Cắt nhỏ chromatin bằng siêu âm

Cắt nhỏ chromatin là bước then chốt trong nhiều quy trình nghiên cứu biểu sinh và sinh học phân tử, đặc biệt là kết tủa miễn dịch chromatin (ChIP), ChIP-seq và các xét nghiệm liên quan. Mục tiêu là phân mảnh chromatin thành các phức hợp DNA-protein có tính tái lập, đồng thời bảo toàn tính toàn vẹn của epitope và giảm thiểu thất thoát mẫu. Trong số các phương pháp hiện có, phân mảnh chromatin bằng siêu âm đã trở thành một phương pháp được sử dụng rộng rãi vì cho phép phân mảnh đáng tin cậy, không cần thuốc thử và có độ tái lập rất cao.

Cần cân nhắc những gì khi cắt nhỏ chromatin?

Để cắt nhỏ chromatin hiệu quả, cần kiểm soát cẩn thận các thông số thí nghiệm. Phân mảnh không phù hợp có thể ảnh hưởng bất lợi đến các thí nghiệm ChIP tiếp theo do tạo ra các mảnh quá lớn, bị phân hủy quá mức hoặc không đồng nhất giữa các mẫu.
Một trong những yếu tố quan trọng nhất là phân bố kích thước mảnh mong muốn. Đối với hầu hết các ứng dụng ChIP và ChIP-seq, các mảnh chromatin có kích thước từ 100 đến 600 cặp base là tối ưu. Khoảng kích thước này cho phép kết tủa miễn dịch hiệu quả, đồng thời cung cấp độ phân giải đủ để lập bản đồ hệ gen.

Một yếu tố then chốt khác là hiệu suất tạo liên kết chéo trước khi xử lý siêu âm. Hầu hết các quy trình ChIP đều bao gồm bước cố định bằng formaldehyde để ổn định các tương tác protein-DNA. Tuy nhiên, việc tạo liên kết chéo quá mức có thể khiến chromatin khó phân mảnh hơn, đòi hỏi thời gian xử lý siêu âm dài hơn và có khả năng làm tăng mức độ tiếp xúc với nhiệt.
Kiểm soát nhiệt độ cũng rất quan trọng. Xử lý siêu âm tạo ra năng lượng cục bộ có thể làm tăng nhiệt độ mẫu. Nhiệt độ cao có thể làm hỏng DNA hoặc gây biến tính protein, ảnh hưởng đến khả năng nhận diện của kháng thể trong quá trình ChIP. Vì vậy, nhiều nhà nghiên cứu thực hiện các chu kỳ siêu âm dạng xung kết hợp với những khoảng làm mát để duy trì độ ổn định của mẫu.
Nồng độ và thể tích mẫu cũng ảnh hưởng đến hiệu suất phân mảnh. Huyền phù chromatin có nồng độ cao có thể cần thời gian xử lý siêu âm dài hơn, trong khi mẫu có thể tích nhỏ đòi hỏi cung cấp năng lượng chính xác để tránh xử lý quá mức.
Cuối cùng, việc lựa chọn thiết bị siêu âm ảnh hưởng mạnh đến độ tái lập của thí nghiệm. Các thiết bị được thiết kế để cắt nhỏ chromatin thường cung cấp năng lượng siêu âm được kiểm soát và quy trình thao tác mẫu được chuẩn hóa, cho phép phân mảnh đồng nhất giữa nhiều mẫu.

Nên chọn thiết bị siêu âm nào để cắt nhỏ chromatin?

Các quy trình phòng thí nghiệm khác nhau đòi hỏi các cấu hình xử lý siêu âm khác nhau. Hệ thống tối ưu phụ thuộc phần lớn vào năng suất xử lý mẫu, thể tích và hình thức thí nghiệm.

Thiết bị siêu âm dạng đầu dò

Thiết bị siêu âm dạng đầu dò truyền năng lượng siêu âm trực tiếp vào mẫu thông qua một đầu dò titan. Cấu hình này cung cấp mật độ năng lượng rất cao và do đó phù hợp để phá vỡ chromatin mạnh mẽ trong từng mẫu riêng lẻ.

Thiết bị siêu âm dạng đầu dò đặc biệt hữu ích cho:

• Số lượng mẫu từ ít đến trung bình
• Chromatin khó phân mảnh
• Các quy trình thí nghiệm linh hoạt

Thiết bị siêu âm đa ống – VialTweeter

Đối với các phòng thí nghiệm xử lý đồng thời nhiều mẫu, thiết bị siêu âm đa ống VialTweeter cung cấp một giải pháp có độ tái lập cao. Hệ thống truyền năng lượng siêu âm gián tiếp qua giá đỡ lọ, cho phép phân mảnh mẫu trong nhiều ống đóng kín dưới các điều kiện giống hệt nhau.

Cấu hình này mang lại những ưu điểm quan trọng:

• Cắt nhỏ chromatin song song trong nhiều mẫu
• Loại bỏ tình trạng nhiễm bẩn liên quan đến đầu dò
• Độ tái lập cao giữa các ống
• Đơn giản hóa quy trình chuẩn bị mẫu ChIP

Các hệ thống đa ống như vậy rất phù hợp với các thí nghiệm ChIP thường quy và các nghiên cứu có năng suất xử lý mẫu trung bình.
 

Thiết bị siêu âm đĩa vi giếng – UIP400MTP

Các nghiên cứu biểu sinh có năng suất xử lý mẫu cao ngày càng dựa vào việc xử lý mẫu trong đĩa vi giếng. Thiết bị siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP được thiết kế để phân mảnh chromatin trực tiếp trong các đĩa vi giếng tiêu chuẩn mà không cần chuyển mẫu.

Phương pháp này cho phép:

• Xử lý đồng thời hàng chục hoặc hàng trăm mẫu
• Các quy trình dễ tự động hóa
• Phân bố năng lượng siêu âm đồng đều giữa các giếng
• Giảm đáng kể các bước thao tác với mẫu

Đối với các dự án sàng lọc ChIP-seq quy mô lớn hoặc các nghiên cứu biểu sinh có thông lượng cao, xử lý siêu âm trên đĩa vi giếng mang lại khả năng mở rộng quy mô và hiệu quả vượt trội. Máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP rất phù hợp để tích hợp vào các hệ thống xử lý chất lỏng và quy trình làm việc tự động trong phòng thí nghiệm.
 

Tại sao nên chọn xử lý siêu âm thay vì các kỹ thuật cắt phân mảnh chromatin khác?

So với các phương pháp sử dụng enzyme, xử lý siêu âm cho ChIP tạo ra sự phân mảnh không thiên lệch, vì quá trình này không phụ thuộc vào hoạt tính enzyme đặc hiệu trình tự. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các nghiên cứu biểu sinh trên toàn bộ hệ gen, trong đó độ bao phủ đồng đều là yếu tố thiết yếu.
Một ưu điểm lớn khác là khả năng mở rộng quy mô. Các hệ thống siêu âm có thể xử lý từng mẫu riêng lẻ, nhiều ống hoặc toàn bộ đĩa vi giếng, cho phép các phòng thí nghiệm lựa chọn cấu hình phù hợp nhất với thông lượng thí nghiệm của mình.
Cuối cùng, xử lý siêu âm cho phép kiểm soát rất tốt các thông số phân mảnh. Bằng cách điều chỉnh chu kỳ xung, thời gian và mức công suất, các nhà nghiên cứu có thể đạt được phân bố kích thước mảnh mong muốn một cách đáng tin cậy.

Làm thế nào để định lượng và đánh giá chất lượng chromatin thu được sau khi phân mảnh bằng siêu âm?

Sau khi xử lý siêu âm cho ChIP, các nhà nghiên cứu phải đánh giá cả số lượng và chất lượng của chromatin đã phân mảnh. Bước kiểm tra này đảm bảo quá trình phân mảnh chromatin đáp ứng các yêu cầu của những ứng dụng tiếp theo như ChIP-qPCR hoặc ChIP-seq.
Việc định lượng thường bắt đầu bằng đo nồng độ DNA. Các phương pháp đo quang phổ hấp thụ như phân tích bằng Nanodrop hoặc các phép thử huỳnh quang như định lượng DNA bằng Qubit cung cấp ước tính đáng tin cậy về lượng chromatin thu được sau khi loại bỏ liên kết chéo và tinh sạch.
Tuy nhiên, chỉ riêng nồng độ DNA không cho biết quá trình phân mảnh có thành công hay không. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đánh giá phân bố kích thước mảnh bằng các kỹ thuật điện di. Điện di gel agarose vẫn là phương pháp thường được sử dụng để quan sát các mảnh DNA và xác minh rằng phần lớn các mảnh nằm trong khoảng kích thước mục tiêu.
Các phòng thí nghiệm tiên tiến hơn thường sử dụng hệ thống điện di mao quản, chẳng hạn như Agilent Bioanalyzer hoặc TapeStation. Những hệ thống này cung cấp dữ liệu phân bố kích thước chính xác và cho phép các nhà nghiên cứu phát hiện tình trạng phân mảnh quá mức hoặc cắt phân mảnh chưa hoàn toàn.

Khi đánh giá chất lượng chromatin sau khi phân mảnh bằng siêu âm, các nhà nghiên cứu thường xác nhận:

• Phần lớn các mảnh DNA nằm trong khoảng 100–600 bp
• Phân bố các mảnh nhất quán giữa các mẫu lặp lại
• DNA bị phân hủy ở mức tối thiểu
• Tổng lượng nhiễm sắc chất thu được đủ cho xét nghiệm ChIP dự kiến

Kiểm soát chất lượng đúng cách đảm bảo bước cắt phân mảnh nhiễm sắc chất bằng siêu âm tạo ra các kết quả có khả năng tái lập và có ý nghĩa sinh học.

Kết luận: Cắt phân mảnh nhiễm sắc chất bằng siêu âm cho nghiên cứu đáng tin cậy

Cắt phân mảnh nhiễm sắc chất một cách đáng tin cậy là nền tảng cho sự thành công của nghiên cứu ChIP và di truyền học biểu sinh. Phân mảnh bằng siêu âm mang lại một giải pháp mạnh mẽ vì cho phép phá vỡ nhiễm sắc chất một cách chính xác, có khả năng tái lập và không cần thuốc thử trong nhiều hình thức thí nghiệm khác nhau.
Bằng cách tối ưu hóa cẩn thận các thông số xử lý siêu âm, kiểm tra phân bố kích thước mảnh và lựa chọn hệ thống siêu âm phù hợp – dù là thiết bị siêu âm dạng đầu dò, VialTweeter xử lý nhiều ống hay thiết bị siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP có năng suất xử lý cao – các nhà nghiên cứu có thể đạt được sự phân mảnh nhiễm sắc chất nhất quán, hỗ trợ tạo ra kết quả ChIP và ChIP-seq chất lượng cao.
Khi nghiên cứu di truyền học biểu sinh tiếp tục phát triển theo hướng tăng năng suất xử lý và nâng cao khả năng tái lập thí nghiệm, cắt phân mảnh nhiễm sắc chất bằng siêu âm vẫn là một trong những phương pháp linh hoạt và đáng tin cậy nhất hiện có cho các phòng thí nghiệm sinh học phân tử hiện đại.

Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng sản xuất tại Đức

Các thiết bị siêu âm Hielscher nổi tiếng với các tiêu chuẩn chất lượng và thiết kế cao nhất. Độ bền và khả năng vận hành dễ dàng cho phép tích hợp thuận lợi các thiết bị siêu âm của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Các thiết bị siêu âm Hielscher dễ dàng đáp ứng những điều kiện khắc nghiệt và môi trường có yêu cầu cao.

Hielscher Ultrasonics là công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt chú trọng đến các thiết bị siêu âm hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến nhất và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, các thiết bị siêu âm Hielscher tuân thủ CE và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.

Tài liệu / Tài liệu tham khảo

• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
• Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
• José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
• Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)