Ly giải tế bào nấm men trong đĩa vi thể bằng siêu âm cường độ cao

Các nhà vi sinh vật học và nhà nghiên cứu khoa học sự sống làm việc với Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, cùng các hệ nấm men khác đều hiểu rõ thách thức: tế bào nấm men có độ bền cao, việc ly giải với khả năng tái lập có thể khó khăn, và phá vỡ mẫu thủ công nhanh chóng trở thành nút thắt khi cần sàng lọc nhiều chủng, dòng, điều kiện nuôi cấy hoặc cấu trúc biểu hiện.

Ly giải nấm men với thông lượng cao cho vi sinh vật học, sinh học phân tử và phân tích protein

Các thiết bị siêu âm đĩa vi thể của Hielscher như UIP400MTP (400 W) và UIP550MTP (550 W) cung cấp giải pháp thông lượng cao để ly giải tế bào nấm men bằng cơ học trực tiếp trong đĩa vi thể. Thay vì xử lý từng mẫu bằng đầu dò, có thể xử lý siêu âm toàn bộ đĩa vi thể trong các điều kiện đồng đều. Điều này giúp quá trình ly giải nấm men bằng siêu âm nhanh hơn, có khả năng tái lập cao hơn và dễ tích hợp hơn vào các quy trình hiện đại về vi sinh vật học, biểu hiện protein, sàng lọc enzyme và các lĩnh vực omics.
Dù bạn cần giải phóng protein tái tổ hợp từ P. pastoris, chuẩn bị dịch ly giải nấm men cho các phép thử enzyme, phá vỡ S. cerevisiae để phân tích protein hay sàng lọc song song hàng chục dòng nấm men, các thiết bị siêu âm đĩa vi thể của Hielscher đều mang lại khả năng phá vỡ tế bào mạnh mẽ dựa trên hiện tượng xâm thực, với khả năng kiểm soát quá trình chính xác.

Tại sao tế bào nấm men cần được ly giải cơ học hiệu quả

Tế bào nấm men khó ly giải hơn nhiều loại tế bào vi khuẩn hoặc động vật có vú vì chúng được bảo vệ bởi thành tế bào cứng, có thành phần chủ yếu là polysaccharide, glucan, mannoprotein và chitin. Thành tế bào này mang lại độ ổn định cơ học, nhưng cũng hạn chế sự giải phóng protein, axit nucleic, chất chuyển hóa và enzyme nội bào.
Các phương pháp ly giải nấm men thông thường bao gồm phá vỡ bằng hạt, phân giải bằng enzyme, các chu kỳ đông lạnh–rã đông, ly giải hóa học và xử lý siêu âm bằng đầu dò. Các phương pháp này có thể hiệu quả, nhưng cũng có những hạn chế. Phá vỡ bằng hạt có thể đưa thêm mảnh vụn vào mẫu và gây nóng, phân giải bằng enzyme có thể làm tăng chi phí và độ biến thiên, còn xử lý siêu âm từng mẫu bằng đầu dò tốn thời gian khi cần xử lý số lượng mẫu lớn.
Hiện tượng xâm thực siêu âm hội tụ, cường độ cao khắc phục những hạn chế này bằng cách tác động lực cắt cơ học mạnh, dao động áp suất và các dòng chảy vi mô lên huyền phù nấm men. Kết quả là thành và màng tế bào bị phá vỡ nhanh chóng, các thành phần nội bào được giải phóng tốt hơn và việc chuẩn bị mẫu trong đĩa có khả năng tái lập cao.

Xử lý siêu âm đĩa vi thể để chuẩn bị song song các mẫu nấm men

Hielscher UIP400MTP và UIP550MTP được thiết kế để xử lý siêu âm đồng đều các đĩa vi thể, đĩa nhiều giếng, đĩa PCR và giá đỡ mẫu phù hợp. Khác với xử lý siêu âm bằng đầu dò, các mẫu không cần được xử lý riêng lẻ. Toàn bộ đĩa chịu tác động của năng lượng siêu âm được kiểm soát, khiến quy trình này rất phù hợp để xử lý mẫu song song.

Điều này đặc biệt hữu ích cho:

• Sàng lọc các chủng S. cerevisiae đột biến hoặc biểu hiện
• Ly giải các dòng P. pastoris / K. phaffii sau khi biểu hiện protein tái tổ hợp
• Chuẩn bị dịch ly giải nấm men cho các phép thử enzyme
• Chiết xuất protein cho SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS hoặc kiểm tra hoạt tính
• Giải phóng các chất chuyển hóa nội bào để nghiên cứu hệ chuyển hóa
• Chuẩn bị mẫu DNA và RNA sau bước tinh sạch tiếp theo phù hợp
• Tối ưu hóa đệm ly giải, chất phụ gia và điều kiện chiết xuất với thông lượng cao

Cách hiện tượng xâm thực siêu âm phá vỡ tế bào nấm men

Trong quá trình xử lý bằng siêu âm, sóng siêu âm công suất cao được hội tụ tạo ra các chu kỳ nén và giãn xen kẽ trong mẫu lỏng. Ở cường độ đủ cao, những dao động áp suất này tạo ra hiện tượng xâm thực âm. Các bọt xâm thực hình thành, dao động và sụp đổ, tạo ra lực cắt cục bộ, các tia chất lỏng vi mô, dòng chảy rối và gradient áp suất lớn.
Trong huyền phù nấm men, các tác động cơ học này làm suy yếu và phá vỡ thành tế bào cũng như màng tế bào. Protein nội bào, enzyme, axit nucleic và các chất chuyển hóa được giải phóng vào dung dịch đệm ly giải. Vì đây là quá trình cơ học, có thể sử dụng quá trình này với nhiều hệ đệm khác nhau và kết hợp với chất ức chế protease, chất khử, chất tẩy rửa, muối hoặc bước tiền xử lý nhẹ bằng enzyme.

Quy trình tổng quát: Ly giải tế bào nấm men trong đĩa vi giếng

Quy trình dưới đây cung cấp điểm khởi đầu thực tiễn cho việc ly giải nấm men bằng thiết bị siêu âm đĩa vi giếng Hielscher UIP400MTP hoặc UIP550MTP. Các thông số cần được tối ưu hóa theo chủng nấm men, mật độ tế bào, phân tử mục tiêu, thành phần dung dịch đệm, loại đĩa và phép thử ở công đoạn sau.

1. Thu hoạch và rửa tế bào nấm men

Nuôi Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces hoặc một chủng nấm men khác trong các điều kiện nuôi cấy mong muốn. Thu hoạch tế bào bằng cách ly tâm và loại bỏ môi trường nuôi cấy. Rửa cặn tế bào bằng nước cất lạnh, PBS hoặc dung dịch đệm ly giải đã chọn để loại bỏ các thành phần môi trường còn sót lại có thể gây nhiễu cho phân tích ở công đoạn sau.
Để chiết xuất protein, giữ lạnh mẫu và thao tác nhanh. Nếu cần lưu ý đến protease, hãy làm lạnh trước tất cả dung dịch đệm và vật tư tiêu hao.

2. Tái huyền phù cặn tế bào

Tái huyền phù cặn nấm men trong dung dịch đệm ly giải lạnh phù hợp. Mật độ tế bào cao thường có lợi cho việc giải phóng protein hiệu quả. Để bắt đầu, sử dụng cặn tế bào ướt ở nồng độ khoảng 10–20% w/v hoặc huyền phù đậm đặc tương ứng với OD₆₀₀ > 10, tùy theo phép thử.

Một dung dịch đệm ly giải điển hình để thu protein từ nấm men có thể chứa:

• hệ đệm như Tris-HCl, đệm phosphat hoặc HEPES
• muối như NaCl hoặc KCl
• hỗn hợp chất ức chế protease
• chất khử tùy chọn như DTT hoặc β-mercaptoethanol
• chất tẩy rửa tùy chọn như Triton X-100, NP-40, SDS hoặc CHAPS, tùy theo khả năng tương thích với các công đoạn sau
• chất ức chế phosphatase tùy chọn cho các nghiên cứu phosphoryl hóa

Đối với các chủng nấm men khó ly giải hoặc khi cần chiết xuất protein thật nhẹ nhàng, có thể tiền xử lý trong thời gian ngắn bằng Zymolyase, Lyticase hoặc một enzyme phân giải thành tế bào khác trước khi xử lý bằng siêu âm. Bước tiền xử lý bằng enzyme này là tùy chọn nhưng có thể cải thiện hiệu quả ly giải hoặc giảm cường độ siêu âm cần thiết.

3. Chuyển mẫu vào đĩa vi giếng phù hợp

Phân phối huyền phù nấm men vào đĩa vi giếng tương thích với xử lý bằng siêu âm. Đĩa đáy tròn thường được ưu tiên vì giúp thu hồi mẫu tốt hơn và giảm các vùng chết. Sử dụng thể tích mẫu bằng nhau giữa các giếng để cải thiện khả năng tái lập.
Đậy kín đĩa bằng tấm đậy hoặc màng dán kín phù hợp để ngăn bay hơi, hình thành khí dung và nhiễm chéo. Đảm bảo vật liệu đậy kín tương thích với nhiệt độ và điều kiện xử lý bằng siêu âm đã chọn.
Thể tích làm việc điển hình phụ thuộc vào định dạng đĩa và ứng dụng. Các định dạng phổ biến bao gồm đĩa 96 giếng, đĩa giếng sâu, đĩa PCR hoặc giá đỡ ống phù hợp.

4. Thiết lập làm mát

Ly giải nấm men đòi hỏi cường độ siêu âm cao, và quá trình phá vỡ cơ học tạo ra nhiệt. Vì vậy, kiểm soát nhiệt độ có vai trò then chốt, đặc biệt đối với phân tích protein, enzyme, RNA hoặc sự phosphoryl hóa.

Sử dụng biện pháp làm mát phù hợp, chẳng hạn như:

• dung dịch đệm ly giải được làm lạnh trước
• đĩa vi giếng được làm lạnh trước
• các khoảng nghỉ làm mát giữa những đợt xử lý bằng siêu âm
• làm mát từ bên ngoài cho bệ xử lý siêu âm, khi áp dụng được

Mục tiêu là giữ mẫu đủ lạnh để ngăn protein biến tính, enzyme mất hoạt tính, RNA phân hủy và sự biến thiên của mẫu do nhiệt gây ra.

5. Xử lý huyền phù nấm men bằng siêu âm

Đặt đĩa đã được đậy kín vào máy siêu âm đĩa vi giếng Hielscher UIP400MTP hoặc UIP550MTP và chọn chương trình siêu âm dạng xung. Nên sử dụng chế độ xung vì chế độ này cho phép phá vỡ tế bào bằng cơ học trong các pha BẬT và tản nhiệt trong các pha TẮT.
Thông số khởi đầu cho quá trình ly giải tế bào nấm men:

Đối với huyền phù nấm men có khả năng chống chịu rất cao, sinh khối P. pastoris đậm đặc hoặc trường hợp khó chiết xuất protein tái tổ hợp, hãy tăng dần tổng thời gian BẬT tích lũy. Đối với protein nhạy nhiệt hoặc các xét nghiệm enzyme, hãy sử dụng xung ngắn hơn, khoảng nghỉ làm mát dài hơn và biên độ khởi đầu thấp hơn.

Ly giải nấm men với năng suất xử lý cao trong đĩa nhiều giếng bằng UIP400MTP

6. Làm trong dịch ly giải

Sau khi siêu âm, ly tâm đĩa vi giếng hoặc chuyển mẫu sang ống để ly tâm. Loại bỏ mảnh vụn tế bào bằng cách ly tâm ở tốc độ và nhiệt độ thích hợp. Thu dịch nổi để phân tích tiếp theo.

Tùy theo ứng dụng, dịch ly giải có thể được sử dụng cho:

• định lượng protein
• xét nghiệm hoạt tính enzyme
• SDS-PAGE và thấm Western
• ELISA và các xét nghiệm miễn dịch
• phân tích hệ protein bằng LC-MS/MS
• phân tích chất chuyển hóa
• tinh sạch DNA hoặc RNA

7. Tối ưu hóa và ghi chép phương pháp

Để ly giải nấm men có độ tái lập cao, hãy ghi chép tất cả các thông số liên quan, bao gồm chủng, điều kiện nuôi cấy, OD₆₀₀, khối lượng tế bào ướt, thành phần dung dịch đệm, loại đĩa, thể tích mẫu, biên độ, chu kỳ xung, tổng thời gian BẬT tích lũy, phương pháp làm mát và nhiệt độ cuối cùng của mẫu.
Nếu máy siêu âm Hielscher được trang bị chức năng ghi dữ liệu tự động, dữ liệu quá trình có thể được sử dụng để lập hồ sơ, phát triển phương pháp, mở rộng quy mô và kiểm soát chất lượng.

Mẹo tối ưu hóa quá trình ly giải nấm men

Để giải phóng protein tối đa, hãy sử dụng huyền phù nấm men đậm đặc, cường độ siêu âm cao và tổng thời gian BẬT tích lũy đủ dài. Đối với protein nhạy cảm, hãy giảm biên độ, kéo dài khoảng nghỉ làm mát và giữ lạnh đĩa trong suốt quá trình xử lý.
Nếu quá trình ly giải chưa hoàn toàn, hãy tăng dần thời gian siêu âm, thử tiền xử lý bằng enzyme, giảm độ nhớt của mẫu hoặc tối ưu hóa dung dịch đệm. Nếu protein bị phân hủy hoặc mất hoạt tính, hãy cải thiện việc làm mát, rút ngắn các khoảng BẬT, bổ sung chất ức chế và xác minh rằng hệ chất tẩy rửa tương thích với protein mục tiêu.
Vì các chủng nấm men khác nhau đáng kể về cấu trúc thành tế bào, pha sinh trưởng, hệ biểu hiện và mật độ sinh khối, nên thực hiện một ma trận thử nghiệm tối ưu hóa ngắn gọn. Ví dụ, thử ba mức biên độ, hai chu kỳ xung và hai mức tổng thời gian BẬT, sau đó đánh giá hiệu suất ly giải và tính toàn vẹn của protein.

Ưu điểm của máy siêu âm đĩa vi giếng Hielscher trong ly giải nấm men

Máy siêu âm đĩa vi giếng Hielscher lý tưởng cho các phòng thí nghiệm cần ly giải nhiều mẫu với độ tái lập cao. Các máy này loại bỏ thao tác xử lý chậm từng mẫu một bằng đầu dò siêu âm và giảm biến thiên do định vị đầu dò thủ công, độ sâu nhúng và khác biệt trong thao tác giữa các mẫu.

Các ưu điểm chính bao gồm:

• Năng suất xử lý cao: Siêu âm song song nhiều mẫu nấm men trong đĩa vi giếng hoặc giá đỡ mẫu tương thích.
• Điều kiện có độ tái lập cao: Điều kiện siêu âm giống nhau ở tất cả các giếng giúp tạo ra kết quả ly giải đồng đều và có thể so sánh được.
• Không có nhiễm chéo qua đầu dò: Mẫu được giữ kín trong quá trình siêu âm, giúp giảm sự lây nhiễm từ mẫu trước sang mẫu sau và các bước vệ sinh.
• Phù hợp với tế bào bền chắc: Siêu âm cường độ cao hỗ trợ phá vỡ thành tế bào nấm men.
• Quy trình làm việc hiệu quả: Lý tưởng để sàng lọc các chủng, dòng vô tính, điều kiện biểu hiện và dung dịch đệm ly giải.
• Quy trình làm việc hiệu quả: Các thông số cài đặt có thể lập trình, ghi dữ liệu tự động và phù hợp với tự động hóa phòng thí nghiệm.

Ứng dụng trong công nghệ sinh học nấm men và nghiên cứu khoa học sự sống

Ly giải nấm men bằng siêu âm trong đĩa vi giếng hỗ trợ nhiều quy trình nghiên cứu và sàng lọc. Trong biểu hiện protein tái tổ hợp, các dòng vô tính P. pastoris và S. cerevisiae có thể được ly giải song song để so sánh mức độ biểu hiện hoặc hoạt tính enzyme. Trong sinh học hệ thống và các lĩnh vực omics, việc chuẩn hóa quá trình ly giải giúp cải thiện khả năng so sánh giữa các điều kiện. Trong vi sinh học, xử lý siêu âm hỗ trợ chuẩn bị nhanh dịch ly giải từ nhiều chủng, điều kiện môi trường nuôi cấy hoặc biện pháp xử lý gây stress.
Các lĩnh vực ứng dụng điển hình bao gồm:

• chiết xuất protein từ nấm men
• sàng lọc protein tái tổ hợp
• sàng lọc hoạt tính enzyme
• chọn dòng vô tính sau biến nạp
• tối ưu hóa quá trình lên men
• chuẩn bị mẫu cho phân tích hệ protein
• chuẩn bị mẫu cho phân tích hệ chất chuyển hóa
• nghiên cứu phá vỡ thành tế bào
• các phép thử vi sinh có năng suất xử lý mẫu cao

Ly giải nấm men đáng tin cậy bắt đầu từ việc xử lý siêu âm có kiểm soát

Ly giải nấm men có thể trở nên khó khăn khi số lượng mẫu tăng lên, nhưng các thiết bị siêu âm đĩa vi giếng của Hielscher giúp quá trình này nhanh hơn, sạch hơn và có độ tái lập cao hơn. UIP400MTP và UIP550MTP cho phép các nhà nghiên cứu xử lý toàn bộ đĩa trong các điều kiện siêu âm xác định, nâng cao năng suất xử lý mẫu đồng thời giảm thao tác thủ công.
Đối với các nhà vi sinh học, nhà sinh học phân tử, nhà khoa học nghiên cứu protein và các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, xử lý siêu âm đĩa vi giếng là một công cụ mạnh mẽ để giải phóng các thành phần nội bào của nấm men một cách hiệu quả và có độ tái lập cao.

Tài liệu / Tài liệu tham khảo

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics 2024.