ショットガンプロテオミクスにおけるマイクロプレート超音波処理 – アプリケーションノート

ショットガンプロテオミクスでは、複雑な生体材料をLC-MS/MS分析に適したペプチドに変換するために、効率的で再現性のあるサンプル調製が不可欠です。マイクロプレート用超音波処理装置UIP400MTPは、少量サンプルの標準化された並列超音波処理を可能にすることでこのプロセスを支援し、研究室におけるマイクロプレートベースのワークフローでの破砕、抽出、再可溶化の改善に役立ちます。本アプリケーションノートでは、PLA2G12A/Th17研究で公表された細胞外小胞のワークフローを、研究室で検証された事例として用い、UIP400MTPをプロテオミクスのサンプル調製に組み込む方法を説明します。

ショットガンプロテオミクスの再現性を高めるマイクロプレート超音波処理

プロテオミクス研究者にとって、再現性のあるサンプル調製は高品質なLC-MS/MSデータを得るうえで極めて重要です。マイクロプレート用超音波処理装置UIP400MTPは、プレートベースのワークフローおよび少量サンプルを扱う高スループットのワークフローで、標準化された並列超音波処理を支援します。

特に、以下を扱う研究室に有用です：

• 多数のウェルにわたって一貫した処理が必要な大規模サンプルセット
• サンプルの損失とばらつきを最小限に抑える必要がある、投入量が限られた材料
• 細胞外小胞などの脂質に富むサンプル
• 効率的な破砕、抽出、または再可溶化が必要な複雑な生体試料
• 条件間および反復サンプル間の再現性が不可欠な比較ショットガンプロテオミクス

消化前にマイクロプレート超音波処理を組み込むことで、研究者は以下の工程に向けてサンプルの準備状態を改善できます：

• タンパク質の抽出と再可溶化
• トリプシン/Lys-C消化
• Nano-LC/MS/MSデータ取得
• 後段の定量プロテオミクス解析

マイクロプレート超音波処理は、以下にメリットをもたらします：

• プロテオミクスのコア施設
• EV研究室
• 免疫学および細胞生物学の研究室
• トランスレーショナル研究グループ
• 単一サンプルの調製から、より高スループットのワークフローへと規模を拡大するライフサイエンスチーム

細胞外小胞のプロテオーム解析に向けた高スループットのサンプル調製

ショットガンプロテオミクスとは？

ショットガンプロテオミクスは、全細胞溶解物や組織抽出物から、精製オルガネラ、細胞外小胞、投入量の少ない臨床検体まで、複雑な生体サンプルを特徴付けるための中心的な分析戦略となっています。その主な強みは、タンパク質消化、高分解能液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析、および計算によるペプチドからタンパク質への推定を組み合わせることにあります。しかし、最終的なプロテオームデータセットの品質は、サンプルが質量分析計に到達するよりはるか前に決まります。効率的なサンプル破砕、タンパク質の可溶化、妨害物質の除去、再現性のある酵素消化、および安定したペプチド回収は、いずれも網羅性の深さと定量的な信頼性を左右します。
量が限られたサンプルや貴重なサンプルを扱うプロテオミクス研究者やライフサイエンス研究室にとって、サンプル調製はしばしばボトルネックとなります。

プロテオミクスにおける細胞外小胞の課題

例えば細胞外小胞（EV）は、特に扱いの難しいサンプル群です。EVは膜に包まれた脂質に富むナノスケールの粒子で、タンパク質収量が比較的少なく、脂質、塩、界面活性剤、血清タンパク質、およびその他のマトリックス成分が持ち越される可能性が高いという特徴があります。これらの特徴は、消化効率、クロマトグラフィー性能、エレクトロスプレーの安定性、およびペプチド同定を妨げることがあります。したがって、EVプロテオミクスの調製ワークフローには、小胞構造を破砕し、内包タンパク質を可溶化するのに十分な処理能力が必要であり、同時に後段の酵素消化とLC-MS/MS分析に適合していなければなりません。
このような状況で、マイクロプレートに対応した超音波処理は、再現性のある並列サンプル処理の実用的な手段となります。Hielscherのマイクロプレート用超音波処理装置UIP400MTP（400 W）とUIP550MTP（550 W）は、マルチウェルプレートや少量用容器内のサンプルを超音波処理するために設計されており、従来の単一プローブ式超音波処理装置よりも高スループットのワークフローを支援します。プロテオミクス研究室にとって、この形式は、手作業によるばらつきを減らし、複数サンプルの並列処理を改善し、プレートベースのサンプル調製工程により自然に統合できるため、魅力的です。

ワークフローの例

PLA2G12Aが駆動するTh17細胞生物学の最近の細胞外小胞プロテオミクスワークフローは、マイクロプレート用超音波処理装置UIP400MTPをショットガンプロテオミクスのサンプル調製に組み込む方法について、研究室で検証された有用な事例を示しています。この一連の研究では、メタノール処理、UIP400MTPによる超音波処理、遠心分離、乾燥、トリプシン/Lys-C消化、およびナノフローLC・高分解能タンデムMSを用いて、プロテオーム解析用のEVサンプルを処理しました。この生物学的研究は2026年にMochizuki-Onoらによって報告され、プロテオミクス解析は、病原性T細胞応答においてPLA2G12AがEVの内包タンパク質をどのように変化させるかを明らかにするうえで役立ちました。

マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTP

マイクロプレート超音波処理を行う理由は？
UIP400MTPは、少量サンプルの標準化された並列超音波処理を可能にします。これは、再現性、少ないサンプル投入量、および複数サンプルの処理能力が重要な場合に有用です。


品質管理チェックリスト

• すべてのサンプルで、EVのタンパク質換算投入量が等しいことを確認します。
• 無作為化またはバランスを取ったサンプル処理配置を使用します。
• メタノール量、超音波処理時間、乾燥時間、および消化液量を一定に保ちます。
• ペプチド収量とタンパク質の総同定数を監視します。
• 未切断率とペプチド長の分布を確認します。
• クロマトグラフィーのピーク形状と保持時間の再現性を確認します。
• キャリーオーバーを監視するため、ブランクを含めます。
• 大規模な研究では、プールしたQCサンプルを使用します。
• 反復サンプルの変動係数を評価します。
• PCAまたは関連する手法を用いて、バッチ効果や外れ値サンプルを特定します。

記録に関する推奨事項

このワークフローを公表または記録する際は、EV投入量、プレート形式、メタノール量、UIP400MTPの振幅と超音波処理時間、遠心分離条件、乾燥方法、消化バッファー、酵素濃度、消化時間、酸性化条件、LC-MS/MSプラットフォーム、データ取得モード、ソフトウェアのバージョン、データベース、FDR閾値、正規化方法、および統計解析のワークフローを報告してください。
すべてのHielscherマイクロプレート用超音波処理装置は、振幅、超音波処理時間、温度などの重要なプロセスパラメータを、日付と時刻のタイムスタンプ付きのCVSファイルとして、内蔵SDカードに自動記録します。再現性と品質管理のためのデータ記録が、かつてないほど簡単になりました！

研究の詳細：PLA2G12A研究におけるEVショットガンプロテオミクス

PLA2G12A研究は、ショットガンプロテオミクスのワークフローでUIP400MTPを使用する具体例を示しています。生物学的な研究課題は、分泌型ホスホリパーゼPLA2G12AがTh17細胞由来の細胞外小胞をどのように修飾し、それによって病原性T細胞の分化にどのような影響を及ぼすかというものでした。著者らは、PLA2G12AがEV膜に作用して1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamineを含むリゾリン脂質を生成すること、およびその下流のLPA2を介したリゾホスファチジン酸シグナル伝達がTh17分化に寄与することを示しました。これらの研究では、脂質シグナル伝達に加えて、RNAやタンパク質含量を含むEVの内包物も調べられ、ショットガンプロテオミクスが特徴付け戦略の重要な構成要素となりました。
EV調製ワークフローでは、エクソソームを除去したウシ胎児血清を含む培地でTh17細胞を培養しました。培養上清をまず遠心分離して細胞を除去し、0.22 µmフィルターでろ過し、限外ろ過/超遠心分離で濃縮し、洗浄し、PBSに再懸濁して、BCAタンパク質アッセイで定量しました。この前段のEV調製により、規定のタンパク質換算量のEV材料をプロテオミクスワークフローに投入できるようにしました。
ショットガンプロテオミクス解析では、著者らはタンパク質換算量5 µgに相当するEVサンプルを用いました。これらのサンプルをPCRチューブ内で乾燥させ、25 µLのメタノールを加えました。その後、マイクロプレート用超音波処理装置UIP400MTPを用いてサンプルを3分間超音波処理しました。超音波処理後、サンプルを4°C、19,000 × gで20分間遠心分離しました。上清20 µLを除去した後、サンプルを乾燥するまで遠心分離しました。次に、50 mM炭酸水素アンモニウム中の100 ng/µLトリプシン/Lys-C溶液4 µLに、超音波処理によってタンパク質を溶解しました。37°Cで300 rpmの振とうを行いながら2時間消化しました。消化物を1.25%トリフルオロ酢酸1 µLで酸性化し、ナノフローLC・高分解能タンデム質量分析に供しました。
このワークフローは、低投入量EVプロテオミクスに有用ないくつかの原則を示しています。まず、投入量をタンパク質換算量で正規化しました。これは、異なる遺伝子型や処理条件のEVを比較する際に重要です。次に、超音波処理前にメタノールを使用し、LC-MS/MSを複雑にする可能性のある界面活性剤系を避けながら、破砕と抽出を支援しました。続いて、超音波処理工程は短時間かつ標準化されており、並列サンプル処理に適合します。さらに、トリプシン/Lys-C消化を極めて少量で行うことで、希釈を抑え、低投入量でのペプチド回収を支援しました。最後に、消化から酸性化およびLC-MS/MSへ直接移行することで、不要な取り扱い工程を最小限に抑えました。
後段のLC-MS/MS法では、Q-Exactive HF Orbitrap質量分析計に接続したナノフロー逆相分離を使用しました。サンプルをC18プレカラムで捕捉し、その後、内径50 µmの分析カラムで200 nL/min、40°Cにて分離しました。グラジエントは低有機溶媒条件から60分間かけて溶媒B 35%まで上げ、その後、高有機溶媒条件での洗浄と再平衡化を行いました。MSデータ取得は、正イオンモードで、高エネルギー衝突解離を伴うデータ非依存型取得によって行いました。DIAの生データファイルは、in silicoで予測したスペクトルライブラリを用い、DIA-NN 1.8で解析しました。