Cắt nhỏ chromatin bằng phương pháp siêu âm
Quá trình cắt nhỏ chromatin là một bước quan trọng trong nhiều quy trình nghiên cứu về di truyền học biểu sinh và sinh học phân tử, đặc biệt là trong các phương pháp như miễn dịch kết tủa chromatin (ChIP), ChIP-seq và các xét nghiệm liên quan. Mục tiêu là phân mảnh chromatin thành các phức hợp DNA-protein có tính tái hiện cao, đồng thời bảo toàn tính toàn vẹn của epitope và giảm thiểu tối đa sự mất mát mẫu. Trong số các phương pháp hiện có, phương pháp phân mảnh chromatin bằng sóng siêu âm đã trở thành một phương pháp được sử dụng rộng rãi vì nó mang lại kết quả phân mảnh đáng tin cậy, không cần sử dụng hóa chất và có độ tái hiện xuất sắc.
Tôi cần lưu ý những gì khi cắt nhỏ chromatin?
Để quá trình cắt nhỏ chromatin diễn ra hiệu quả, cần phải kiểm soát chặt chẽ các thông số thí nghiệm. Việc cắt nhỏ không đúng cách có thể ảnh hưởng tiêu cực đến các thí nghiệm ChIP tiếp theo do tạo ra các mảnh quá lớn, bị phân hủy quá mức hoặc không đồng nhất giữa các mẫu.
Một trong những yếu tố quan trọng nhất là phân bố kích thước mảnh mong muốn. Đối với hầu hết các ứng dụng ChIP và ChIP-seq, các mảnh chromatin có kích thước từ 100 đến 600 cặp base là tối ưu. Khoảng kích thước này cho phép thực hiện quá trình miễn dịch kết tủa một cách hiệu quả đồng thời cung cấp độ phân giải đủ cao để lập bản đồ gen.
Một yếu tố quan trọng khác là hiệu suất liên kết chéo trước khi xử lý bằng sóng siêu âm. Hầu hết các quy trình ChIP đều bao gồm bước cố định bằng formaldehyde để ổn định các tương tác giữa protein và DNA. Tuy nhiên, việc liên kết chéo quá mức có thể làm cho chromatin trở nên khó phân mảnh hơn, dẫn đến thời gian xử lý bằng sóng siêu âm phải kéo dài hơn và có thể làm tăng mức độ tiếp xúc với nhiệt.
Việc kiểm soát nhiệt độ cũng rất quan trọng. Quá trình siêu âm tạo ra năng lượng cục bộ có thể làm tăng nhiệt độ mẫu. Nhiệt độ cao có thể làm hỏng DNA hoặc biến tính protein, từ đó ảnh hưởng đến khả năng nhận diện của kháng thể trong quá trình ChIP. Do đó, nhiều nhà nghiên cứu thực hiện các chu kỳ siêu âm dạng xung kết hợp với các khoảng thời gian làm mát để duy trì sự ổn định của mẫu.
Nồng độ và thể tích mẫu cũng ảnh hưởng đến hiệu suất phân mảnh. Các dung dịch chromatin có nồng độ cao có thể cần thời gian siêu âm lâu hơn, trong khi các mẫu có thể tích nhỏ đòi hỏi phải cung cấp năng lượng chính xác để tránh xử lý quá mức.
Cuối cùng, việc lựa chọn thiết bị siêu âm có ảnh hưởng lớn đến tính lặp lại của thí nghiệm. Các thiết bị được thiết kế để cắt nhỏ chromatin thường cung cấp năng lượng siêu âm được kiểm soát và quy trình xử lý mẫu tiêu chuẩn hóa, giúp đảm bảo quá trình phân mảnh diễn ra đồng nhất trên nhiều mẫu.
Cắt DNA siêu âm trong ChIP – kết tủa miễn dịch chromatin
Tôi nên chọn máy siêu âm nào để cắt nhỏ chromatin?
Các quy trình làm việc khác nhau trong phòng thí nghiệm đòi hỏi các cấu hình siêu âm khác nhau. Hệ thống tối ưu phụ thuộc phần lớn vào công suất xử lý mẫu, thể tích và hình thức thí nghiệm.
Máy tạo sóng siêu âm kiểu đầu dò
Máy siêu âm dạng đầu dò truyền năng lượng siêu âm trực tiếp vào mẫu thông qua một đầu dò bằng titan. Cấu hình này mang lại mật độ năng lượng rất cao và do đó phù hợp để phá vỡ cấu trúc chromatin một cách hiệu quả trong từng mẫu riêng lẻ.
Máy siêu âm Probe đặc biệt hữu ích trong các trường hợp sau:
- Số lượng mẫu nhỏ đến trung bình
- Chromatin khó phân mảnh
- Các quy trình thí nghiệm linh hoạt
Máy siêu âm đa ống – VialTweeter
Đối với các phòng thí nghiệm xử lý nhiều mẫu cùng lúc, máy siêu âm đa ống VialTweeter mang đến một giải pháp có độ lặp lại cao. Hệ thống truyền năng lượng siêu âm gián tiếp qua giá đỡ ống, cho phép phân hủy nhiều ống kín trong cùng một điều kiện.
Cấu hình này mang lại những lợi ích quan trọng:
- Cắt nhỏ chromatin song song trên nhiều mẫu
- Loại bỏ sự nhiễm bẩn của đầu dò
- Độ lặp lại cao giữa các ống
- Quy trình đơn giản hóa để chuẩn bị mẫu ChIP
Các hệ thống nhiều ống như vậy rất phù hợp cho các thí nghiệm ChIP thông thường và các nghiên cứu có quy mô trung bình.
Máy siêu âm cho đĩa vi giếng – UIP400MTP
Các nghiên cứu về biểu sinh với năng suất cao ngày càng phụ thuộc vào quy trình xử lý mẫu dựa trên đĩa vi giếng. Máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP được thiết kế để phân mảnh chromatin trực tiếp trong các đĩa vi giếng tiêu chuẩn mà không cần chuyển mẫu.
Cách tiếp cận này cho phép:
- Xử lý đồng thời hàng chục hoặc hàng trăm mẫu
- Các quy trình làm việc hỗ trợ tự động hóa
- Phân bố năng lượng siêu âm đồng đều trong các giếng
- Giảm đáng kể số bước xử lý mẫu
Đối với các dự án sàng lọc ChIP-seq quy mô lớn hoặc các nghiên cứu biểu sinh với năng suất cao, phương pháp siêu âm trên đĩa vi giếng mang lại khả năng mở rộng và hiệu quả vượt trội. Máy siêu âm đĩa đa giếng UIP400MTP rất phù hợp cho tích hợp vào các hệ thống xử lý chất lỏng và quy trình làm việc tự động trong phòng thí nghiệm.
Tại sao nên chọn phương pháp siêu âm thay vì các kỹ thuật cắt nhỏ chromatin khác?
So với các phương pháp sử dụng enzym, việc sử dụng sóng siêu âm trong kỹ thuật ChIP mang lại quá trình phân mảnh khách quan, vì quy trình này không phụ thuộc vào hoạt tính enzym đặc hiệu trình tự. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các nghiên cứu biểu sinh trên toàn bộ bộ gen, nơi độ bao phủ đồng đều là yếu tố thiết yếu.
Một ưu điểm lớn khác là khả năng mở rộng. Các hệ thống siêu âm có thể xử lý mẫu đơn lẻ, nhiều ống nghiệm hoặc cả tấm vi giếng, giúp các phòng thí nghiệm lựa chọn cấu hình phù hợp nhất với năng suất thí nghiệm của mình.
Cuối cùng, phương pháp siêu âm cho phép kiểm soát rất tốt các thông số liên quan đến quá trình phân mảnh. Bằng cách điều chỉnh chu kỳ xung, thời gian và mức công suất, các nhà nghiên cứu có thể đạt được phân bố kích thước mảnh mong muốn một cách đáng tin cậy.
Phân mảnh chromatin thông qua quá trình siêu âm được tối ưu hóa trên các mẫu ChIP.
(a) không có hiện tượng cắt đứt (các mảnh dài trong gel);
(b) cấu trúc phân mảnh tối ưu (tăng cường các đoạn có độ dài 200–600 bp);
(c) sự phân mảnh DNA quá mức (tỷ lệ các đoạn ngắn hơn 200 bp chiếm tỷ lệ cao bất thường)
© Jarillo và cộng sự, 2018
So sánh các kỹ thuật cắt nhỏ chromatin
| Phương pháp cắt nhỏ chromatin | Nguyên tắc | Lợi thế | Hạn chế |
| Sonication | Năng lượng âm thanh tần số cao làm vỡ cấu trúc chromatin theo cơ chế cơ học. | Phân mảnh không cần chất phản ứng, kết quả có độ lặp lại cao, phân bố kích thước mảnh có thể điều chỉnh, tương thích với chromatin liên kết chéo, có thể mở rộng quy mô từ ống đơn lẻ đến định dạng nhiều mẫu và định dạng microplate. | Yêu cầu thiết bị siêu âm và việc tối ưu hóa các thông số siêu âm. |
| Phân giải bằng enzym (MNase) | Enzyme nuclease của vi khuẩn Micrococcus phân cắt DNA ở giữa các nucleosome. | Phân mảnh nhẹ nhàng và hữu ích cho việc phân tích chromatin tự nhiên. | Sự thiên lệch của enzyme, sự ưu tiên về trình tự, quá trình phân giải khó kiểm soát, khả năng có sự biến động giữa các thí nghiệm. |
| Cắt cơ học (kim tiêm / ống tiêm) | Chromatin bị phá vỡ do tác động lặp đi lặp lại của lực vật lý. | Phương pháp đơn giản, chỉ cần tối thiểu thiết bị. | Khả năng tái hiện kém, khó kiểm soát kích thước mảnh, tốn nhiều công sức khi xử lý nhiều mẫu. |
| Phun sương | Khí nén đẩy DNA qua các lỗ nhỏ, gây ra sự phân mảnh. | Quá trình phân mảnh nhanh chóng. | Có thể bị mất mẫu, khả năng mở rộng hạn chế, cần thiết bị chuyên dụng. |
Làm thế nào để định lượng và đánh giá chất lượng lượng chromatin thu được sau quá trình phân mảnh bằng sóng siêu âm?
Sau khi xử lý bằng sóng siêu âm cho phương pháp ChIP, các nhà nghiên cứu phải đánh giá cả số lượng lẫn chất lượng của các mảnh chromatin. Bước xác minh này đảm bảo rằng quá trình phân mảnh chromatin đáp ứng các yêu cầu của các ứng dụng tiếp theo như ChIP-qPCR hoặc ChIP-seq.
Việc định lượng thường bắt đầu bằng việc đo nồng độ DNA. Các phương pháp quang phổ như phân tích Nanodrop hoặc các xét nghiệm huỳnh quang như định lượng DNA bằng Qubit cung cấp các ước tính đáng tin cậy về lượng chromatin thu được sau quá trình giải liên kết và tinh chế.
Tuy nhiên, chỉ dựa vào nồng độ DNA thôi thì không thể xác định được liệu quá trình phân mảnh có thành công hay không. Do đó, các nhà nghiên cứu đánh giá phân bố kích thước các đoạn DNA bằng các kỹ thuật điện di. Điện di trên gel agarose vẫn là phương pháp được sử dụng phổ biến để quan sát các đoạn DNA và xác minh rằng phần lớn các đoạn này nằm trong khoảng kích thước mục tiêu.
Các phòng thí nghiệm hiện đại hơn thường sử dụng các hệ thống điện di mao quản, chẳng hạn như Agilent Bioanalyzer hoặc TapeStation. Các nền tảng này cung cấp các biểu đồ phân bố kích thước chính xác và cho phép các nhà nghiên cứu phát hiện hiện tượng phân mảnh quá mức hoặc quá trình cắt nhỏ không hoàn toàn.
Khi đánh giá chất lượng chromatin sau quá trình phân mảnh bằng sóng siêu âm, các nhà nghiên cứu thường xác nhận:
- Phần lớn các đoạn DNA nằm trong khoảng 100–600 bp
- Sự phân bố các mảnh vỡ là nhất quán giữa các mẫu lặp lại
- Sự phân hủy DNA là rất ít
- Lượng chromatin thu được là đủ cho thí nghiệm ChIP đã lên kế hoạch
Việc kiểm soát chất lượng đúng cách đảm bảo rằng bước cắt nhỏ chromatin bằng sóng siêu âm mang lại kết quả có thể lặp lại và có ý nghĩa sinh học.
Kết luận: Kỹ thuật cắt nhỏ chromatin bằng sóng siêu âm cho nghiên cứu đáng tin cậy
Việc cắt nhỏ chromatin một cách đáng tin cậy là yếu tố cơ bản để đảm bảo thành công cho các nghiên cứu về ChIP và biểu sinh. Phương pháp cắt nhỏ bằng sóng siêu âm mang lại một giải pháp hiệu quả vì nó cho phép phá vỡ cấu trúc chromatin một cách chính xác, có thể lặp lại và không cần sử dụng hóa chất trong nhiều loại hình thí nghiệm khác nhau.
Bằng cách tối ưu hóa cẩn thận các thông số siêu âm, kiểm tra phân bố kích thước mảnh vỡ và lựa chọn hệ thống siêu âm phù hợp – cho dù là máy siêu âm dạng đầu dò, máy siêu âm nhiều ống VialTweeter hay máy siêu âm microplate UIP400MTP công suất cao – các nhà nghiên cứu có thể đạt được sự phân mảnh chromatin đồng nhất, từ đó mang lại kết quả ChIP và ChIP-seq chất lượng cao.
Khi nghiên cứu về biểu sinh tiếp tục mở rộng theo hướng tăng năng suất và nâng cao độ tái hiện của thí nghiệm, phương pháp cắt nhỏ chromatin bằng sóng siêu âm vẫn là một trong những phương pháp linh hoạt và đáng tin cậy nhất hiện có cho các phòng thí nghiệm sinh học phân tử hiện đại.
Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng Sản xuất tại Đức
Hielscher ultrasonicators nổi tiếng với chất lượng cao nhất và tiêu chuẩn thiết kế của họ. Mạnh mẽ và hoạt động dễ dàng cho phép tích hợp trơn tru của ultrasonicators của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi dễ dàng được xử lý bởi Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics là một công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt nhấn mạnh vào ultrasonicators hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, Hielscher ultrasonicators là CE tuân thủ và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.
Tube rack sonified in the UIP400MTP for chromatin shearing
Văn học / Tài liệu tham khảo
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
Các câu hỏi thường gặp
Chromatin là gì?
Chromatin là phức hợp cấu trúc gồm DNA và các protein liên quan, có chức năng tổ chức vật liệu di truyền bên trong nhân của tế bào nhân thực. Các protein chính trong chromatin là histone, xung quanh đó DNA được quấn lại để tạo thành các nucleosome. Cấu trúc này giúp nén chặt DNA đồng thời điều chỉnh việc tiếp cận thông tin di truyền cho các quá trình như phiên mã, nhân đôi và sửa chữa DNA.
Có những loại chromatin nào?
Chromatin thường được phân loại thành hai dạng chính: euchromatin và heterochromatin. Euchromatin có cấu trúc lỏng lẻo và hoạt động về mặt phiên mã, cho phép bộ máy phiên mã dễ dàng tiếp cận các gen. Heterochromatin có cấu trúc dày đặc hơn và không hoạt động về mặt phiên mã, thường chứa các chuỗi DNA lặp lại hoặc các gen bị ức chế. Heterochromatin có thể được chia thành heterochromatin cấu trúc, luôn ở trạng thái đóng gói chặt chẽ, và heterochromatin tùy chọn, có thể chuyển đổi giữa trạng thái hoạt động và không hoạt động tùy thuộc vào điều kiện tế bào.
Liên kết chéo là gì?
Liên kết chéo là một quá trình sinh hóa được sử dụng để ổn định các tương tác giữa các phân tử sinh học bằng cách hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa chúng. Trong nghiên cứu về chromatin, phương pháp liên kết chéo thường được sử dụng để bảo tồn các tương tác giữa protein và DNA trong cấu trúc chromatin trước khi tiến hành phân tích. Các chất hóa học như formaldehyde thường được sử dụng để tạo ra các liên kết cộng hóa trị có thể đảo ngược giữa DNA và các protein liên quan, giúp “Đóng băng” các tương tác phân tử tại một thời điểm cụ thể. Sự ổn định này cho phép các phức hợp chromatin được phân mảnh và xử lý mà không làm mất đi các liên kết tự nhiên giữa DNA và các protein điều hòa, điều này là rất quan trọng đối với các kỹ thuật như phương pháp miễn dịch kết tủa chromatin (ChIP).
ChIP là gì?
Phương pháp miễn dịch kết tủa chromatin (ChIP) là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để nghiên cứu các tương tác giữa protein và DNA trong cấu trúc chromatin. Trong phương pháp này, các phức hợp DNA-protein trước tiên được ổn định hóa, thường thông qua quá trình liên kết chéo, sau đó cấu trúc chromatin được phân mảnh. Các kháng thể đặc hiệu với protein mục tiêu được sử dụng để thực hiện quá trình miễn dịch kết tủa các phức hợp protein-DNA, từ đó cho phép tách chiết và phân tích các đoạn DNA liên quan.
ChIP được sử dụng để làm gì?
Phương pháp ChIP được sử dụng để xác định các vùng gen bị liên kết bởi các protein liên quan đến DNA cụ thể, chẳng hạn như các yếu tố phiên mã, các biến đổi histone hoặc các protein điều hòa liên quan đến chromatin. Kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu điều hòa gen, các biến đổi biểu sinh, các vị trí liên kết của yếu tố phiên mã và cấu trúc chromatin. Khi kết hợp với các phương pháp phân tích tiếp theo như PCR định lượng (ChIP-qPCR) hoặc giải trình tự công suất cao (ChIP-seq), kỹ thuật này cho phép lập bản đồ các tương tác protein–DNA trên toàn bộ bộ gen.
Có những loại ChIP nào?
Có một số biến thể của phương pháp miễn dịch kết tủa chromatin (ChIP) tùy thuộc vào thiết kế thí nghiệm và phân tích tiếp theo. Các phương pháp phổ biến nhất bao gồm ChIP-qPCR, giúp định lượng mức độ tập trung của các vùng gen cụ thể; ChIP-seq, sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới để lập bản đồ các tương tác protein-DNA trên toàn bộ bộ gen; và ChIP-chip, kết hợp ChIP với phân tích microarray DNA. Các biến thể bổ sung như ChIP bản địa (N-ChIP), phân tích chromatin không liên kết chéo, và ChIP liên kết chéo (X-ChIP), sử dụng liên kết chéo hóa học để ổn định các tương tác protein-DNA, cũng được sử dụng rộng rãi tùy thuộc vào câu hỏi sinh học đang được nghiên cứu.
Cắt nhỏ chromatin với năng suất cao bằng máy siêu âm trên đĩa vi giếng UIP400MTP
Hielscher Ultrasonics sản xuất homogenizers siêu âm hiệu suất cao từ phòng thí nghiệm đến quy mô công nghiệp.