Phá vỡ tế bào nấm men trong đĩa vi giếng bằng phương pháp siêu âm cường độ cao

Các nhà vi sinh học và các nhà nghiên cứu khoa học đời sống đang làm việc với Saccharomyces cerevisiae, Mục sư Pichia / Komagataella phaffii, và các hệ thống nghiên cứu nấm men khác đều nhận thức rõ thách thức này: tế bào nấm men có độ bền cao, việc ly giải tế bào một cách nhất quán có thể gặp nhiều khó khăn, và việc phá vỡ mẫu bằng tay nhanh chóng trở thành điểm nghẽn khi cần sàng lọc nhiều chủng, dòng, điều kiện nuôi cấy hoặc cấu trúc biểu hiện.

Phương pháp ly giải nấm men công suất cao ứng dụng trong vi sinh học, sinh học phân tử và phân tích protein

Các thiết bị siêu âm cho đĩa vi giếng của Hielscher, chẳng hạn như UIP400MTP (400 W) và UIP550MTP (550 W), cung cấp giải pháp có năng suất cao để phá vỡ tế bào nấm men bằng phương pháp cơ học ngay trực tiếp trong đĩa vi giếng. Thay vì xử lý từng mẫu một bằng đầu dò, toàn bộ microplate có thể được xử lý bằng sóng siêu âm trong điều kiện đồng nhất. Điều này giúp quá trình phá vỡ tế bào nấm men bằng sóng siêu âm diễn ra nhanh hơn, có độ lặp lại cao hơn và dễ dàng tích hợp hơn vào các quy trình làm việc hiện đại trong lĩnh vực vi sinh học, biểu hiện protein, sàng lọc enzyme và các lĩnh vực omics.
Dù bạn cần tách protein tái tổ hợp từ P. pastoris, chuẩn bị dịch chiết nấm men để thực hiện các thử nghiệm enzym, phá vỡ tế bào S. cerevisiae để phân tích protein, hay sàng lọc hàng chục dòng nấm men song song, các thiết bị siêu âm vi đĩa của Hielscher đều mang lại khả năng phá vỡ tế bào mạnh mẽ dựa trên hiện tượng cavitation cùng với khả năng kiểm soát quy trình chính xác.

Tại sao tế bào nấm men cần quá trình ly giải cơ học hiệu quả

Các tế bào nấm men khó bị phân hủy hơn so với nhiều loại tế bào vi khuẩn hoặc động vật có vú vì chúng được bảo vệ bởi một thành tế bào cứng, chủ yếu bao gồm các polysaccharide, glucan, mannoprotein và chitin. Thành tế bào này mang lại sự ổn định về mặt cơ học, nhưng đồng thời cũng hạn chế sự giải phóng các protein nội bào, axit nucleic, các chất chuyển hóa và enzym.
Các phương pháp phân giải nấm men truyền thống bao gồm nghiền bằng hạt, phân giải bằng enzym, chu trình đông-rã, phân giải hóa học và siêu âm bằng đầu dò. Các phương pháp này có thể mang lại hiệu quả, nhưng cũng có những hạn chế. Phương pháp nghiền bằng hạt có thể gây ra mảnh vụn và sinh nhiệt, phân giải bằng enzym có thể làm tăng chi phí và độ biến động, còn phương pháp siêu âm bằng đầu dò trên từng mẫu riêng lẻ lại tốn nhiều thời gian khi phải xử lý số lượng mẫu lớn.
Hiện tượng xâm thực siêu âm tập trung cường độ cao khắc phục những hạn chế này bằng cách tác động các lực cắt cơ học mạnh, dao động áp suất và dòng chảy vi mô lên huyền phù nấm men. Kết quả là thành tế bào và màng tế bào bị phá vỡ nhanh chóng, quá trình giải phóng nội bào được cải thiện, đồng thời quá trình chuẩn bị mẫu trên đĩa có độ lặp lại cao.

Sử dụng sóng siêu âm trên đĩa vi giếng để chuẩn bị mẫu nấm men song song

Các thiết bị Hielscher UIP400MTP và UIP550MTP được thiết kế để thực hiện quá trình siêu âm đồng đều trên các tấm vi giếng, tấm đa giếng, tấm PCR và các giá đựng mẫu phù hợp. Khác với phương pháp siêu âm bằng đầu dò, các mẫu không cần phải được xử lý riêng lẻ. Toàn bộ tấm được tiếp xúc với năng lượng siêu âm được kiểm soát, giúp quy trình làm việc này rất phù hợp cho việc xử lý mẫu song song.

Điều này đặc biệt hữu ích cho:

• Kiểm tra Men bánh mì các chủng đột biến hoặc chủng biểu hiện
• Quá trình phân giải Cha, người chăn chiên / K. phaffii các dòng tế bào nhân bản sau khi biểu hiện protein tái tổ hợp
• Chuẩn bị dịch chiết nấm men để thực hiện các thử nghiệm enzym
• Chiết xuất protein để thực hiện các phương pháp SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS hoặc thử nghiệm hoạt tính
• Giải phóng các chất chuyển hóa nội bào phục vụ nghiên cứu chuyển hóa học
• Chuẩn bị mẫu DNA và RNA sau khi đã tiến hành các bước tinh chế phù hợp ở giai đoạn tiếp theo
• Tối ưu hóa với năng suất cao đối với dung dịch ly giải, các chất phụ gia và điều kiện chiết xuất

Cơ chế phá vỡ tế bào nấm men của hiện tượng xâm thực siêu âm

Trong quá trình siêu âm, sóng siêu âm tập trung công suất cao tạo ra các chu kỳ nén và giãn xen kẽ trong mẫu chất lỏng. Khi cường độ đủ lớn, những dao động áp suất này gây ra hiện tượng xâm thực âm thanh. Các bong bóng xâm thực hình thành, dao động và vỡ tan, tạo ra các lực cắt cục bộ, các tia nước vi mô, hiện tượng nhiễu loạn và độ dốc áp suất mạnh.
Trong huyền phù nấm men, các tác động cơ học này làm suy yếu và phá vỡ thành tế bào và màng tế bào. Các protein nội bào, enzym, axit nucleic và các chất chuyển hóa được giải phóng vào dung dịch đệm ly giải. Do quá trình này mang tính cơ học, nó có thể được áp dụng với nhiều hệ thống dung dịch đệm khác nhau và có thể kết hợp với các chất ức chế protease, chất khử, chất tẩy rửa, muối hoặc quá trình tiền xử lý enzym nhẹ.

Quy trình chung: Phá vỡ tế bào nấm men trong đĩa vi giếng

Quy trình sau đây cung cấp một điểm khởi đầu thực tiễn cho quá trình ly giải nấm men bằng máy siêu âm vi đĩa Hielscher UIP400MTP hoặc UIP550MTP. Các thông số cần được tối ưu hóa tùy theo chủng nấm men, mật độ tế bào, phân tử mục tiêu, thành phần dung dịch đệm, loại đĩa và phương pháp phân tích tiếp theo.

1. Thu hoạch và rửa tế bào nấm men

Nuôi cấy Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces hoặc một chủng nấm men khác trong các điều kiện nuôi cấy mong muốn. Thu hoạch tế bào bằng cách ly tâm và loại bỏ môi trường nuôi cấy. Rửa cặn tế bào bằng nước cất lạnh, PBS hoặc dung dịch ly giải đã chọn để loại bỏ các thành phần môi trường còn sót lại có thể gây nhiễu cho các bước phân tích tiếp theo.
Để chiết xuất protein, hãy giữ mẫu ở nhiệt độ thấp và thao tác nhanh chóng. Nếu lo ngại về enzyme phân giải protein, hãy làm lạnh trước tất cả các dung dịch đệm và vật tư tiêu hao.

2. Làm lơ lửng lại cặn tế bào

Hòa tan lại cặn men trong dung dịch đệm ly giải lạnh thích hợp. Để giải phóng protein hiệu quả, mật độ tế bào cao thường mang lại lợi thế. Để bắt đầu, hãy sử dụng khoảng 10–20% (w/v) cặn tế bào ướt hoặc một hỗn dịch đặc tương ứng với giá trị OD₆₀₀ > 10, tùy thuộc vào phương pháp xét nghiệm.

Một dung dịch đệm ly giải protein nấm men điển hình có thể chứa:

• hệ đệm như Tris-HCl, đệm photphat hoặc HEPES
• muối như NaCl hoặc KCl
• Cocktail ức chế protease
• chất khử tùy chọn như DTT hoặc β-mercaptoethanol
• chất tẩy rửa tùy chọn như Triton X-100, NP-40, SDS hoặc CHAPS, tùy thuộc vào khả năng tương thích với các công đoạn tiếp theo
• Các chất ức chế phosphatase tùy chọn dùng trong các nghiên cứu về quá trình phosphoryl hóa

Đối với các chủng nấm men khó xử lý hoặc trong trường hợp chiết xuất protein một cách cực kỳ nhẹ nhàng, có thể thực hiện một quá trình tiền xử lý ngắn bằng Zymolyase, Lyticase hoặc một loại enzyme phân giải thành tế bào khác trước khi tiến hành siêu âm. Quá trình tiền xử lý bằng enzyme này là tùy chọn nhưng có thể giúp nâng cao hiệu suất phân giải tế bào hoặc giảm cường độ siêu âm cần thiết.

3. Chuyển các mẫu vào một tấm vi giếng phù hợp

Đổ hỗn hợp men vào đĩa vi giếng tương thích với siêu âm. Người ta thường ưu tiên sử dụng đĩa đáy tròn vì loại đĩa này giúp thu thập mẫu hiệu quả hơn và giảm thiểu các vùng chết. Nên sử dụng thể tích mẫu bằng nhau cho các giếng để nâng cao độ lặp lại.
Dùng tấm hoặc màng đậy kín phù hợp để đậy kín đĩa, nhằm ngăn chặn sự bay hơi, sự hình thành aerosol và ô nhiễm chéo. Đảm bảo rằng vật liệu đậy kín tương thích với nhiệt độ và các điều kiện siêu âm đã chọn.
Thể tích làm việc thông thường phụ thuộc vào định dạng đĩa và ứng dụng. Các định dạng phổ biến bao gồm đĩa 96 giếng, đĩa giếng sâu, đĩa PCR hoặc giá đựng ống phù hợp.

4. Cài đặt hệ thống làm mát

Quá trình phân giải nấm men đòi hỏi cường độ siêu âm cao, và sự phá vỡ cơ học sẽ sinh ra nhiệt. Do đó, việc kiểm soát nhiệt độ là vô cùng quan trọng, đặc biệt đối với các phân tích liên quan đến protein, enzyme, RNA hoặc quá trình phosphoryl hóa.

Áp dụng chiến lược làm mát phù hợp, chẳng hạn như:

• dung dịch ly giải đã làm lạnh sẵn
• vi mảng đã được làm lạnh trước
• thời gian ngắt để làm mát giữa các khoảng thời gian siêu âm
• làm mát bên ngoài cho bệ siêu âm, nếu có

Mục tiêu là duy trì nhiệt độ mẫu đủ thấp để ngăn chặn sự biến tính của protein, sự bất hoạt của enzyme, sự phân hủy RNA và sự biến động của mẫu do nhiệt gây ra.

5. Xử lý bằng sóng siêu âm hỗn hợp men

Đặt đĩa đã được niêm phong vào máy siêu âm vi đĩa Hielscher UIP400MTP hoặc UIP550MTP và chọn chương trình siêu âm dạng xung. Nên sử dụng chế độ xung vì chế độ này cho phép phá vỡ cơ học trong các pha “ON” và tản nhiệt trong các pha “OFF”.
Để bắt đầu quá trình phá vỡ tế bào nấm men:

Đối với các huyền phù nấm men có độ kháng cao, khối lượng sinh khối P. pastoris dày đặc hoặc các trường hợp chiết xuất protein tái tổ hợp khó khăn, hãy tăng dần thời gian bật tích lũy theo từng bước. Đối với các protein nhạy cảm với nhiệt hoặc các thử nghiệm enzyme, hãy sử dụng các xung ngắn hơn, thời gian ngưng làm mát dài hơn và biên độ ban đầu thấp hơn.

Quá trình ly giải nấm men với năng suất cao trên đĩa nhiều giếng bằng máy UIP400MTP

6. Làm trong dịch chiết

Sau khi xử lý bằng sóng siêu âm, tiến hành ly tâm đĩa vi giếng hoặc chuyển các mẫu vào ống để ly tâm. Loại bỏ các mảnh vụn tế bào bằng cách ly tâm ở tốc độ và nhiệt độ thích hợp. Thu thập phần dịch nổi để tiến hành các bước phân tích tiếp theo.

Tùy thuộc vào mục đích sử dụng, dịch chiết có thể được dùng để:

• Định lượng protein
• các phương pháp định lượng hoạt tính enzym
• SDS-PAGE và phương pháp Western blotting
• ELISA và các phương pháp xét nghiệm miễn dịch
• Phân tích protein bằng phương pháp LC-MS/MS
• phân tích chất chuyển hóa
• Tách chiết DNA hoặc RNA

7. Tối ưu hóa và lập tài liệu về phương pháp

Để đảm bảo quá trình ly giải nấm men có thể lặp lại, hãy ghi chép lại tất cả các thông số liên quan, bao gồm chủng nấm men, điều kiện nuôi cấy và giá trị OD₆₀₀, khối lượng tế bào ướt, thành phần dung dịch đệm, loại đĩa, thể tích mẫu, biên độ, chu kỳ xung, thời gian bật tích lũy, phương pháp làm mát và nhiệt độ cuối cùng của mẫu.
Nếu máy siêu âm Hielscher được trang bị tính năng ghi dữ liệu tự động, dữ liệu quy trình có thể được sử dụng cho việc lập hồ sơ, phát triển phương pháp, mở rộng quy mô và kiểm soát chất lượng.

Một số mẹo tối ưu hóa quá trình phân giải nấm men

Để đạt được hiệu quả giải phóng protein tối đa, hãy sử dụng huyền phù men có mật độ cao, cường độ siêu âm cao và thời gian hoạt động tích lũy đủ dài. Đối với các protein nhạy cảm, hãy giảm biên độ, kéo dài thời gian tạm dừng làm mát và giữ cho đĩa luôn lạnh trong suốt quá trình chạy.
Nếu quá trình ly giải chưa hoàn toàn, hãy tăng dần thời gian siêu âm, thử phương pháp tiền xử lý bằng enzym, giảm độ nhớt của mẫu hoặc tối ưu hóa dung dịch đệm. Nếu protein bị phân hủy hoặc mất hoạt tính, hãy cải thiện hệ thống làm mát, rút ngắn khoảng thời gian bật (ON), thêm chất ức chế và xác minh rằng hệ thống chất tẩy rửa tương thích với protein mục tiêu.
Do các chủng nấm men có sự khác biệt đáng kể về cấu trúc thành tế bào, giai đoạn sinh trưởng, hệ thống biểu hiện và mật độ sinh khối, nên sử dụng một ma trận tối ưu hóa ngắn gọn. Ví dụ, hãy thử nghiệm ba mức biên độ, hai chu kỳ xung và hai tổng thời gian bật, sau đó đánh giá hiệu suất ly giải và tính toàn vẹn của protein.

Ưu điểm của máy siêu âm vi mảng Hielscher trong quá trình phân giải nấm men

Máy siêu âm vi đĩa Hielscher là giải pháp lý tưởng cho các phòng thí nghiệm cần quá trình phá vỡ tế bào có thể lặp lại trên nhiều mẫu. Thiết bị này giúp loại bỏ quy trình xử lý chậm chạp “mỗi lần một mẫu” của phương pháp siêu âm bằng đầu dò, đồng thời giảm thiểu sự biến động do việc định vị đầu dò thủ công, độ sâu ngâm và sự khác biệt trong cách xử lý giữa các mẫu.

Các ưu điểm chính bao gồm:

• Xử lý thông lượng cao: Tiến hành xử lý bằng sóng siêu âm nhiều mẫu nấm men cùng lúc trong các đĩa vi giếng hoặc giá đựng mẫu tương thích.
• Điều kiện có thể tái tạo: Áp dụng cùng các điều kiện siêu âm cho tất cả các giếng để đảm bảo kết quả phân giải đồng nhất và có thể so sánh được.
• Không có nguy cơ lây nhiễm chéo giữa các đầu dò: Các mẫu vẫn được niêm phong trong suốt quá trình xử lý bằng sóng siêu âm, giúp giảm thiểu hiện tượng lây nhiễm chéo và số bước vệ sinh.
• Phù hợp với các tế bào có khả năng chịu đựng cao: Sóng siêu âm cường độ cao giúp phá vỡ thành tế bào nấm men.
• Quy trình làm việc hiệu quả: Rất thích hợp để sàng lọc các chủng, các dòng vô tính, các điều kiện biểu hiện và các dung dịch ly giải.
• Quy trình làm việc hiệu quả: Các cài đặt có thể lập trình, tính năng ghi dữ liệu tự động và phù hợp với tự động hóa phòng thí nghiệm.

Các ứng dụng trong công nghệ sinh học nấm men và nghiên cứu khoa học đời sống

Phương pháp ly giải nấm men bằng sóng siêu âm trong đĩa vi giếng hỗ trợ nhiều quy trình nghiên cứu và sàng lọc. Trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp, các dòng P. pastoris và S. cerevisiae có thể được ly giải song song để so sánh mức độ biểu hiện hoặc hoạt tính enzym. Trong sinh học hệ thống và các lĩnh vực omics, quá trình ly giải được tiêu chuẩn hóa giúp nâng cao tính so sánh giữa các điều kiện khác nhau. Trong vi sinh học, siêu âm hỗ trợ việc chuẩn bị nhanh chóng các dịch chiết từ nhiều chủng vi sinh vật, điều kiện môi trường nuôi cấy hoặc các phương pháp xử lý gây stress.
Các lĩnh vực ứng dụng điển hình bao gồm:

• chiết xuất protein từ men
• sàng lọc protein tái tổ hợp
• sàng lọc hoạt tính enzym
• Lựa chọn dòng vô tính sau khi biến đổi gen
• tối ưu hóa quá trình lên men
• Chuẩn bị mẫu trong proteomics
• Chuẩn bị mẫu trong lĩnh vực chuyển hóa học
• các nghiên cứu về sự phá vỡ thành tế bào
• các phương pháp xét nghiệm vi sinh học có năng suất cao

Quá trình phân giải nấm men đáng tin cậy bắt đầu từ việc kiểm soát quá trình siêu âm

Việc phá vỡ tế bào nấm men có thể gặp khó khăn khi số lượng mẫu tăng lên, nhưng các thiết bị siêu âm cho đĩa vi lượng của Hielscher giúp quá trình này diễn ra nhanh hơn, sạch hơn và có độ lặp lại cao hơn. Các model UIP400MTP và UIP550MTP cho phép các nhà nghiên cứu xử lý toàn bộ đĩa vi lượng trong các điều kiện siêu âm được định trước, từ đó nâng cao năng suất đồng thời giảm thiểu thao tác thủ công.
Đối với các nhà vi sinh học, nhà sinh học phân tử, nhà khoa học chuyên về protein và các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, phương pháp siêu âm trên đĩa vi giếng là một công cụ hiệu quả giúp giải phóng các thành phần nội bào của nấm men một cách hiệu quả và có tính lặp lại cao.

Văn học / Tài liệu tham khảo