細菌試料の超音波による細胞分散

細菌の検体が、真の単一細胞懸濁液として届くことはめったにありません。培養菌は鎖状やフロック状に増殖し、環境由来の分離株は細胞外高分子物質によって結合した凝集体を形成し、遠心分離後の沈殿物は、徹底的にボルテックス処理を行っても再懸濁しにくいことがよくあります。生菌数、光学密度、フローサイトメトリー、マイクロバイオームプロファイリングはいずれも、1つの粒子が1つの細胞に相当することを前提としています。 超音波による細胞分散法は、この矛盾を解決します。短時間の制御された超音波処理により、凝集塊を細胞を破壊することなく単一細胞へと分離します。

細胞凝集が結果に悪影響を与える理由

凝集は生物学的特性であり、検体調製上の誤りではない。ブドウ球菌、連鎖球菌、乳酸菌、放線菌、および多くの環境微生物は、鎖状、塊状、あるいはバイオフィルムの断片として増殖し、細胞外DNAや多糖類が細胞同士を接着させ、ペレットやスワブ抽出液中に凝集塊を形成する。これによる分析上の影響は系統的である：

• コロニー数は過小評価されています。なぜなら、1つの塊には、そこに含まれる細胞の数にかかわらず、1つのコロニーとしてカウントされるからです。
• 光学密度や粒子カウンターは、細胞ではなく凝集体を測定するため、増殖曲線に偏りが生じます。
• フローサイトメトリーおよび細胞選別では、凝集したイベントが誤ってカウントされ、解析から除外されてしまう。
• DNAおよびタンパク質の抽出は、凝集体表面にある細胞のみを対象としているため、マイクロバイオームデータやオミクスデータに偏りが生じます。

従来の処理法は、時間がかかり、不完全であるか、あるいは化学的変化を伴うものです。激しくピペッティングやボルテックス処理を行っても、微細な凝集体が残ってしまいます。酵素やキレート剤を用いた分散処理では、分析対象とする細胞表面が変化してしまう可能性があります。一方、制御されたキャビテーションによる機械的分散は、数秒で作用し、添加物を一切必要としません。

超音波処理が、細胞を破壊することなくどのように分散させるか

超音波による細胞解離は、機械的強度の違いを利用しています。細菌の凝集体は、比較的弱い細胞間結合と細胞外マトリックスによって保持されていますが、無傷の細胞膜はそれよりもはるかに高いせん断力に耐えることができます。 調整された超音波が懸濁液に入ると、音響キャビテーションによって微小流、圧力パルス、およびせん断力が発生し、これらはまず凝集体の界面で作用する。膜が破裂（溶解）するエネルギーレベルに達する前に、塊、鎖状構造、およびバイオフィルムの断片はせん断されて分離される（脱凝集）。

細菌細胞の凝集塊に対する超音波による分散

分解または溶解 – 超音波処理のパラメータがなぜ重要なのか

実際の問題として、分散と溶解は、異なるパラメータで動作させる同一の装置による処理であると言えます。適度な振幅、短いパルスサイクル、および温度制御下では、生存可能な単一細胞懸濁液が得られます。 振幅、照射時間、または試料温度を上げると、細胞内標的を対象とした完全な細胞破砕へとプロセスが移行します。Hielscher製ジェネレーターでは、振幅、出力、パルス、エネルギー入力を精密に設定し、その設定を保存することができるため、分散工程は試料、操作者、実行回数を問わず再現性が確保されます。

効率的な非接触超音波処理

浴槽式超音波洗浄では、このような制御は不可能です。超音波洗浄槽やタンクから得られる超音波エネルギーは低いため、前処理が不完全になる上、キャビテーションの発生も不均一であり、各チューブは槽内での位置に応じて異なる処理を受けることになります。 VialTweeterは、強力で集束された超音波エネルギーを容器の壁を直接透過させ、最大10個の密閉サンプルを同時に処理します。浴槽内での長時間の変動する照射を必要とする処理も、標準化されたパルスパターンで完了します。
Hielscher社の非接触型超音波処理装置は、密閉されたバイアルの壁を通して、強力で集束された超音波を照射します。VialTweeterは、サンプル内にプローブを挿入することなく、交差汚染やエアロゾルの放出も発生させずに、最大10本のバイアルを同時に同一の強度で処理します。 処理能力が求められる場合、UIP400MTPおよびUIP550MTPマイクロプレート用超音波処理装置は、マルチウェルプレートに対しても同様に制御されたエネルギー伝達を実現します。

非接触型超音波分散法の利点

• 相互汚染ゼロ： バイアルは常に密閉された状態が保たれ、プローブが試料に浸漬されることがないため、交差汚染や試料の損失を完全に防ぐことができます。試料の切り替え時に滅菌が必要な部品はなく、ある測定結果が次の測定に影響を与えることもありません。
• エアロゾルからの保護： 開放型プローブによる超音波処理では、感染性エアロゾルが発生し、機器の表面が汚染されます。密閉バイアルを用いた超音波処理では、試料が専用のチューブ内に封じ込められるため、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）やその他のBSL-2・BSL-3指定病原体を扱う際に重要です。
• チップの摩耗がない： チタン製プローブは、稼働中に少量の微粒子を試料中に放出することがあります。これらの粒子は、下流の吸光度や粒子数を変化させます。容器の壁を介した間接的な超音波処理を行うことで、この固形物の発生源を完全に排除することができます。
• 均一なスループット： VialTweeterは、最大10本のバイアルのそれぞれに均一な超音波強度を照射するため、超音波処理の結果は均一で再現性が高くなります。超音波浴や単一サンプルへのプローブ照射に見られる位置による影響がなくなり、反復実験間でもベースラインの比較が可能になります。
• 試料の完全性：処理の全工程を通じてチューブは密閉された状態を保つため、試料が汚染されたり、劣化したり、揮発したりすることはありません。希釈なしで微量の試料も処理可能であり、余分な移し替え工程を避ける必要がある貴重な臨床用ペレットなども対象となります。
• プロセス制御： 振幅は20～100％の範囲で調整可能であり、パルスモードは0～100％の範囲で設定可能です。また、本システムは温度モニタリング機能を備えており、温度に敏感な菌株やタンパク質が損傷を受ける閾値を下回るよう管理されます。

代表的なアプリケーション

• マイクロバイオームおよび腸内容物の分析：プレート培養やシーケンシングを行う前に、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、および糞便サンプルを分散させ、凝集によって菌数が過小評価されないようにする。
• 食品および水の微生物学：正確な菌落数および生存率の測定のために、スワブ、洗浄液、および増菌培地中のフロックを分散させる。
• バイオフィルム研究：表面タンパク質を剥離させるような酵素処理を行わずに、担体や表面から細胞を単一細胞懸濁液として回収すること。
• 臨床診断：封じ込め条件下での喀痰、膿、およびスワブ抽出液の再懸濁。
• 細胞培養：計数および継代を行う前に、凝集した哺乳類、昆虫、およびCHO細胞の凝集体を分離する。
• ワークフロー全体の準備：低振幅で細胞を分散させるのと同じ装置が、高設定では細胞を完全に破砕するため、チューブへの移し替えをせずに、細胞溶解、タンパク質抽出、DNA断片化を連続して行うことができます。

文献・参考文献