Sử dụng sóng siêu âm trên đĩa vi giếng trong phân tích proteomics kiểu Shotgun – Hướng dẫn ứng dụng

Phân tích proteomics kiểu Shotgun phụ thuộc vào quy trình chuẩn bị mẫu hiệu quả và có thể lặp lại để chuyển đổi vật liệu sinh học phức tạp thành các peptit sẵn sàng cho phân tích LC-MS/MS. Máy siêu âm microplate UIP400MTP hỗ trợ quy trình này bằng cách cho phép thực hiện siêu âm theo tiêu chuẩn và song song trên các mẫu có thể tích nhỏ, giúp các phòng thí nghiệm cải thiện hiệu quả quá trình phá vỡ, chiết xuất và tái hòa tan trong các quy trình làm việc dựa trên microplate. Bài viết ứng dụng này mô tả cách tích hợp máy UIP400MTP vào quy trình chuẩn bị mẫu proteomics, sử dụng quy trình xử lý túi ngoại bào đã được công bố từ các nghiên cứu về PLA2G12A/Th17 làm ví dụ đã được kiểm chứng trong phòng thí nghiệm.

Sử dụng sóng siêu âm trên đĩa vi giếng để tăng độ tái hiện trong phân tích proteomics kiểu Shotgun

Đối với các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực proteomics, việc chuẩn bị mẫu có thể tái hiện là yếu tố then chốt để thu được dữ liệu LC-MS/MS chất lượng cao. Máy siêu âm vi đĩa UIP400MTP hỗ trợ quá trình siêu âm tiêu chuẩn hóa và song song trong các quy trình làm việc dựa trên đĩa cũng như các quy trình có thể tích nhỏ và năng suất cao.

Điều này đặc biệt hữu ích cho các phòng thí nghiệm hoạt động trong các lĩnh vực:

• Các bộ mẫu lớn đòi hỏi phải được xử lý thống nhất trên nhiều giếng
• Vật liệu có lượng đầu vào hạn chế, trong đó cần phải giảm thiểu tối đa sự mất mát và độ biến động của mẫu
• Các mẫu giàu lipid, chẳng hạn như các túi ngoại bào
• Các chế phẩm sinh học phức tạp đòi hỏi phải thực hiện quá trình phá vỡ, chiết xuất hoặc tái hòa tan một cách hiệu quả
• Phân tích proteomics kiểu shotgun so sánh, trong đó tính tái hiện giữa các điều kiện và các lần lặp lại là yếu tố thiết yếu

Bằng cách kết hợp quá trình xử lý bằng sóng siêu âm trên đĩa vi giếng trước khi phân giải, các nhà nghiên cứu có thể nâng cao chất lượng mẫu để phục vụ cho:

• Chiết xuất và tái hòa tan protein
• Quá trình phân giải bằng trypsin/Lys-C
• Thu thập dữ liệu Nano-LC/MS/MS
• Phân tích proteomics định lượng ở giai đoạn sau

 

Hãy mở rộng quy mô chuẩn bị mẫu proteomics của bạn một cách tự tin!
Tìm hiểu cách thức sử dụng sóng siêu âm trên đĩa vi giếng giúp giảm thiểu sự biến động do thao tác thủ công, cải thiện quá trình phân tán mẫu và chuẩn bị các mẫu sinh học phức tạp để phân tích LC-MS/MS với độ tin cậy cao.

Yêu cầu thông tin


Địa chỉ email (bắt buộc)


Sản phẩm hoặc lĩnh vực quan tâm



Tôi đồng ý với Chính sách bảo mật









Yêu cầu thông tin

Việc sử dụng sóng siêu âm trên đĩa vi giếng có thể mang lại những lợi ích sau:

• Các cơ sở trọng điểm về proteomics
• Các phòng thí nghiệm nghiên cứu xe điện
• Các phòng thí nghiệm về miễn dịch học và sinh học tế bào
• Các nhóm nghiên cứu ứng dụng
• Các nhóm nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học đời sống đang mở rộng quy mô từ việc chuẩn bị mẫu đơn lẻ sang các quy trình làm việc có năng suất cao hơn

Chuẩn bị mẫu với năng suất cao để phân tích proteome của các túi ngoại bào

Proteomics Shotgun là gì?

Phân tích proteomics kiểu Shotgun đã trở thành một chiến lược phân tích then chốt để đặc trưng hóa các mẫu sinh học phức tạp, từ dịch tế bào toàn phần và chiết xuất mô đến các bào quan tinh khiết, các túi ngoại bào và các mẫu lâm sàng có lượng đầu vào thấp. Điểm mạnh cốt lõi của phương pháp này nằm ở sự kết hợp giữa quá trình phân giải protein, sắc ký lỏng độ phân giải cao kết hợp với phổ khối lượng ghép đôi (LC-MS/MS) và quá trình suy luận peptide-to-protein bằng phương pháp tính toán. Tuy nhiên, chất lượng của bộ dữ liệu proteome cuối cùng đã được quyết định từ rất lâu trước khi mẫu đến máy phổ khối lượng. Việc phá vỡ mẫu hiệu quả, hòa tan protein, loại bỏ các chất gây nhiễu, quá trình tiêu hóa enzym có thể lặp lại và thu hồi peptit ổn định đều là những yếu tố quyết định đối với độ sâu bao phủ và độ tin cậy về mặt định lượng.
Đối với các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực proteomics và các phòng thí nghiệm khoa học đời sống phải làm việc với các mẫu có số lượng hạn chế hoặc quý hiếm, việc chuẩn bị mẫu thường là điểm nghẽn.

Thách thức của các túi ngoại bào trong lĩnh vực proteomics

Ví dụ, các túi ngoại bào (EVs) là một loại mẫu đặc biệt khó xử lý. Chúng là những hạt có kích thước nano, được bao bọc bởi màng, giàu lipid, với hàm lượng protein tương đối thấp và có nguy cơ cao bị lẫn các chất như lipid, muối, chất tẩy rửa, protein huyết thanh và các thành phần nền khác. Những đặc điểm này có thể cản trở hiệu quả tiêu hóa, hiệu suất sắc ký, độ ổn định khi phun điện và việc xác định peptit. Do đó, quy trình chuẩn bị cho phân tích proteomics của EVs phải đủ mạnh để phá vỡ cấu trúc của các vesicle và hòa tan protein bên trong, đồng thời vẫn tương thích với quá trình tiêu hóa enzym và phân tích LC-MS/MS ở các bước tiếp theo.
Trong bối cảnh này, công nghệ siêu âm tương thích với đĩa vi giếng mang lại một phương pháp thực tiễn để xử lý mẫu một cách lặp lại và song song. Các mẫu máy siêu âm vi mảng Hielscher UIP400MTP (400 W) và UIP550MTP (550 W) được thiết kế để siêu âm mẫu trong các đĩa nhiều giếng và bình chứa thể tích nhỏ, hỗ trợ quy trình làm việc có năng suất cao hơn so với các máy siêu âm đầu dò đơn thông thường. Đối với các phòng thí nghiệm proteomics, định dạng này rất hấp dẫn vì nó có thể giảm thiểu sự biến động do thao tác thủ công, cải thiện khả năng xử lý song song nhiều mẫu và tích hợp một cách tự nhiên hơn vào các quy trình chuẩn bị mẫu dựa trên đĩa.

Quy trình làm việc mẫu mực

Một quy trình phân tích proteomics dựa trên các tiểu thể ngoại bào gần đây trong lĩnh vực sinh học tế bào Th17 do PLA2G12A điều khiển đã cung cấp một ví dụ hữu ích và đã được kiểm chứng trong phòng thí nghiệm về cách tích hợp máy siêu âm trên đĩa vi giếng UIP400MTP vào quy trình chuẩn bị mẫu cho phân tích proteomics kiểu shotgun. Trong loạt nghiên cứu đó, các mẫu EV đã được xử lý để phân tích proteome bằng cách sử dụng xử lý methanol, siêu âm UIP400MTP, ly tâm, sấy khô, tiêu hóa trypsin/Lys-C và nano-flow LC-MS ghép đôi độ phân giải cao. Công trình sinh học này ban đầu được công bố dưới dạng bản in trước trên bioRxiv và sau đó được đăng trên tạp chí Cell Reports, trong đó phân tích proteomics đã giúp mô tả cách thức PLA2G12A làm thay đổi các protein vận chuyển trong EV trong bối cảnh phản ứng của tế bào T gây bệnh.

Sonicator tấm đa giếng UIP400MTP

Tại sao lại sử dụng phương pháp siêu âm trên đĩa vi giếng?
Thiết bị UIP400MTP cho phép thực hiện quá trình siêu âm song song và tiêu chuẩn hóa đối với các mẫu có thể tích nhỏ. Điều này rất hữu ích trong những trường hợp mà tính lặp lại, lượng mẫu đầu vào ít và năng suất xử lý nhiều mẫu là những yếu tố quan trọng.

Danh sách kiểm tra chất lượng

• Xác nhận rằng lượng protein tương đương EV đưa vào là như nhau ở tất cả các mẫu.
• Sử dụng các sơ đồ xử lý mẫu ngẫu nhiên hoặc cân bằng.
• Giữ cho thể tích methanol, thời gian siêu âm, thời gian sấy khô và thể tích tiêu hóa luôn ổn định.
• Theo dõi năng suất peptide và việc xác định các protein tổng số.
• Kiểm tra tỷ lệ phân cắt không thành công và phân bố độ dài peptit.
• Kiểm tra hình dạng đỉnh sắc ký và độ lặp lại của thời gian lưu.
• Hãy chừa các ô trống để theo dõi lượng dư.
• Sử dụng các mẫu kiểm soát chất lượng (QC) tổng hợp cho các nghiên cứu quy mô lớn hơn.
• Đánh giá hệ số biến thiên của các mẫu lặp lại.
• Sử dụng phương pháp PCA hoặc các phương pháp liên quan để xác định các hiệu ứng theo lô hoặc các mẫu ngoại lệ.

Các khuyến nghị về việc lập biên bản

Khi công bố hoặc lập tài liệu về quy trình làm việc này, cần ghi rõ lượng EV đầu vào, định dạng đĩa, thể tích methanol, biên độ và thời gian siêu âm của UIP400MTP, điều kiện ly tâm, phương pháp sấy khô, dung dịch đệm tiêu hóa, nồng độ enzyme, thời gian tiêu hóa, điều kiện axit hóa, nền tảng LC-MS/MS, chế độ thu thập dữ liệu, phiên bản phần mềm, cơ sở dữ liệu, ngưỡng FDR, phương pháp chuẩn hóa và quy trình thống kê.
Tất cả các thiết bị siêu âm cho đĩa vi giếng của Hielscher đều tự động ghi lại các thông số quy trình quan trọng như biên độ, thời gian siêu âm và nhiệt độ, kèm theo dấu thời gian và ngày tháng, dưới dạng tệp CSV trên thẻ SD tích hợp. Việc ghi chép dữ liệu nhằm đảm bảo tính lặp lại và kiểm soát chất lượng chưa bao giờ dễ dàng đến thế!

Nghiên cứu chi tiết: Phân tích proteomics bằng phương pháp EV Shotgun trong nghiên cứu về gen PLA2G12A

Nghiên cứu về PLA2G12A cung cấp một ví dụ cụ thể về việc sử dụng UIP400MTP trong quy trình phân tích proteomics kiểu shotgun. Câu hỏi sinh học đặt ra là làm thế nào enzym phospholipase tiết ra PLA2G12A biến đổi các túi ngoại bào có nguồn gốc từ tế bào Th17 và từ đó tác động đến quá trình biệt hóa của tế bào T gây bệnh. Các tác giả đã chỉ ra rằng PLA2G12A tác động lên màng của các túi ngoại bào (EV) để tạo ra các lysophospholipid, bao gồm 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, và rằng tín hiệu lysophosphatidic acid (LPA) thông qua LPA2 góp phần vào quá trình biệt hóa của tế bào Th17. Ngoài tín hiệu lipid, các nghiên cứu còn phân tích thành phần của các túi ngoại bào (EV), bao gồm RNA và protein, khiến phương pháp proteomics shotgun trở thành một thành phần quan trọng trong chiến lược đặc trưng hóa.
Trong quy trình chuẩn bị EV, các tế bào Th17 được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy chứa huyết thanh bò thai đã được loại bỏ exosome. Dịch nuôi cấy ban đầu được ly tâm để loại bỏ tế bào, lọc qua màng lọc 0,22 µm, cô đặc bằng phương pháp siêu lọc/siêu ly tâm, rửa sạch, tái huyền phù trong PBS và định lượng bằng phương pháp định lượng protein BCA. Quá trình chuẩn bị EV ở giai đoạn đầu này đảm bảo rằng một lượng vật liệu EV tương đương với lượng protein đã định trước có thể được đưa vào quy trình phân tích proteomics.
Đối với phân tích proteomics kiểu shotgun, các tác giả đã sử dụng các mẫu EV tương đương với 5 µg protein. Các mẫu này được làm khô trong ống PCR, sau đó thêm 25 µL methanol. Tiếp theo, các mẫu được xử lý bằng sóng siêu âm trong 3 phút bằng máy siêu âm microplate UIP400MTP. Sau khi siêu âm, các mẫu được ly tâm ở 4°C trong 20 phút với tốc độ 19.000 × g. Sau khi loại bỏ 20 µL phần nổi, các mẫu được ly tâm cho đến khi khô hoàn toàn. Sau đó, protein được hòa tan bằng cách siêu âm trong 4 µL dung dịch trypsin/Lys-C nồng độ 100 ng/µL trong dung dịch ammonium bicarbonate 50 mM. Quá trình tiêu hóa được thực hiện trong 2 giờ ở 37°C với tốc độ lắc 300 vòng/phút. Chất tiêu hóa được axit hóa bằng 1 µL axit trifluoroacetic 1,25% và được đưa vào phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng nano-flow kết hợp với phổ khối lượng song song độ phân giải cao.
Quy trình này nêu bật một số nguyên tắc hữu ích cho phân tích proteomics EV với lượng mẫu đầu vào thấp. Thứ nhất, lượng mẫu đầu vào được chuẩn hóa theo đơn vị tương đương protein, điều này rất quan trọng khi so sánh các EV từ các kiểu gen hoặc phương pháp xử lý khác nhau. Thứ hai, methanol được sử dụng trước khi siêu âm, hỗ trợ quá trình phá vỡ và chiết xuất đồng thời tránh sử dụng các hệ thống chất tẩy rửa có thể gây phức tạp cho quá trình LC-MS/MS. Thứ ba, bước siêu âm được thực hiện trong thời gian ngắn và được tiêu chuẩn hóa, phù hợp với quy trình xử lý mẫu song song. Thứ tư, quá trình tiêu hóa bằng trypsin/Lys-C được thực hiện trong thể tích rất nhỏ, giúp giảm độ pha loãng và hỗ trợ thu hồi peptide từ mẫu đầu vào ít. Cuối cùng, việc chuyển trực tiếp từ bước tiêu hóa sang bước axit hóa và LC-MS/MS đã giảm thiểu các bước xử lý không cần thiết.
Phương pháp LC-MS/MS ở giai đoạn sau sử dụng kỹ thuật tách pha ngược dòng nano-flow kết hợp với máy quang phổ khối Q-Exactive HF Orbitrap. Các mẫu được giữ lại trên cột tiền xử lý C18, sau đó được phân tách trên cột phân tích có đường kính trong 50 µm với tốc độ dòng 200 nL/phút và nhiệt độ 40°C. Độ dốc chạy từ dung môi hữu cơ thấp đến 35% dung môi B trong 60 phút, tiếp theo là rửa bằng dung môi hữu cơ cao và tái cân bằng. Việc thu thập MS được thực hiện ở chế độ ion dương bằng cách sử dụng thu thập dữ liệu độc lập với sự phân ly va chạm năng lượng cao hơn. Các tệp thô DIA được phân tích bằng phần mềm DIA-NN 1.8 với thư viện phổ dự đoán in silico.