa giếng UIP400MTP cho phép chuẩn bị mẫu thông lượng cao dễ dàng trong các tấm xét nghiệm.

Quy trình xét nghiệm nồng độ diệt màng sinh học tối thiểu (MBEC)

Bước 1: Hình thành màng sinh học

1. Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn:
   Phát triển vi khuẩn trong môi trường thích hợp để tăng trưởng giai đoạn log.
   Pha loãng vi khuẩn đến mật độ quang học xác định (ví dụ: OD600 ~ 0,1).
2. Cấy đĩa 96 giếng:
   Thêm huyền phù vi khuẩn (ví dụ: 150–200 μL) vào mỗi giếng của đĩa microtiter 96 giếng tiêu chuẩn.
3. Gắn nắp chốt:
   Đặt nắp chốt lên tấm đã cấy để cho phép hình thành màng sinh học trên bề mặt chốt.
4. Ủ đĩa:
   Ủ thiết lập ở nhiệt độ thích hợp (ví dụ: 37 ° C) trong 24–48 giờ mà không cần lắc để thúc đẩy sự phát triển của màng sinh học.

Bước 2: Điều trị bằng thuốc kháng khuẩn

• Chuẩn bị dung dịch kháng khuẩn:
  Chuẩn bị một loạt các nồng độ kháng khuẩn trong môi trường tươi.
  Tiếp xúc màng sinh học với các chất kháng khuẩn:
  Tháo nắp chốt ra khỏi môi trường nuôi cấy vi khuẩn và rửa sạch bằng nước muối vô trùng hoặc PBS để loại bỏ các tế bào sinh vật phù du.
  Đặt nắp chốt vào một tấm 96 giếng mới có chứa dung dịch kháng khuẩn.
• Ủ đĩa:
  Ủ trong một khoảng thời gian xác định (ví dụ: 24 giờ) để cho phép tiếp xúc với kháng sinh.

Bước 3: Siêu âm bằng máy siêu âm tấm 96 giếng UIP400MTP

Bước siêu âm là rất quan trọng để tách màng sinh học ra khỏi nắp chốt để đánh giá khả năng tồn tại. Làm theo các bước sau cho máy siêu âm UIP400MTP:

1. Chuẩn bị thiết lập:
   Đổ đầy môi trường thu hồi (ví dụ: nước dùng trung hòa hoặc môi trường tăng trưởng tươi) vào đĩa 96 giếng tươi trong mỗi giếng.
2. Chuyển nắp chốt:
   Tháo nắp chốt ra khỏi tấm xử lý kháng khuẩn.
   Rửa sạch nắp chốt bằng nước muối vô trùng hoặc PBS để loại bỏ các chất kháng khuẩn còn sót lại.
3. Định vị tấm và máy siêu âm:
   Gắn nắp chốt vào đĩa môi trường phục hồi.
   Đặt tấm môi trường thu hồi lên bệ siêu âm UIP400MTP, đảm bảo tấm được căn giữa và ổn định.
4. Điều chỉnh các thông số siêu âm:
   Đặt các thông số siêu âm ở UIP400MTP (Cài đặt có thể được điều chỉnh theo màng sinh học):
   Biên độ: 70–100%.
   Thời gian siêu âm: 1–3 phút (điều chỉnh dựa trên độ bền của màng sinh học) ở chế độ chu kỳ.
5. Siêu âm:
   Bắt đầu quá trình siêu âm. Rung động siêu âm sẽ đánh bật màng sinh học từ bề mặt chốt vào môi trường thu hồi.
6. Giám sát quá trình:
   Sử dụng cảm biến nhiệt độ có thể cắm được để theo dõi sample nhiệt độ trong giếng. UIP400MTP có thể được kết nối với máy làm lạnh trong phòng thí nghiệm để làm mát.
7. Xử lý sau sonication:
   Ngay lập tức chuyển môi trường thu hồi (hiện có chứa màng sinh học đã tách rời) vào một đĩa vô trùng mới để phân tích hạ lưu.

(A) Tấm chứa TSB với 2% glucose được sử dụng để hình thành màng sinh học, phục hồi tế bào và
xác định MIC và MBCB; (B) Nắp có chốt để hình thành màng sinh học tụ cầu. xác định MIC và MBCB; (B) Nắp có chốt để hình thành màng sinh học tụ cầu.
Các tế bào màng sinh học được hình thành trên các chốt được đánh bật bằng cách siêu âm (Công nghệ siêu âm Hielscher) trong 5 phút trong các đĩa 96 giếng có chứa môi trường nuôi cấy tươi để phục hồi tế bào.
(Hình ảnh và nghiên cứu: ©de Oliveira et al., 2016)

Bước 4: Đánh giá khả năng tồn tại

Màng sinh học tách rời đĩa và nuôi cấy:

1. Thực hiện pha loãng nối tiếp môi trường thu hồi và đĩa lên thạch để liệt kê các đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU).
   Ngoài ra, sử dụng xét nghiệm khả năng tồn tại dựa trên màu hoặc huỳnh quang.
2. Kết quả ghi nhận:
   Xác định MBEC là nồng độ kháng khuẩn thấp nhất đã loại bỏ khả năng tồn tại của màng sinh học có thể phát hiện được.

Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng Sản xuất tại Đức

Máy siêu âm Hielscher nổi tiếng với chất lượng và tiêu chuẩn thiết kế cao nhất. Mạnh mẽ và vận hành dễ dàng cho phép tích hợp trơn tru các máy siêu âm của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Các điều kiện khắc nghiệt và môi trường khắt khe có thể dễ dàng xử lý bằng máy siêu âm Hielscher.

Hielscher Ultrasonics là một công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt nhấn mạnh vào ultrasonicators hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, Hielscher ultrasonicators là CE tuân thủ và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.

Đọc ở đây cách UIP400MTP được sử dụng để tách màng sinh học như một bước chuẩn bị mẫu trong giao thức ASTM E2799 để kiểm tra hiệu quả của chất khử trùng đối với màng sinh học Pseudomonas aeruginosa bằng cách sử dụng xét nghiệm MBEC.