ショットガン・プロテオミクスにおけるマイクロプレートの超音波処理 – アプリケーションノート

ショットガンプロテオミクスでは、複雑な生体試料をLC-MS/MS分析に適したペプチドに変換するために、効率的で再現性の高い試料前処理が不可欠です。UIP400MTPマイクロプレート超音波処理装置は、少量の試料に対して標準化された並列超音波処理を可能にし、マイクロプレートベースのワークフローにおける細胞破砕、抽出、再可溶化の効率向上を支援します。 本アプリケーションノートでは、PLA2G12A/Th17研究で公表された細胞外小胞のワークフローを実験室で検証した事例として用い、UIP400MTPをプロテオミクス試料調製にどのように組み込むことができるかを解説します。

再現性の高いショットガン・プロテオミクスを実現するためのマイクロプレート超音波処理

プロテオミクス研究者にとって、再現性のある試料調製は、高品質なLC-MS/MSデータを得るために不可欠です。UIP400MTPマイクロプレート超音波処理装置は、プレートベースおよび小容量・高スループットのワークフローにおいて、標準化された並列超音波処理を実現します。

特に、以下の分野を扱う研究所にとって有用です：

• 多数のウェルにわたって一貫した処理が必要な大規模なサンプルセット
• 試料の損失やばらつきを最小限に抑える必要がある、入力量が限られている材料
• 細胞外小胞などの脂質を豊富に含む試料
• 効率的な破砕、抽出、または再可溶化を必要とする複雑な生物学的調製物
• 条件や反復実験間で再現性が不可欠な、比較ショットガンプロテオミクス

消化処理の前にマイクロプレートでの超音波処理を組み込むことで、研究者は以下の用途に向けた試料の準備状態を改善することができます：

• タンパク質の抽出および再可溶化
• トリプシン／Lys-Cによる消化
• ナノLC/MS/MSのデータ取得
• 定量的下流プロテオミクス解析

 

プロテオミクス試料調製を安心してスケールアップしましょう！
マイクロプレート超音波処理が、手作業によるばらつきを低減し、試料の破砕効率を向上させ、複雑な生物学的試料を信頼性の高いLC-MS/MS分析に備えるためにどのように役立つかをご紹介します。

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マイクロプレートへの超音波処理には、次のような利点があります：

• プロテオミクス・コア施設
• EV研究施設
• 免疫学および細胞生物学の実験室
• トランスレーショナル研究グループ
• 単一サンプルの前処理から高スループットのワークフローへと規模を拡大するライフサイエンスチーム

細胞外小胞プロテオーム解析のためのハイスループット試料調製

ショットガン・プロテオミクスとは何ですか？

ショットガンプロテオミクスは、全細胞溶解液や組織抽出物から、精製されたオルガネラ、細胞外小胞、さらには少量の臨床検体に至るまで、複雑な生物学的試料を解析するための中心的な手法となっています。 その最大の強みは、タンパク質の消化、高分解能液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析、および計算機によるペプチドからタンパク質への推論を組み合わせた点にあります。しかし、最終的なプロテオームデータセットの品質は、サンプルが質量分析計に到達するはるか以前に決定づけられます。 効率的な試料の破砕、タンパク質の可溶化、干渉物質の除去、再現性のある酵素消化、そして確実なペプチドの回収は、すべてカバレッジの深さと定量的な信頼性にとって決定的な要素となります。
限られた、あるいは貴重なサンプルを扱うプロテオミクス研究者やライフサイエンス研究所にとって、サンプル前処理はしばしばボトルネックとなります。

プロテオミクスにおける細胞外小胞の課題

例えば、細胞外小胞（EV）は、特に取り扱いが難しいサンプルの一種です。これらは膜で囲まれた脂質が豊富なナノスケールの粒子であり、タンパク質の回収率が比較的低く、脂質、塩類、界面活性剤、血清タンパク質、その他のマトリックス成分が混入しやすいという特徴があります。 これらの特性は、消化効率、クロマトグラフィー性能、エレクトロスプレー安定性、およびペプチド同定に悪影響を及ぼす可能性があります。したがって、EVプロテオミクス向けの調製ワークフローは、小胞構造を破壊し、タンパク質荷物を可溶化できる十分な強度を備えつつ、下流工程である酵素消化およびLC-MS/MS分析との互換性を維持できるものでなければなりません。
このような状況において、マイクロプレート対応の超音波処理は、再現性が高く並列化されたサンプル処理を実現する実用的な手法となります。 Hielscher社のマイクロプレート用超音波処理装置モデル「UIP400MTP（400 W）」および「UIP550MTP（550 W）」は、マルチウェルプレートや小容量の容器内の試料を超音波処理するために設計されており、従来のシングルプローブ型超音波処理装置よりも高スループットのワークフローに対応しています。 プロテオミクス研究所にとって、この形式は、手作業によるばらつきを低減し、複数のサンプルの並列処理を改善し、プレートベースのサンプル前処理パイプラインに、より自然に統合できるという点で魅力的です。

模範的なワークフロー

PLA2G12Aが関与するTh17細胞生物学における最近の細胞外小胞プロテオミクス・ワークフローは、マイクロプレート用超音波処理装置UIP400MTPをショットガン・プロテオミクスの試料調製に組み込む方法について、実験室で実証された有用な事例を示しています。 その一連の研究では、メタノール処理、UIP400MTPによる超音波処理、遠心分離、乾燥、トリプシン／Lys-C消化、およびナノフローLC-高分解能タンデムMSを用いて、EVサンプルをプロテオーム解析のために処理した。 この生物学的研究は、最初に bioRxiv のプレプリントとして報告され、その後『Cell Reports』誌に掲載されました。そこでは、プロテオミクス解析により、病原性 T 細胞応答の文脈において、PLA2G12A が EV の貨物タンパク質をどのように変化させるかを解明するのに役立ちました。

マルチウェルプレートソニケーター UIP400MTP

なぜマイクロプレート超音波処理なのか？
UIP400MTPは、少量の試料に対する標準化された並列超音波処理を可能にします。これは、再現性、少量の試料投入、および多試料処理能力が重要となる場合に有用です。

品質管理チェックリスト

• すべてのサンプルにおいて、EVタンパク質相当量の投入量が等しいことを確認してください。
• 無作為化または均衡化されたサンプル処理レイアウトを使用してください。
• メタノールの体積、超音波処理時間、乾燥時間、および消化液の体積を一定に保つこと。
• ペプチドの収量および同定された全タンパク質の量をモニタリングする。
• 未切断率とペプチド長分布を確認してください。
• クロマトグラフィーのピーク形状と保持時間の再現性を確認する。
• キャリーオーバーを監視するために、空白行を含めてください。
• 大規模な研究では、プールされたQCサンプルを使用してください。
• 反復実験の変動係数を評価する。
• PCA または関連する手法を用いて、バッチ効果や外れ値のサンプルを特定する。

議事録作成に関する推奨事項

このワークフローを公開または文書化する際は、EVの投入量、プレート形式、メタノールの体積、UIP400MTPの振幅および超音波処理時間、遠心分離条件、乾燥方法、消化バッファー、酵素濃度、消化時間、酸性化条件、 LC-MS/MSプラットフォーム、取得モード、ソフトウェアバージョン、データベース、FDR閾値、正規化方法、および統計的ワークフローを報告してください。
Hielscher社のすべてのマイクロプレート用超音波処理装置は、振幅、超音波処理時間、温度などの重要なプロセスパラメータを、日付と時刻のスタンプ付きで、内蔵SDカードにCSVファイルとして自動的に記録します。再現性と品質管理のためのデータ記録が、これほど簡単になったことはありません！

研究の詳細：PLA2G12Aに関するEVショットガン・プロテオミクス研究

PLA2G12Aに関する本研究は、ショットガン・プロテオミクス・ワークフローにおけるUIP400MTPの利用例を具体的に示している。本研究の生物学的課題は、分泌型ホスホリパーゼPLA2G12Aが、Th17細胞由来の細胞外小胞をどのように修飾し、それによって病原性T細胞の分化にどのような影響を与えるかという点であった。 著者らは、PLA2G12AがEV膜に作用して1-オレオイル-リゾホスファチジルエタノールアミンを含むリゾホスホリピドを生成すること、およびLPA2を介した下流のリゾホスファチジン酸シグナル伝達がTh17分化に寄与することを明らかにした。 脂質シグナル伝達に加え、これらの研究ではRNAやタンパク質含有量を含むEVの積載物についても検討が行われ、ショットガンプロテオミクスが特性解析戦略の重要な要素となった。
EV調製ワークフローにおいて、Th17細胞は、エクソソームが除去された胎児牛血清を含む培地で培養された。 培養上清をまず遠心分離して細胞を除去し、0.22 µm のフィルターでろ過した後、限外ろ過／超遠心分離によって濃縮し、洗浄して PBS に再懸濁し、BCA タンパク質アッセイにより定量した。 この上流の EV 調製工程により、プロテオミクスワークフローに、定義されたタンパク質相当量の EV 物質を確実に取り込むことができました。
ショットガン・プロテオミクス解析のために、著者らはタンパク質換算で5 µgに相当するEVサンプルを用いた。これらのサンプルはPCRチューブ内で乾燥させ、25 µLのメタノールを加えた。その後、UIP400MTPマイクロプレート超音波処理装置を用いて、3分間超音波処理を行った。 超音波処理後、サンプルを4°C、19,000 × gで20分間遠心分離した。上清20 µLを除去した後、サンプルを乾燥するまで遠心分離した。 その後、50 mM 炭酸水素アンモニウム溶液中に100 ng/µLの濃度で調製したトリプシン/Lys-C溶液4 µL中で、超音波処理によりタンパク質を溶解させた。 37°C、300 rpm で振とうしながら 2 時間消化を行った。消化液を 1 µL の 1.25% トリフルオロ酢酸で酸性化し、ナノフロー LC-高分解能タンデム質量分析にかけた。
このワークフローは、低入力EVプロテオミクスにおけるいくつかの有用な原則を浮き彫りにしている。第一に、入力量はタンパク質相当量で正規化されており、これは異なる遺伝子型や処理条件からのEVを比較する際に重要である。第二に、超音波処理の前にメタノールが使用されており、これは細胞小胞の破壊と抽出を促進すると同時に、LC-MS/MSを複雑にする可能性のある界面活性剤系を回避している。 第三に、超音波処理のステップは短時間で標準化されており、サンプルの並行処理に適しています。第四に、トリプシン／Lys-Cによる消化はごく少量の試料で行われ、希釈を低減し、低入力サンプルからのペプチド回収を促進しました。最後に、消化から酸処理、そしてLC-MS/MSへの直接移行により、不要な操作ステップを最小限に抑えました。
下流工程のLC-MS/MS法では、ナノフロー逆相分離とQ-Exactive HF Orbitrap質量分析計を組み合わせた。 試料はC18プレカラムでトラップされた後、内径50 µmの分析カラムで、流速200 nL/min、40°Cの条件下で分離された。 グラジエントは、低有機溶媒から 35% の溶媒 B まで 60 分かけて行われ、その後、高有機溶媒による洗浄と再平衡が行われました。MS 取得は、高エネルギー衝突解離を伴うデータ非依存型取得（DIA）を用いて、正イオンモードで実行されました。 DIAの生データファイルは、DIA-NN 1.8 および in silico で予測されたスペクトルライブラリを用いて解析した。