Xử lý siêu âm đĩa vi giếng trong phân tích hệ protein shotgun – Ghi chú ứng dụng

Phân tích hệ protein shotgun phụ thuộc vào việc chuẩn bị mẫu hiệu quả, có độ tái lập cao để chuyển vật liệu sinh học phức tạp thành các peptide sẵn sàng cho LC-MS/MS. Máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP hỗ trợ quá trình này bằng cách cho phép xử lý siêu âm song song, được chuẩn hóa đối với các mẫu thể tích nhỏ, giúp các phòng thí nghiệm cải thiện khả năng phá vỡ, chiết xuất và hòa tan lại trong các quy trình sử dụng đĩa vi giếng. Ghi chú ứng dụng này mô tả cách tích hợp UIP400MTP vào quá trình chuẩn bị mẫu phân tích hệ protein, sử dụng một quy trình xử lý túi ngoại bào đã được công bố từ các nghiên cứu PLA2G12A/Th17 làm ví dụ đã được kiểm nghiệm trong phòng thí nghiệm.

Xử lý siêu âm đĩa vi giếng để phân tích hệ protein shotgun có độ tái lập cao hơn

Đối với các nhà nghiên cứu hệ protein, việc chuẩn bị mẫu có độ tái lập cao là yếu tố then chốt để thu được dữ liệu LC-MS/MS chất lượng cao. Máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP hỗ trợ xử lý siêu âm song song, được chuẩn hóa trong các quy trình sử dụng đĩa và các quy trình có thể tích mẫu nhỏ/năng suất xử lý mẫu cao.

Thiết bị đặc biệt hữu ích cho các phòng thí nghiệm làm việc với:

• Các bộ mẫu lớn đòi hỏi xử lý nhất quán trên nhiều giếng
• Vật liệu có lượng đầu vào hạn chế, trong đó cần giảm thiểu thất thoát mẫu và độ biến thiên
• Các mẫu giàu lipid, chẳng hạn như túi ngoại bào
• Các chế phẩm sinh học phức tạp đòi hỏi phá vỡ, chiết xuất hoặc hòa tan lại hiệu quả
• Phân tích so sánh hệ protein shotgun, trong đó độ tái lập giữa các điều kiện và các lần lặp lại là thiết yếu

Bằng cách tích hợp xử lý siêu âm đĩa vi giếng trước bước phân giải protein, các nhà nghiên cứu có thể giúp mẫu sẵn sàng hơn cho:

• Chiết xuất và hòa tan lại protein
• Phân giải protein bằng trypsin/Lys-C
• Thu nhận dữ liệu nano-LC/MS/MS
• Phân tích định lượng hệ protein ở các bước tiếp theo

Xử lý siêu âm đĩa vi giếng có thể mang lại lợi ích cho:

• Các cơ sở dịch vụ dùng chung về phân tích hệ protein
• Các phòng thí nghiệm nghiên cứu EV
• Các phòng thí nghiệm miễn dịch học và sinh học tế bào
• Các nhóm nghiên cứu chuyển giao ứng dụng
• Các nhóm khoa học sự sống đang mở rộng từ chuẩn bị từng mẫu sang các quy trình có năng suất xử lý mẫu cao hơn

Chuẩn bị mẫu năng suất cao cho phân tích hệ protein của túi ngoại bào

Phân tích hệ protein shotgun là gì?

Phân tích hệ protein shotgun đã trở thành một chiến lược phân tích chủ đạo để xác định đặc điểm của các mẫu sinh học phức tạp, từ dịch ly giải toàn tế bào và dịch chiết mô đến các bào quan đã tinh sạch, túi ngoại bào và các mẫu bệnh phẩm lâm sàng có lượng đầu vào thấp. Thế mạnh cốt lõi của phương pháp này nằm ở sự kết hợp giữa phân giải protein, sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần có độ phân giải cao và suy luận protein từ peptide bằng phương pháp tính toán. Tuy nhiên, chất lượng của bộ dữ liệu hệ protein cuối cùng được quyết định từ rất lâu trước khi mẫu đến máy khối phổ. Phá vỡ mẫu hiệu quả, hòa tan protein, loại bỏ các chất gây nhiễu, phân giải bằng enzyme có độ tái lập cao và thu hồi peptide ổn định đều là những yếu tố quyết định độ sâu bao phủ và độ tin cậy của phép định lượng.
Đối với các nhà nghiên cứu hệ protein và các phòng thí nghiệm khoa học sự sống làm việc với lượng mẫu hạn chế hoặc mẫu quý, chuẩn bị mẫu thường là khâu gây tắc nghẽn.

Thách thức của túi ngoại bào trong phân tích hệ protein

Ví dụ, các túi ngoại bào (EV) là một nhóm mẫu đặc biệt khó xử lý. Đây là những hạt có màng bao bọc, giàu lipid, có kích thước nano, với hiệu suất thu hồi protein tương đối thấp và nguy cơ cao kéo theo lipid, muối, chất tẩy rửa, protein huyết thanh và các thành phần nền mẫu khác. Những đặc điểm này có thể ảnh hưởng đến hiệu quả phân giải, hiệu năng sắc ký, độ ổn định của quá trình phun điện và việc định danh peptide. Do đó, quy trình chuẩn bị mẫu để phân tích hệ protein của EV phải đủ mạnh để phá vỡ cấu trúc túi và hòa tan các protein chứa trong túi, đồng thời vẫn tương thích với quá trình phân giải bằng enzyme và phân tích LC-MS/MS ở các bước tiếp theo.
Trong bối cảnh này, xử lý siêu âm tương thích với đĩa vi giếng mang lại một phương pháp thực tiễn để xử lý mẫu song song với khả năng tái lập. Các mẫu máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP (400 W) và UIP550MTP (550 W) của Hielscher được thiết kế để xử lý siêu âm các mẫu trong đĩa nhiều giếng và dụng cụ chứa thể tích nhỏ, hỗ trợ các quy trình có năng suất xử lý mẫu cao hơn so với máy siêu âm một đầu dò thông thường. Đối với các phòng thí nghiệm nghiên cứu hệ protein, hình thức này hấp dẫn vì có thể giảm biến thiên do thao tác thủ công, cải thiện khả năng xử lý song song nhiều mẫu và tích hợp tự nhiên hơn vào các quy trình chuẩn bị mẫu trên đĩa.

Quy trình minh họa

Một quy trình phân tích hệ protein của túi ngoại bào gần đây trong nghiên cứu sinh học tế bào Th17 do PLA2G12A chi phối cung cấp một ví dụ hữu ích, đã được kiểm nghiệm trong phòng thí nghiệm, về cách tích hợp máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP vào quá trình chuẩn bị mẫu cho phân tích hệ protein shotgun. Trong loạt nghiên cứu đó, các mẫu EV được xử lý để phân tích hệ protein bằng cách xử lý với methanol, xử lý siêu âm bằng UIP400MTP, ly tâm, làm khô, phân giải bằng trypsin/Lys-C và phân tích bằng sắc ký lỏng dòng nano ghép khối phổ hai lần độ phân giải cao. Công trình nghiên cứu sinh học này được Mochizuki-Ono và cộng sự công bố năm 2026, trong đó phân tích hệ protein giúp làm rõ cách PLA2G12A làm thay đổi các protein chứa trong EV trong bối cảnh các đáp ứng tế bào T gây bệnh.

Máy siêu âm đĩa đa giếng UIP400MTP

Tại sao nên xử lý bằng siêu âm trên đĩa vi giếng?
UIP400MTP cho phép xử lý song song các mẫu thể tích nhỏ bằng siêu âm theo điều kiện chuẩn hóa. Điều này hữu ích khi khả năng tái lập, lượng mẫu đầu vào thấp và năng suất xử lý nhiều mẫu là những yếu tố quan trọng.


Danh sách kiểm tra kiểm soát chất lượng

• Xác nhận lượng EV đầu vào tương đương protein bằng nhau ở tất cả các mẫu.
• Sử dụng cách bố trí xử lý mẫu ngẫu nhiên hoặc cân bằng.
• Giữ nhất quán thể tích metanol, thời gian xử lý bằng siêu âm, thời gian làm khô và thể tích phân giải bằng enzyme.
• Theo dõi lượng peptide thu được và tổng số protein được định danh.
• Kiểm tra tỷ lệ bỏ sót vị trí cắt và phân bố chiều dài peptide.
• Kiểm tra hình dạng đỉnh sắc ký và khả năng tái lập thời gian lưu.
• Bổ sung mẫu trắng để theo dõi hiện tượng tồn dư từ mẫu trước.
• Sử dụng mẫu QC gộp cho các nghiên cứu lớn hơn.
• Đánh giá hệ số biến thiên giữa các mẫu lặp.
• Sử dụng PCA hoặc các phương pháp liên quan để xác định hiệu ứng lô hoặc các mẫu ngoại lai.

Khuyến nghị ghi chép quy trình

Khi công bố hoặc lập tài liệu về quy trình này, hãy báo cáo lượng EV đầu vào, định dạng đĩa, thể tích metanol, biên độ và thời gian xử lý bằng siêu âm của UIP400MTP, điều kiện ly tâm, phương pháp làm khô, dung dịch đệm phân giải bằng enzyme, nồng độ enzyme, thời gian phân giải bằng enzyme, điều kiện axit hóa, nền tảng LC-MS/MS, chế độ thu nhận dữ liệu, phiên bản phần mềm, cơ sở dữ liệu, ngưỡng FDR, phương pháp chuẩn hóa và quy trình phân tích thống kê.
Tất cả các máy siêu âm đĩa vi thể của Hielscher đều tự động ghi lại các thông số quy trình quan trọng như biên độ, thời gian siêu âm và nhiệt độ, kèm dấu thời gian ghi ngày và giờ, dưới dạng tệp CVS trên thẻ SD tích hợp. Việc ghi nhật ký dữ liệu để đảm bảo khả năng tái lập và kiểm soát chất lượng chưa bao giờ dễ dàng hơn thế!

Chi tiết nghiên cứu: Phân tích hệ protein shotgun của EV trong nghiên cứu PLA2G12A

Nghiên cứu PLA2G12A cung cấp một ví dụ cụ thể về việc sử dụng UIP400MTP trong quy trình phân tích hệ protein shotgun. Câu hỏi sinh học được đặt ra là phospholipase PLA2G12A được tiết ra biến đổi các túi ngoại bào có nguồn gốc từ tế bào Th17 như thế nào và qua đó ảnh hưởng đến sự biệt hóa tế bào T gây bệnh ra sao. Các tác giả cho thấy PLA2G12A tác động lên màng EV để tạo ra các lysophospholipid, bao gồm 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, và tín hiệu axit lysophosphatidic ở hạ nguồn qua LPA2 góp phần vào sự biệt hóa Th17. Ngoài tín hiệu lipid, các nghiên cứu còn khảo sát thành phần được EV mang theo, bao gồm RNA và protein, khiến phân tích hệ protein shotgun trở thành một thành phần quan trọng trong chiến lược xác định đặc tính.
Trong quy trình chuẩn bị EV, tế bào Th17 được nuôi trong môi trường chứa huyết thanh thai bò đã loại bỏ exosome. Dịch nổi nuôi cấy trước tiên được ly tâm để loại bỏ tế bào, lọc qua bộ lọc 0,22 µm, cô đặc bằng siêu lọc/siêu ly tâm, rửa, tái huyền phù trong PBS và định lượng bằng phép thử protein BCA. Bước chuẩn bị EV ở thượng nguồn này bảo đảm có thể đưa một lượng vật liệu EV xác định theo lượng protein tương đương vào quy trình phân tích hệ protein.
Để phân tích hệ protein shotgun, các tác giả sử dụng các mẫu EV tương ứng với lượng protein tương đương 5 µg. Các mẫu này được làm khô trong ống PCR, sau đó bổ sung 25 µL methanol. Tiếp theo, các mẫu được xử lý siêu âm trong 3 phút bằng máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP. Sau khi xử lý siêu âm, các mẫu được ly tâm ở 4°C trong 20 phút với lực ly tâm 19.000 × g. Sau khi loại bỏ 20 µL dịch nổi, các mẫu được ly tâm đến khô. Sau đó, protein được hòa tan bằng xử lý siêu âm trong 4 µL dung dịch trypsin/Lys-C ở nồng độ 100 ng/µL trong amoni bicacbonat 50 mM. Quá trình phân giải được thực hiện trong 2 giờ ở 37°C, lắc ở 300 rpm. Sản phẩm phân giải được axit hóa bằng 1 µL axit trifluoroacetic 1,25% và đưa vào phân tích bằng sắc ký lỏng dòng nano ghép khối phổ hai lần có độ phân giải cao.
Quy trình này làm nổi bật một số nguyên tắc hữu ích cho phân tích hệ protein EV với lượng mẫu đầu vào thấp. Thứ nhất, lượng mẫu đầu vào được chuẩn hóa theo lượng protein tương đương, điều này quan trọng khi so sánh EV từ các kiểu gen hoặc điều kiện xử lý khác nhau. Thứ hai, methanol được sử dụng trước khi xử lý siêu âm, hỗ trợ phá vỡ và chiết xuất, đồng thời tránh các hệ chất tẩy rửa có thể làm phức tạp việc phân tích LC-MS/MS. Thứ ba, bước xử lý siêu âm ngắn và được chuẩn hóa, phù hợp với việc xử lý mẫu song song. Thứ tư, quá trình phân giải bằng trypsin/Lys-C được thực hiện trong thể tích rất nhỏ, giúp giảm pha loãng và hỗ trợ thu hồi peptide từ lượng mẫu đầu vào thấp. Cuối cùng, việc chuyển trực tiếp từ phân giải sang axit hóa và LC-MS/MS giúp giảm thiểu các bước thao tác không cần thiết.
Phương pháp LC-MS/MS ở hạ nguồn sử dụng kỹ thuật phân tách pha đảo dòng nano ghép với máy khối phổ Q-Exactive HF Orbitrap. Các mẫu được giữ lại trên tiền cột C18, sau đó được phân tách trên cột phân tích có đường kính trong 50 µm ở lưu lượng 200 nL/min và nhiệt độ 40°C. Chương trình gradient bắt đầu từ hàm lượng dung môi hữu cơ thấp đến 35% dung môi B trong 60 phút, tiếp theo là rửa với hàm lượng dung môi hữu cơ cao và tái cân bằng. Việc thu nhận dữ liệu MS được thực hiện ở chế độ ion dương, sử dụng phương thức thu nhận dữ liệu độc lập với sự phân ly do va chạm năng lượng cao hơn. Các tệp dữ liệu DIA thô được phân tích bằng DIA-NN 1.8 với thư viện phổ được dự đoán bằng phương pháp in silico.