Quy trình làm việc proteomic với phân hủy protein thông lượng cao

Proteomics là một lĩnh vực thiết yếu để hiểu các quá trình và hệ thống sinh học, với quá trình tiêu hóa protein tạo thành một bước quan trọng trong quy trình làm việc của nó. Theo truyền thống, quá trình tiêu hóa protein được thực hiện trong dung dịch bằng cách sử dụng các enzym phân giải protein như trypsin, đặc biệt thủy phân liên kết peptide ở dư lượng lysine và arginine. Quá trình này tạo ra các peptide rất phù hợp cho quá trình ion hóa và phân mảnh trong các ứng dụng khối phổ (MS). Tuy nhiên, các phương pháp phân hủy thông thường cần 12–24 giờ để hoàn thành, tạo ra nút thắt cổ chai đáng kể trong quy trình làm việc của proteomic.
Siêu âm cung cấp một giải pháp thay thế mạnh mẽ, rút ngắn đáng kể thời gian tiêu hóa từ vài giờ xuống chỉ còn vài phút. Khi kết hợp với các máy siêu âm đa mẫu tiên tiến như Hielscher CupHorn, VialTweeter và UIP400MTP siêu âm tấm 96 giếng, siêu âm cho phép tăng tốc, protein thông lượng cao. Các công nghệ này hợp lý hóa quy trình làm việc, giảm thời gian chuẩn bị mẫu và tăng hiệu quả mà không ảnh hưởng đến khả năng tái tạo hoặc chất lượng dữ liệu.

Vai trò của năng lượng siêu âm trong quá trình tiêu hóa protein

Siêu âm sử dụng sóng siêu âm hội tụ để tạo ra sự xâm thực - các bong bóng vi mô cục bộ sụp đổ để tạo ra lực cắt mạnh. Hiện tượng này tăng cường truyền khối lượng, thúc đẩy sự pha trộn của các enzym với chất nền và mở ra cấu trúc protein, để các vị trí phân tách tiếp xúc với các enzym phân giải protein như trypsin.
Kết quả? Giảm đáng kể thời gian tiêu hóa mà không ảnh hưởng đến hiệu quả hoặc khả năng tái tạo.

Tiêu hóa phân giải protein tăng cường siêu âm: Phương pháp luận và kết quả

Giao thức tiêu hóa tăng tốc

Tiêu hóa hỗ trợ siêu âm kết hợp các enzym phân giải protein và năng lượng siêu âm để đẩy nhanh quy trình làm việc. Ví dụ: sử dụng Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), quy trình phân hủy diễn ra như sau:

1. Giảm: Các mẫu protein (0,5 mg / mL, 20 μL) được xử lý bằng DTT (2 μL, 110 mM) trong dung dịch đệm amoni bicarbonate (12,5 mM). Sonication được áp dụng ở biên độ 50% trong 5 phút.
2. Alkyl hóa: Sau khi thêm IAA (2 μL, 400 mM), quá trình siêu âm được lặp lại trong các điều kiện tương tự.
3. Tiêu hóa: Các mẫu được pha loãng và ủ với các hạt nano trypsin cố định. Một vòng siêu âm cuối cùng (5 phút) hoàn thành quá trình tiêu hóa. Peptide được tách ra, sấy khô và lưu trữ để phân tích MS.

Phương pháp siêu âm này giúp giảm tổng thời gian chuẩn bị từ 12 giờ xuống dưới 30 phút. Mặc dù quá trình được đẩy nhanh, năng suất và chất lượng peptide vẫn phù hợp với các phương pháp qua đêm truyền thống.

Hiệu quả của quá trình tiêu hóa protein siêu âm

Trong các nghiên cứu so sánh sử dụng proteome E. coli:

• Nhận dạng protein: Các mẫu được tiêu hóa bằng sóng siêu âm đã xác định được 777 protein trong 5 phút, so với 817 trong 12 giờ. Nhận dạng protein được chia sẻ vượt quá 70%.
• Khả năng tái tạo: Các phân tích lặp lại cho thấy các giá trị tương quan trên 98% trong mỗi phương pháp, chứng minh độ tin cậy.
• Tính chọn lọc: Một số protein được ưu tiên tiêu hóa bằng mỗi phương pháp, với tiêu hóa siêu âm ủng hộ 65 protein và tiêu hóa qua đêm 54 protein. Những khác biệt sắc thái như vậy nhấn mạnh tiềm năng độc đáo của siêu âm cho các ứng dụng cụ thể.

Kết quả định lượng protein không nhãn của bảy protein gai vào E. coli
mẫu. Các protein sau đây được thêm vào ở hai mức độ khác nhau như đã lưu ý trong cột
được đặt tên là "Theo Ratio". Theo Ratio là tỷ lệ lý thuyết giữa hai cấp độ được sử dụng trong điều này
thí nghiệm. Albumin huyết thanh bò (ALBU), β-lactoglobulin (LACB), α-S1 casein (CASA1),
α-S2 casein (CASA2), cytochrome c (CYC), ovalbumin (OVAL) và carbonic anhydrase 2
(CAH2). Các tỷ lệ được tính toán bằng cách sử dụng cường độ protein LFQ thu được từ MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Nghiên cứu và đồ họa: © Martins và cộng sự, 2019)

Trypsin cố định hạt nano

Việc tích hợp các hạt nano trypsin cố định (ví dụ: T-FMNP) với siêu âm giúp tăng cường hơn nữa quy trình làm việc của proteomics. Các hạt nano này cung cấp diện tích bề mặt cao cho tương tác enzyme-chất nền, tăng hiệu quả. Khi áp dụng cho các proteome phức tạp, chẳng hạn như E. coli, phương pháp kết hợp đạt được:

• Tốc độ: Tiêu hóa hoàn toàn trong vòng 5 phút.
• Chính xác: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Khả năng mở rộng: Thích ứng với các nền tảng đa giếng như UIP400MTP cho phép xử lý thông lượng cao.

Nhấp vào đây để xem giao thức chi tiết với hướng dẫn từng bước!
(xem Martins và cộng sự, 2019)

Phân hủy protein ở tốc độ cao và thông lượng cao với máy siêu âm Hielscher

Các mô hình Sonicator tốt nhất cho Proteomics

Hielscher Ultrasonics cung cấp các mẫu máy siêu âm khác nhau để chuẩn bị đồng thời nhiều mẫu tạo điều kiện cho quy trình làm việc thông lượng cao. Cho dù bạn làm việc với lọ, ống nghiệm, đĩa nhiều giếng (ví dụ: đĩa 6, 24, 96 giếng) hay đĩa Petri – Chúng tôi cung cấp cho bạn các máy siêu âm lý tưởng cho các thí nghiệm của bạn.

Máy siêu âm tấm đa giếng UIP400MTP

Để có thông lượng tối ưu, UIP400MTP cung cấp khả năng xử lý các tấm 96 giếng bằng sóng siêu âm. Tương thích với bất kỳ tấm vi mô tiêu chuẩn nào, UIP400MTP không yêu cầu vật dụng dùng một lần độc quyền đắt tiền và cho phép bạn tự do lựa chọn tấm đa giếng tốt nhất cho nghiên cứu của mình. Bằng cách cung cấp năng lượng đồng đều trên đĩa, nó cho phép giảm nhanh, alkyl hóa và tiêu hóa lên đến 200 proteome phức tạp chỉ trong 1 giờ. Mức độ tự động hóa và hiệu quả này rất quan trọng đối với các ứng dụng lâm sàng và protein thông lượng cao. Tìm hiểu thêm về máy siêu âm tấm đa giếng!

LọTweeter

VialTweeter được thiết kế riêng cho các phòng thí nghiệm yêu cầu siêu âm đồng thời lên đến 10 lọ hoặc ống nghiệm. Cách tiếp cận không xâm lấn của nó loại bỏ nguy cơ lây nhiễm chéo trong khi vẫn đảm bảo tiêu hóa protein có thể tái tạo. Thiết bị này lý tưởng cho các nhà nghiên cứu làm việc với khối lượng mẫu hạn chế hoặc các loại mẫu đa dạng.
Tìm hiểu thêm về máy siêu âm đa ống VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Máy siêu âm CupHorn là một thiết bị mạnh mẽ được thiết kế để xử lý đồng thời nhiều mẫu trong các thùng kín. Nó đảm bảo phân phối năng lượng siêu âm đồng đều và kiểm soát nhiệt độ chính xác. Khả năng xử lý tối đa năm mẫu cùng một lúc, cùng với khả năng tương thích của nó với quy trình làm việc giảm, alky hóa và tiêu hóa, làm cho CupHorn trở thành một công cụ đáng tin cậy cho protein dựa trên MS.
Tìm hiểu thêm về CupHorn SonoReactor!

Giao thức từng bước để tiêu hóa phân giải protein hỗ trợ siêu âm bằng cách sử dụng trypsin cố định nano

Giao thức này của Martins et al. (2019) được tối ưu hóa để tiêu hóa protein nhanh chóng bằng cách sử dụng năng lượng siêu âm và trypsin cố định hạt nano (T-FMNPs). Các bước được vạch ra đảm bảo khử hiệu quả, alkyl hóa và phân giải protein phù hợp với các ứng dụng khối phổ (MS).
Các bước giao thức

1. Giảm liên kết disulfide
   • Thêm 2 μL dung dịch DTT (110 mM) vào mẫu protein 20 μL (0,5 mg / mL) trong dung dịch đệm AmBic.
   • Đặt ống mẫu vào lò phản ứng âm thanh UP200St-CupHorn.
   • Siêu âm mẫu trong 2,5 phút ở biên độ 50% (200 W, 26 kHz).
   • Tạm dừng trong một khoảng thời gian ngắn để làm mát, sau đó siêu âm thêm 2.5 phút trong điều kiện tương tự.
2. Alkyl hóa dư lượng cystein giảm
   • Thêm 2 μL dung dịch IAA (400 mM) vào mẫu protein giảm.
   • Siêu âm trong 2,5 phút ở biên độ 50% để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình alkyl hóa.
   • Tạm dừng để làm mát, sau đó siêu âm thêm 2,5 phút.

   Lưu ý: Giảm thiểu sự tiếp xúc của alkyl hóa sample với ánh sáng để ngăn ngừa sự suy thoái của IAA.

3. Pha loãng mẫu
   • Pha loãng mẫu protein alkyl hóa đến thể tích cuối cùng là 100 μL bằng cách sử dụng dung dịch đệm AmBic 25 mM có chứa 4% acetonitrile (v / v).
   • Trộn kỹ bằng cách pipet nhẹ nhàng.
4. Tiêu hóa phân giải protein với Trypsin cố định bằng hạt nano
   • Thêm 20 μL dung dịch T-FMNP (3 mg / mL) vào mẫu protein pha loãng.
   • Siêu âm hỗn hợp trong sonoreactor trong 2,5 phút ở biên độ 50%.
   • Tạm dừng để làm mát, sau đó siêu âm thêm 2.5 phút trong điều kiện tương tự.
5. Tách các hạt nano trypsin
   • Sử dụng nam châm để tách T-FMNP khỏi phần nổi có chứa peptide đã tiêu hóa.
   • Chuyển phần nổi lên vào một ống ly tâm siêu nhỏ mới.
6. Chuẩn bị peptide để phân tích MS
   • Làm khô phần nổi có chứa peptide trong máy ly tâm chân không.
   • Bảo quản các peptide khô ở -20 ° C cho đến khi phân tích thêm bằng khối phổ.