ブドウ球菌バイオフィルムの培養および剥離プロトコル

信頼性の高い研究成果を得るには、標準化された方法が不可欠です。ここでは、ブドウ球菌バイオフィルムの培養および剥離プロトコルを紹介します。このプロトコルでは、マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPを使用してサンプル調製を効率化し、96ウェルプレートで効率的かつハイスループットにバイオフィルムを剥離することに重点を置いています。また、ばらつきを最小限に抑えて再現性を確保するために、バイオフィルムの培養、洗浄、可視化における主要な手順も含まれています。

ブドウ球菌バイオフィルムと抗生物質の研究

ブドウ球菌バイオフィルムは、抗生物質や免疫応答に対する抵抗性を持つため、持続性感染症において重要な役割を果たします。バイオフィルムの形成は細菌を保護する環境を作り出し、感染症の治療を困難にします。バイオフィルム研究では、その形成、挙動、抗菌薬に対する感受性の解明に重点が置かれることが多く、実験ワークフローを効率化するためのハイスループットな方法が重視されています。
マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPは、96ウェルプレートからバイオフィルムを迅速かつ効率的に剥離できるため、バイオフィルム研究に大きな利点をもたらします。この装置はすべてのウェルに均一な超音波エネルギーを供給し、ばらつきを最小限に抑えながら一貫した結果を確保します。

ブドウ球菌バイオフィルムの培養および剥離プロトコル

以下では、ブドウ球菌バイオフィルムを培養し、剥離する工程を段階的に説明します。分析手順の一例として、クリスタルバイオレット染色により、培養したバイオマスを分光光度法で定量する方法を紹介します。

ブドウ球菌バイオフィルムの培養

必要な材料：

• 蓋付きの滅菌済み平底96ウェルポリスチレン製マイクロタイタープレート（組織培養処理済み）
• 0.25%グルコースを含むトリプチックソイブロス（TSB）
• バイオセーフティキャビネット

手順：

1. 汚染を最小限に抑えるため、バイオセーフティキャビネット内に無菌の作業環境を整えます。
2. マイクロタイタープレートのウェルに、0.25%グルコースを含むTSBを加えます。グルコースを含まないTSBは一般にバイオフィルム形成を支持しないため、必要な場合にのみ対照として使用してください。
3. 以下の方法で調製した菌株をウェルに接種します：
4. 細菌懸濁液を調製します。超音波処理で懸濁液を均質化するか、23ゲージの針と短時間のボルテックス処理で細胞塊を分散させ、既存の細胞塊が残っていないことを確認します。
5. プレートを蓋で密閉し、バイオフィルム形成に最適な条件（例：37°Cで24時間）で培養します。
6. 信頼性を確保するため、各菌株について三反復（菌株ごとに三ウェル）で実験を行います。
7. 各プレートの六ウェルを陰性対照に割り当てます。96ウェルプレート一枚あたり最大30菌株を試験できます。

バイオフィルムの可視化と洗浄

1. 培養後、バイオフィルムを乱さないように、培地を慎重に廃棄します。
2. 浮遊性細菌を除去するため、各ウェルを生理食塩水で四回洗浄します。
3. ウェルの底面を観察し、バイオフィルムの存在を示す白い斑点があるか確認します。

マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPによるバイオフィルムの剥離

装置のセットアップとパラメータ：

• マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTP
• 運転設定：振幅60%、60秒ON / 30秒OFFのサイクルモード

手順：

1. 洗浄したマイクロタイタープレートをUIP400MTPのプラットフォームに載せます。
2. 推奨設定（振幅60%、60秒ON、30秒OFF）でサンプルを超音波処理します。菌株に応じて設定を調整します。
3. 超音波処理を開始し、バイオフィルムを剥離します。超音波はバイオフィルムのマトリックスを破壊し、付着した細菌を遊離させます。
4. UIP400MTPは、すべてのウェルに均一に超音波が作用することを確保し、一貫した剥離結果をもたらします。

分析手順：クリスタルバイオレット（CV）を用いた、剥離したブドウ球菌バイオフィルムのバイオマス定量

必要な材料：

• 0.1%クリスタルバイオレット（CV）溶液
• 95%エタノールまたは30%酢酸（可溶化用）
• 570 nmで測定可能なマイクロプレートリーダー
• 染色用の滅菌済みマイクロタイタープレート

手順：

1. 染色用プレートの準備：超音波処理したプレートの各ウェルから、剥離したバイオフィルム懸濁液100 µLを、清潔な滅菌済み96ウェルマイクロタイタープレートの対応するウェルに移します。これにより、染色に適した清潔で均一な環境を確保します。
2. 剥離したバイオフィルムの染色：剥離したバイオフィルム懸濁液を含む各ウェルに、0.1%クリスタルバイオレット溶液150 µLを加えます。バイオフィルム懸濁液とクリスタルバイオレットが均一に混ざるよう、穏やかにピペッティングします。
3. インキュベーション：クリスタルバイオレットがバイオマスを効果的に染色できるよう、プレートを室温で15分間インキュベートします。
4. 洗浄：インキュベーション後、バイオマスを乱さないように、ウェル内のクリスタルバイオレット溶液を慎重に廃棄します。未結合の色素を除去するため、各ウェルを滅菌済み生理食塩水で三回洗浄します。
5. 乾燥：プレートを室温または無菌気流フード内で自然乾燥させます。加熱すると結果が変わる可能性があるため、加熱を避けてください。
6. 可溶化：結合したクリスタルバイオレットを可溶化するため、95%エタノール（または、実験室の標準的な手順に応じて30%酢酸）を各ウェルに200 µL加えます。室温で10分間、ピペッティングまたはプレートの振とうにより穏やかに混合します。
7. 測定：マイクロプレートリーダーを使用し、可溶化したクリスタルバイオレット溶液の光学密度（OD）を570 nmで測定します。
8. データ解析：バックグラウンド染色を補正するため、実験ウェルの測定値から陰性対照（TSBを含むが細菌を接種していないウェル）の平均OD570値を差し引きます。データを記録し、解析します。

注：再現性を確保するため、各条件で三反復の実験を行ってください。安全および廃棄に関するプロトコルを遵守し、クリスタルバイオレットとエタノールを適切に取り扱ってください。
 

UIP400MTPの主な利点一覧：

• ハイスループット処理： マルチウェルプレート専用に設計されており、複数のサンプルを同時に処理できます。
• 均一な超音波分布： 各ウェルで同等の超音波強度を確保し、すべてのサンプルで一貫した結果をもたらします。
• あらゆる標準プレートを使用可能： UIP400MTPは、あらゆる標準的なマルチウェルプレート、ペトリ皿、チューブラックに対応できます。高価な専用プレートは不要です！
• 使いやすいインターフェース： セットアップと操作が簡単で、実験室の生産性向上に優れた装置です。プログラム可能な設定と自動化により、工程の標準化が容易になります！