プロテオミクスプロトコル：非接触超音波処理によるMS用ペプチドサンプル調製の改善

ボトムアッププロテオミクスは、現代のバイオマーカー探索、構造生物学、臨床診断の基盤となっています。質量分析（MS）の前にタンパク質をペプチドに消化することで、研究者はより高い配列カバレッジと、より信頼性の高い定量を実現できます。しかし、複雑性の高い生体サンプルをMS用に調製することは、依然として技術的に困難です。近年の手法の進歩は、制御された超音波処理 – 特に非接触型のVialTweeterマルチチューブ超音波処理装置とUIP400MTPマイクロプレート超音波処理装置による処理 – が、このワークフローを大幅に効率化し、再現性を向上させ、装置でよく生じるボトルネックを防止できることを示しています。
MSによる分析に適したサイズのペプチドを得るための、詳細なサンプル調製プロトコルをご覧ください。

ペプチドサンプル調製に非接触超音波処理を使用すべき方は？

ボトムアッププロテオミクスおよび探索研究ラボ： LC-MSまたはMALDIワークフロー用に複雑性の高いサンプルを調製し、多様な生体マトリックスから一貫して高収率でペプチドを回収する必要がある研究者。
S-Trap™および懸濁トラッピングのユーザー： マイクロカラムによるクリーンアップを利用し、カラムの目詰まりを防ぎ、スムーズなサンプルのロードと消化を確保するために、制御されたDNAせん断を必要とするチーム。
臨床研究およびトランスレーショナル研究グループ： 組織、細胞、血漿、血清、脳脊髄液を処理し、バッチ間の再現性とサンプルの完全性が極めて重要となる研究室。
定量およびターゲットMSのチーム： 厳密な比較研究を実施し、プローブ式超音波処理装置がもたらす交差汚染リスクによって、低存在量ペプチドの定量が損なわれるおそれがある研究室。
共用研究施設およびハイスループット処理施設： 複数の生物学的反復サンプルを同時に処理し、プローブ洗浄を不要にし、実作業時間を短縮し、無菌条件を維持するVialTweeterによる密閉チューブ内でのマルチチューブブロック超音波処理の利点を活用できるグループ。
PTMおよびタンパク質構造の研究者： 細胞溶解およびホモジナイズの際に、不安定な修飾を保持し、配列カバレッジを最大化するため、温度を制御した穏やかな処理を必要とする研究者。

VialTweeterの完全な構成：マルチサンプル超音波処理装置VialTweeterは、複数の密閉サンプルを非接触プロセスで超音波処理できます。

プロテオミクス用の複数の密閉バイアルを非接触でサンプル調製するための、マルチサンプル超音波処理装置「VialTweeter」

この解説動画では、実験室、分析、研究における細胞溶解、細胞破砕、タンパク質単離、DNA・RNAの断片化などの試料調製に、どの種類の超音波処理装置が最適かを説明します。用途、試料量、試料数、処理能力に合った種類の超音波処理装置をお選びください。Hielscher Ultrasonicsには、お客様に最適な超音波ホモジナイザーがあります。

プロトコルの概要：組織および細胞からMS分析可能なペプチドへ

Wojtkiewicz et al.が示した、広く採用されているボトムアッププロテオミクスのワークフローは、多様な生体マトリックスからペプチドサンプルを調製するための、堅牢でスケールアップ可能な方法を提供します。このプロトコルでは、50–100 mgの急速凍結組織または1–20百万個の細胞を出発材料とし、懸濁トラッピング（S-Trap™）技術を組み込むことで、酵素消化の前に界面活性剤、塩、汚染物質を効率的に除去します。
溶解、タンパク質定量、還元、アルキル化の後、サンプルを酸性化してS-Trap™スピンカラムにロードし、そこでトリプシン/lysCによる消化を行います。得られたペプチドを溶出し、乾燥させ、LC-MS分析に供します。50 mgのヒト心臓組織に適用すると、このワークフローは30–40回の注入に十分なペプチドを一貫して生成し、各分析で4,000種類を超える固有のタンパク質を同定します。化学的処理とカラムによるクリーンアップは明確に規定されていますが、この一連の工程の成功は、初期の物理的破砕とDNA管理のステップに大きく依存します。
このプロトコルは、超音波処理による細胞溶解とDNAせん断にVialTweeterマルチチューブ超音波処理装置を使用することを推奨しています – どちらのステップもペプチド分析に不可欠です。

VialTweeterは、超音波によるサンプル調製を同時に行うために、一般的な試験用バイアルを最大10本保持できます

VialTweeterは、密閉された1.0、1.5、2.0mLのEppendorfチューブ、および各種NUNCバイアルを超音波処理します

タンパク質抽出のための超音波による細胞および組織の溶解

ボトムアッププロテオミクスのワークフローでは、後続の質量分析用にタンパク質を抽出するための細胞サンプルの溶解において、超音波処理が重要なステップとなります。細胞ペレットにSDS細胞溶解バッファーを加えた後、VialTweeterマルチチューブ超音波処理装置を使用してサンプルを超音波処理します。このプロトコルでは1.5 mLのマイクロ遠心チューブを使用し、超音波処理装置を30%の出力で10秒間作動させ、10秒間停止するサイクルを3回繰り返すよう指定しています。1分間待った後、このサイクルをさらに二度繰り返します。サンプルは氷で継続的に冷却します。
この処理は細胞破砕を助けるだけでなく、特に、溶解時に放出されるゲノムDNAをせん断するために必要です。効果的なDNAせん断は、サンプルの粘度を低下させ、S-Trap™カラムの目詰まりを防ぐうえで極めて重要であり、最適なタンパク質回収と、信頼性の高い後続のペプチド消化を確保します。

超音波によるDNAせん断の極めて重要な役割

S-Trap™を使用するワークフローで最も頻繁に生じる問題の一つはカラムの目詰まりであり、その原因はほぼ例外なく、細胞または組織のホモジナイズ時に放出される高分子量のゲノムDNAです。未断片化のDNAはサンプルの粘度を著しく増加させ、ペプチドを捕捉し、微細孔を持つS-Trap™吸着剤層を塞ぎます。
超音波処理は、DNAを機械的に小さな可溶性断片に断片化することで、この問題を解決します。制御された音響エネルギーを加えることで、VialTweeterは過剰な熱を発生させたり外来の汚染物質を混入させたりすることなく、核酸を効率的にせん断します。この粘度低下により、スムーズなサンプルのロード、一貫した通過流量、および中断のない消化反応の進行が確保されます。

最適化されたVialTweeterの超音波処理パラメーター

このプロトコルでは、生体サンプルの完全性と後続のMSへの適合性を考慮して最適化された、再現性の非常に高い超音波処理条件を指定しています。Hielscher VialTweeter非接触型ブロック超音波処理装置を使用して1.5mLのマイクロ遠心チューブ内のサンプルを処理する場合、以下のパラメーターにより、タンパク質構造を保持しながら溶解と最適なDNAせん断を実現します：

振幅：出力30%
サイクルパターン：10秒間ON / 10秒間OFF
処理時間：3サイクル（10秒間ON/10秒間OFF）→ 氷上で1分間休止 → さらに2回繰り返す
温度管理：熱変性および時期尚早な酵素活性を防ぐため、処理中はサンプルを氷上に置きます

このパルス超音波処理法は、局所的な過熱を防ぎ、ペプチドの酸化を最小限に抑え、すべてのバイアルに均一な音響曝露を確保します。密閉チューブを使用する構成は、サンプル間のプローブ洗浄も不要にし、実作業時間と作業者によるばらつきを大幅に低減します。

非接触式の複数チューブ用超音波処理装置VialTweeterは、交差汚染を起こすことなく、最大10本の密閉バイアルをまったく同じ条件で同時に超音波処理できる独自の超音波システムです。

現代のプロテオミクスワークフローにおける主な利点

ボトムアッププロテオミクスの一連の工程にVialTweeterを組み込むことで、運用面および科学面でいくつもの利点が得られます：

一貫したDNA断片化： すべてのバイアルに音響エネルギーを均一に供給することで、再現性のある粘度低下を確保し、S-Trap™へのロードにおけるバッチ間のばらつきを防ぎます。
不安定な修飾の保持： 氷浴中での低温処理は翻訳後修飾（PTM）を保護し、細胞溶解中に熱によって生じるタンパク質凝集を防ぎます。
後続処理の効率化： VialTweeterで処理した溶解液は、追加のクリーンアップ工程なしで、直接遠心分離によって清澄化し、定量できるため、S-Trap™による消化までの工程を迅速化できます。
スケールアップ能力と柔軟性： 同じ超音波処理設定を、複雑性の高い組織サンプルと細胞懸濁液の両方に適用でき、探索プロテオミクス、ターゲット定量、糖鎖プロテオミクスのワークフローに対応します。Hielscherのマイクロプレート超音波処理装置により、マルチウェル内の多数のサンプルへ容易にスケールアップできます。

画像は、プロテオミクス用のタンパク質抽出およびタンパク質消化中にプロセス温度を精密に制御するため、冷蔵チャンバー内に設置されたVialTeeterを示しています

非接触型マルチチューブ超音波処理装置VialTweeterは、冷蔵キャビネット内で運転できます

プロテオミクスのサンプル調製用超音波処理装置

質量分析用の高品質なペプチドサンプルの調製には、効率的な溶解に加えて、DNAせん断、温度、汚染防止の精密な制御が必要です。ボトムアッププロテオミクスのワークフローにHielscher VialTweeterを組み込むことで、S-Trap™の目詰まりをなくし、再現性のあるタンパク質回収を確保し、高感度のMS分析に必要な清浄性を維持できます。ヒト組織、培養細胞、複雑な溶解液のいずれを処理する場合でも、超音波ブロック処理は、現代のプロテオミクス研究室が求める信頼性、スケールアップ能力、プロセス制御を提供します。
より多くのサンプルの処理にスケールアップするには、Hielscherの集束型非接触マイクロプレート超音波処理装置UIP400MTPおよびUIP550MTPをご活用ください！あらゆる標準マルチウェルプレートを処理して、ハイスループットのプロテオミクスを実現できます！

密閉チューブ内での処理と従来のプローブ式超音波処理装置の比較

従来、研究者はDNAせん断に直接接触型のプローブ式超音波処理装置を使用してきました。プローブ式システムは効果的ではあるものの、プロテオミクスのワークフローにいくつかの重大な制約をもたらします：

交差汚染リスク： 複数のサンプルでプローブを再使用すると、エアロゾルの持ち越しが発生し、交差汚染物質が混入して、定量MSの結果を歪めます。
サンプル損失： 直接挿入すると、飛散、蒸発、および貴重なペプチドのプローブ表面への付着が生じるおそれがあります。
洗浄： 処理ごとにプローブを徹底的に除染するには時間がかかり、多くの場合は不完全であるため、低存在量タンパク質の研究が損なわれます。

VialTweeterブロック超音波処理装置は、密閉されたマイクロ遠心チューブ内でサンプル処理の全工程を行います。この密閉システムの設計は、プローブとサンプルの接触をなくし、エアロゾルの発生を防ぎ、ホモジナイズと溶解の全工程を通じて厳密な無菌条件を維持します。複雑性の高い組織溶解液や複数の細胞株を処理する研究室では、これにより、よりクリーンなMSデータ、より高いペプチド回収率、より信頼性の高い生物学的反復サンプルが得られます。

マルチウェルプレートでのハイスループットサンプル調製へのスケールアップ

マイクロプレート超音波処理装置UIP400MTPおよびUIP550MTPを使用すれば、チューブ内での処理を、あらゆる標準マルチウェルプレートでのハイスループットサンプル処理へ容易にスケールアップできます。

マイクロプレート超音波処理装置UIP400MTPは、マルチウェルプレートおよびマルチスクリーンプレート内のサンプルからタンパク質を同時に抽出できます – プロテオミクスにおけるハイスループットサンプル調製を容易にします

マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPによるサンプルからのハイスループットタンパク質抽出

ペプチドサンプル調製のための超音波処理に関するよくある質問

S-Trap™によるペプチド処理の前に、なぜ超音波処理が必要なのですか？ 

細胞または組織の溶解時に放出される高分子量のゲノムDNAをせん断するために、超音波処理が必要です。未断片化のDNAはサンプルの粘度を大幅に増加させ、S-Trap™マイクロカラムを詰まらせたりペプチドを捕捉したりするおそれがあり、回収率とMSへの適合性を著しく低下させます。

VialTweeterブロック超音波処理装置は、従来のプローブ式超音波処理装置と比べて、サンプル調製をどのように改善しますか？

 処理ごとに入念な洗浄を必要とし、エアロゾルの持ち越しリスクがある直接接触型のプローブ式超音波処理装置とは異なり、VialTweeterは密閉されたバイアルおよびマイクロ遠心チューブ内でサンプル処理の全工程を行います。この密閉チューブの設計は、交差汚染をなくし、サンプル損失を防ぎ、ホモジナイズと細胞溶解の全工程を通じて厳密な無菌条件を維持します。

プロテオミクスのサンプル調製に最適な超音波処理パラメーターは何ですか？

 細胞や組織などの生体サンプルでは、推奨プロトコルはVialTweeter超音波処理装置を30%の出力で使用し、10秒間作動 / 10秒間停止のサイクルを3回繰り返します。処理中はサンプルを氷上に置き、≥5百万個の細胞を処理する場合は、サイクルをさらに二度繰り返すことが推奨されます。(cf. Wojtkiewicz et al., 2021)

サンプルのロード中にS-Trap™カラムが詰まった場合、どうすればよいですか？

 カラムの目詰まりは通常、DNAによる高い粘度、または不十分な清澄化が原因です。これを解消するには、ピペッティングの前に溶解液を十分に遠心分離し、超音波処理によってDNAが適切にせん断されていることを確認してください。

非接触超音波処理は、定量プロテオミクスのワークフローにどのような利点をもたらしますか？ 

定量研究では、サンプル間の微量な交差汚染でさえ、低存在量ペプチドの測定値を歪めるおそれがあります。VialTweeterによる密閉チューブ内での複数バイアル処理は、プローブの挿入を不要にし、バッチ間の再現性を確保し、正確な比較分析のためにサンプルの完全性を維持します。

このプロトコルでは、どの程度のタンパク質収量とMS分析深度を期待できますか？

 50 mgのヒト心臓組織または5百万個の細胞を出発材料とすると、S-Trap™ワークフローは通常、30–50回のLC-MS注入に十分なペプチドを生成し、各分析で4,000種類を超える固有のタンパク質を一貫して同定します。(cf. Wojtkiewicz et al., 2021)

文献 / 参考資料

FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.

Hielscher Ultrasonicsは、サンプル調製および臨床分析用の強力な非接触型超音波処理装置を提供しています。マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTP、VialTweeter、CupHorn、およびGDmini2フロー式超音波処理装置は、サンプルに触れることなく処理します。