Quy trình nghiên cứu hệ protein với phân giải protein thông lượng cao

Hệ protein học là lĩnh vực thiết yếu để tìm hiểu các quá trình và hệ thống sinh học, trong đó phân giải protein là một bước then chốt trong các quy trình nghiên cứu. Theo phương pháp truyền thống, protein được phân giải trong dung dịch bằng các enzyme phân giải protein như trypsin, enzyme thủy phân đặc hiệu các liên kết peptide tại các gốc lysine và arginine. Quá trình này tạo ra các peptide rất phù hợp cho quá trình ion hóa và phân mảnh trong các ứng dụng khối phổ (MS). Tuy nhiên, các phương pháp phân giải thông thường cần 12–24 giờ để hoàn tất, tạo ra những điểm nghẽn đáng kể trong quy trình nghiên cứu hệ protein.
Xử lý siêu âm mang đến một giải pháp thay thế mạnh mẽ, rút ngắn đáng kể thời gian phân giải từ hàng giờ xuống chỉ còn vài phút. Khi kết hợp với các thiết bị siêu âm đa mẫu tiên tiến như Hielscher CupHorn, VialTweeter và thiết bị siêu âm đĩa 96 giếng UIP400MTP, xử lý siêu âm cho phép nghiên cứu hệ protein nhanh hơn với thông lượng cao. Những công nghệ này giúp tinh gọn quy trình, giảm thời gian chuẩn bị mẫu và tăng hiệu quả mà không ảnh hưởng đến khả năng tái lập hay chất lượng dữ liệu.

Vai trò của năng lượng siêu âm trong phân giải protein

Xử lý siêu âm sử dụng sóng siêu âm hội tụ để tạo ra hiện tượng xâm thực – các vi bọt hình thành cục bộ rồi sụp đổ, sinh ra lực cắt mạnh. Hiện tượng này tăng cường truyền khối, thúc đẩy sự trộn lẫn enzyme với cơ chất và làm duỗi cấu trúc protein, để lộ các vị trí cắt cho các enzyme phân giải protein như trypsin tiếp cận.
Kết quả là gì? Thời gian phân giải giảm đáng kể mà không ảnh hưởng đến hiệu quả hay khả năng tái lập.

Phân giải protein được tăng cường bằng siêu âm: Phương pháp và kết quả

Quy trình phân giải tăng tốc

Phân giải có hỗ trợ siêu âm kết hợp các enzyme phân giải protein với năng lượng siêu âm để đẩy nhanh quy trình. Ví dụ, khi sử dụng Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), quy trình phân giải diễn ra như sau:

1. Khử: Các mẫu protein (0,5 mg/mL, 20 µL) được xử lý bằng DTT (2 µL, 110 mM) trong dung dịch đệm amoni bicarbonat (12,5 mM). Mẫu được xử lý siêu âm ở biên độ 50% trong 5 phút.
2. Alkyl hóa: Sau khi thêm IAA (2 µL, 400 mM), quá trình xử lý siêu âm được lặp lại trong cùng điều kiện.
3. Phân giải: Các mẫu được pha loãng và ủ với các hạt nano mang trypsin cố định. Một đợt xử lý siêu âm cuối cùng (5 phút) hoàn tất quá trình phân giải. Các peptide được tách, làm khô và bảo quản để phân tích MS.

Phương pháp siêu âm này giảm tổng thời gian chuẩn bị từ 12 giờ xuống dưới 30 phút. Mặc dù quá trình được đẩy nhanh, lượng peptide thu được và chất lượng peptide vẫn tương đương với các phương pháp truyền thống thực hiện qua đêm.

Hiệu quả phân giải protein bằng siêu âm

Trong các nghiên cứu so sánh sử dụng hệ protein của E. coli:

• Định danh protein: Các mẫu được phân giải bằng siêu âm cho phép định danh 777 protein trong 5 phút, so với 817 protein trong 12 giờ. Tỷ lệ protein được định danh chung giữa hai phương pháp vượt quá 70%.
• Khả năng tái lập: Các phép phân tích lặp lại cho thấy giá trị tương quan trên 98% trong từng phương pháp, chứng minh độ tin cậy.
• Tính chọn lọc: Mỗi phương pháp ưu tiên phân giải một số protein nhất định, trong đó phân giải bằng siêu âm ưu tiên 65 protein và phân giải qua đêm ưu tiên 54 protein. Những khác biệt tinh tế này nhấn mạnh tiềm năng riêng biệt của xử lý siêu âm đối với các ứng dụng cụ thể.

Kết quả định lượng protein không đánh dấu của bảy protein được bổ sung vào một mẫu
E. coli. Các protein sau đây được bổ sung ở hai mức khác nhau như được ghi trong cột
có tên “Theo Ratio”. Theo Ratio là tỷ số lý thuyết giữa hai mức được sử dụng trong thí nghiệm
này. Albumin huyết thanh bò (ALBU), β-lactoglobulin (LACB), casein α-S1 (CASA1),
casein α-S2 (CASA2), cytochrome c (CYC), ovalbumin (OVAL) và carbonic anhydrase 2
(CAH2). Các tỷ số được tính bằng cường độ tín hiệu protein LFQ thu được từ
phân tích bằng MaxQuant. Phép kiểm định t Student được áp dụng để so sánh các giá trị thu được bằng từng phương pháp (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Nghiên cứu và đồ họa: © Martins và cộng sự, 2019)

Trypsin cố định trên hạt nano

Việc kết hợp các hạt nano mang trypsin cố định (ví dụ: T-FMNPs) với xử lý siêu âm giúp cải thiện hơn nữa các quy trình nghiên cứu hệ protein. Các hạt nano này cung cấp diện tích bề mặt lớn cho tương tác giữa enzyme và cơ chất, giúp tăng hiệu quả. Khi áp dụng cho các hệ protein phức tạp, chẳng hạn như hệ protein của E. coli, phương pháp kết hợp này đạt được:

• Tốc độ: Phân giải hoàn toàn trong vòng 5 phút.
• Độ chính xác: Kết quả định lượng protein tương đương với các phương pháp truyền thống (p > 0,01, n=3).
• Khả năng mở rộng quy mô: Việc điều chỉnh để phù hợp với các nền tảng đa giếng như UIP400MTP cho phép xử lý với thông lượng cao.

Nhấp vào đây để xem quy trình chi tiết với hướng dẫn từng bước!
(xem thêm Martins và cộng sự, 2019)

Phân giải protein ở tốc độ cao và thông lượng cao bằng máy siêu âm Hielscher

Các mẫu máy siêu âm tốt nhất cho nghiên cứu hệ protein

Hielscher Ultrasonics cung cấp nhiều mẫu máy siêu âm để chuẩn bị đồng thời nhiều mẫu, tạo thuận lợi cho các quy trình có thông lượng cao. Dù bạn làm việc với lọ, ống nghiệm, đĩa đa giếng (ví dụ: đĩa 6, 24, 96 giếng) hay đĩa Petri – chúng tôi đều cung cấp các máy siêu âm lý tưởng cho thí nghiệm của bạn.

Máy siêu âm đĩa đa giếng UIP400MTP

Để đạt thông lượng tối đa, UIP400MTP cung cấp khả năng xử lý đĩa 96 giếng bằng siêu âm. Tương thích với mọi đĩa vi chuẩn, UIP400MTP không đòi hỏi vật tư tiêu hao độc quyền đắt tiền và cho phép bạn tự do lựa chọn đĩa đa giếng tốt nhất cho nghiên cứu của mình. Bằng cách phân phối năng lượng đồng đều trên toàn bộ đĩa, thiết bị cho phép thực hiện nhanh các bước khử, alkyl hóa và phân giải tới 200 hệ protein phức tạp chỉ trong 1 giờ. Mức độ tự động hóa và hiệu quả này có vai trò thiết yếu đối với nghiên cứu hệ protein có thông lượng cao và các ứng dụng lâm sàng. Tìm hiểu thêm về máy siêu âm đĩa đa giếng!

VialTweeter

VialTweeter được thiết kế phù hợp với các phòng thí nghiệm cần xử lý siêu âm đồng thời tới 10 lọ hoặc ống nghiệm. Phương pháp không xâm lấn của thiết bị loại bỏ nguy cơ nhiễm chéo, đồng thời bảo đảm khả năng tái lập của quá trình phân giải protein. Thiết bị này lý tưởng cho các nhà nghiên cứu làm việc với thể tích mẫu hạn chế hoặc nhiều loại mẫu khác nhau.
Tìm hiểu thêm về máy siêu âm đa ống VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Máy siêu âm CupHorn là thiết bị mạnh mẽ được thiết kế để xử lý đồng thời nhiều mẫu trong các vật chứa kín. Thiết bị bảo đảm phân phối năng lượng siêu âm đồng đều và kiểm soát nhiệt độ chính xác. Khả năng xử lý đồng thời tới năm mẫu, cùng với khả năng tương thích với các quy trình khử, alkyl hóa và phân giải, khiến CupHorn trở thành công cụ đáng tin cậy cho nghiên cứu hệ protein dựa trên MS.
Tìm hiểu thêm về CupHorn SonoReactor!

Quy trình từng bước phân giải protein có hỗ trợ siêu âm sử dụng trypsin cố định trên hạt nano

Quy trình này của Martins và cộng sự (2019) được tối ưu hóa để phân giải protein nhanh bằng năng lượng siêu âm và trypsin cố định trên hạt nano (T-FMNPs). Các bước được trình bày bảo đảm quá trình khử, alkyl hóa và phân giải protein diễn ra hiệu quả, phù hợp với các ứng dụng khối phổ (MS).
Các bước của quy trình

1. Khử liên kết disulfide
   • Thêm 2 µL dung dịch DTT (110 mM) vào mẫu protein 20 µL (0,5 mg/mL) trong đệm AmBic.
   • Đặt ống mẫu vào thiết bị phản ứng siêu âm UP200St-CupHorn.
   • Xử lý siêu âm mẫu trong 2,5 phút ở biên độ 50% (200 W, 26 kHz).
   • Tạm dừng trong thời gian ngắn để mẫu nguội, sau đó tiếp tục xử lý siêu âm thêm 2,5 phút trong cùng điều kiện.
2. Alkyl hóa các gốc cysteine đã được khử
   • Thêm 2 µL dung dịch IAA (400 mM) vào mẫu protein đã được khử.
   • Xử lý siêu âm trong 2,5 phút ở biên độ 50% để thúc đẩy quá trình alkyl hóa.
   • Tạm dừng để mẫu nguội, sau đó tiếp tục xử lý siêu âm thêm 2,5 phút.

   Lưu ý: Hạn chế tối đa việc để mẫu đã alkyl hóa tiếp xúc với ánh sáng nhằm ngăn IAA phân hủy.

3. Pha loãng mẫu
   • Pha loãng mẫu protein đã alkyl hóa đến thể tích cuối cùng là 100 µL bằng đệm AmBic 25 mM chứa 4% acetonitrile (v/v).
   • Trộn đều bằng cách hút nhả nhẹ nhàng bằng pipet.
4. Phân giải protein bằng trypsin cố định trên hạt nano
   • Thêm 20 µL dung dịch T-FMNP (3 mg/mL) vào mẫu protein đã pha loãng.
   • Xử lý hỗn hợp bằng siêu âm trong thiết bị phản ứng siêu âm trong 2,5 phút ở biên độ 50%.
   • Tạm dừng để làm mát, sau đó tiếp tục xử lý bằng siêu âm trong 2,5 phút nữa ở cùng điều kiện.
5. Tách các hạt nano trypsin
   • Dùng nam châm để tách T-FMNPs khỏi dịch nổi chứa các peptide thu được sau tiêu giải.
   • Chuyển dịch nổi sang một ống ly tâm vi lượng mới.
6. Chuẩn bị peptide để phân tích MS
   • Làm khô dịch nổi chứa peptide trong máy ly tâm chân không.
   • Bảo quản peptide đã làm khô ở -20°C cho đến khi phân tích tiếp bằng phương pháp khối phổ.