細菌サンプルの超音波による細胞凝集塊の分散

細菌サンプルが真の単一細胞懸濁液として得られることはまれです。培養では細菌が連鎖やフロックを形成して増殖し、環境分離株は細胞外高分子物質で結合した凝集体を形成します。また、遠心分離したペレットは、十分にボルテックス処理しても再懸濁しにくいことがよくあります。生菌数測定、光学密度測定、フローサイトメトリー、マイクロバイオームプロファイリングは、いずれもひとつの粒子がひとつの細胞に相当すると仮定しています。超音波による細胞凝集塊の分散は、この矛盾を解消します。短時間の制御された超音波処理を断続的に行うことで、細胞を溶解せずに凝集体を単一細胞へと分離します。

細胞凝集が測定結果の信頼性を損なう理由

凝集は生物学的な特性であり、前処理の誤りではありません。Staphylococcus、Streptococcus、Lactobacillus、Actinomyces、および多くの環境由来菌種は、連鎖、集塊、またはバイオフィルム断片として増殖します。また、細胞外DNAと多糖類は、ペレットやスワブ溶出液中で細胞同士を接着させます。その結果、分析には系統的な影響が生じます。

• 凝集塊に含まれる細胞数に関係なく、ひとつの凝集塊からひとつのコロニーが形成されるため、コロニー数が過小評価されます。
• 光学密度測定と粒子計数装置は、細胞ではなく凝集体を測定するため、増殖曲線に偏りが生じます。
• フローサイトメトリーとセルソーティングでは、凝集したイベントが誤って計数され、分析から除外されます。
• DNAおよびタンパク質の抽出結果には、凝集体の表面にある細胞だけが反映されるため、マイクロバイオームおよびオミクスデータに偏りが生じます。

従来の対処法は、時間がかかる、不完全である、または化学的な変化を引き起こすという問題があります。激しいピペッティングやボルテックス処理でも、微小凝集体が残ります。酵素やキレート剤による分散は、分析対象となる可能性のある細胞表面を変化させます。制御されたキャビテーションによる機械的な凝集塊の分散は、数秒以内に作用し、添加剤を必要としません。

超音波処理が細胞を溶解せずに凝集塊を分散する仕組み

超音波による細胞凝集塊の分散は、機械的強度の違いを利用します。細菌の凝集体は、比較的弱い細胞間結合と細胞外マトリックスによって保持されている一方、損傷のない細胞エンベロープは、はるかに高いせん断に耐えます。校正された超音波が懸濁液に入ると、音響キャビテーションによって微小流、圧力パルス、せん断力が発生し、まず凝集体の界面に作用します。膜が破裂するエネルギーレベル（細胞溶解）に達する前に、凝集塊、連鎖、バイオフィルム断片がせん断によって分離されます（解凝集）。

細菌の細胞凝集塊の超音波分散

凝集塊の分散か細胞溶解か – 超音波処理パラメーターの重要性

実用上、凝集塊の分散と細胞溶解は、同じ装置を異なるパラメーターで運転することで実行できます。適度な振幅、短いパルスサイクル、制御された温度では、生存可能な単一細胞懸濁液が得られます。振幅、処理時間、またはサンプル温度を上げると、プロセスは細胞内の標的を得るための完全な細胞破砕へと移行します。Hielscherの発振器では、振幅、出力、パルス、投入エネルギーを正確に設定し、処理方法を保存できるため、サンプル、操作者、処理回の違いを超えて、凝集塊の分散工程を再現できます。

効率的な非接触超音波処理

超音波浴による処理では、この制御性に匹敵できません。超音波洗浄浴や洗浄槽が供給する超音波エネルギーは低いものに限られるため、前処理が不完全になります。また、キャビテーションが不均一に発生するため、各チューブの処理は浴内の位置に左右されます。VialTweeterは、強力で集束した超音波力を、容器壁を介して最大10個の密閉サンプルに同時に直接伝達します。超音波浴では長時間かつばらつきのある曝露が必要な処理も、標準化されたパルスパターンで完了します。
Hielscherの非接触超音波処理装置は、密閉バイアルの壁を介して強力で集束した超音波を加えます。VialTweeterは、サンプル内にプローブを入れず、交差汚染もエアロゾルの放出もなく、最大10本のバイアルを同じ強度で同時に処理します。処理能力上の要件がある場合、マイクロプレート超音波処理装置UIP400MTPおよびUIP550MTPは、同じ制御されたエネルギー伝達をマルチウェルプレートにも適用します。

非接触超音波による凝集塊分散の利点

• 交差汚染ゼロ： バイアルは常に密閉され、サンプルにプローブを浸さないため、交差汚染とサンプル損失を完全に回避できます。サンプル間で滅菌すべきものはなく、ある処理回が次の処理回に影響することもありません。
• エアロゾルからの保護： 開放系でのプローブによる超音波処理は、感染性エアロゾルを発生させ、装置表面を汚染します。密閉バイアルでの超音波処理は、サンプルをそのチューブ内に封じ込めます。これは、Mycobacterium tuberculosisなどの病原性細菌や、その他のBSL-2またはBSL-3の病原体を扱う際に重要です。
• 先端の侵食なし： チタン製プローブは、運転中に少量の微粒子をサンプル内へ放出することがあります。これらの粒子は、後続工程における光学密度や粒子数を変化させます。容器壁を介した間接的な超音波処理は、この固形物の発生源を完全に排除します。
• 均一なサンプル処理能力： VialTweeterは、最大10本のバイアルのそれぞれに同じ超音波強度を供給するため、超音波処理結果は均一で再現性があります。超音波浴や単一サンプルへのプローブ処理で問題となる位置の影響がなくなり、反復サンプル間でベースラインの比較可能性が維持されます。
• サンプルの完全性：処理中はチューブが密閉されたままなので、サンプルが汚染、変質、または揮発することはありません。追加の移し替え工程を行う余裕のない貴重な臨床ペレットを含め、少量のサンプルも希釈せずに処理できます。
• プロセス制御： 振幅は20–100%、パルスモードは0–100%の範囲で調整可能です。また、システムは温度モニタリングに対応しているため、熱に敏感な菌株やタンパク質の温度を、損傷を引き起こす閾値未満に保てます。

代表的な用途

• マイクロバイオームおよび腸内容物の分析：平板培養やシーケンシングの前にLactobacillus、Bifidobacterium、および糞便サンプルを分散し、凝集塊による計数値の低下を防ぎます。
• 食品および水の微生物学：スワブ、洗浄液、増菌培養液中のフロックを分散し、コロニー数と生存性を正確に測定します。
• バイオフィルム研究：表面タンパク質を除去してしまう酵素処理を行わずに、担体や表面から細胞を単一細胞懸濁液として回収します。
• 臨床診断：封じ込め条件下で、喀痰、膿、スワブ溶出液を再懸濁します。
• 細胞培養：計数や継代の前に、哺乳類細胞、昆虫細胞、CHO細胞の凝集体を分離します。
• ワークフロー全体の前処理：低振幅で凝集塊を分散する装置が、高い設定では完全な細胞破砕を行うため、チューブ間の移し替えなしに、細胞溶解、タンパク質抽出、DNA断片化を続けて実行できます。

文献 / 参考資料

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.