ブドウ球菌バイオフィルム培養・剥離プロトコル

信頼できる研究結果を得るためには、標準化された方法が不可欠です。ここでは、ブドウ球菌バイオフィルムの培養および剥離プロトコルをご覧いただけます。このプロトコールは、96ウェルプレートでの効率的でハイスループットなバイオフィルム剥離のために、UIP400MTPマルチウェルプレートソニケーターを使用した合理的なハイスループット試料調製に焦点を当てています。このプロトコールには、バイオフィルムの培養、洗浄、可視化のための主要な手順も含まれており、ばらつきを最小限に抑え、再現性を確保することに重点を置いています。

ブドウ球菌バイオフィルムと抗生物質研究

ブドウ球菌のバイオフィルムは、抗生物質や免疫反応に対する耐性を持つため、持続性感染症において重要な役割を果たしている。バイオフィルムの形成は細菌に保護環境を提供し、感染症の治療を困難にしている。バイオフィルムの研究は、その形成、挙動、抗菌薬に対する感受性を理解することに重点が置かれることが多く、実験ワークフローを合理化するためのハイスループット手法に重点が置かれている。
UIP400MTPマルチウェルプレートソニケーターは、96ウェルプレートからのバイオフィルムの迅速かつ効率的な剥離を可能にすることで、バイオフィルム研究に大きな利点をもたらします。この装置は、すべてのウェルに均一な超音波エネルギーを供給し、ばらつきを最小限に抑えながら一貫した結果を保証します。

ブドウ球菌バイオフィルムの培養と剥離のプロトコール

以下では、ブドウ球菌バイオフィルムの培養と剥離のプロセスをステップバイステップで説明する。分析ステップの例として、クリスタルバイオレット染色によって培養バイオマスを分光光度法で定量する方法を紹介します。

ブドウ球菌バイオフィルムの培養

必要な材料：

• 滅菌済み平底96ウェルポリスチレン組織培養処理マイクロタイタープレート（蓋付き
• 0.25%グルコース添加トリプシンソイブロス（TSB）
• 生物学的安全キャビネット

ステップ

1. 汚染を最小限に抑えるため、生物学的安全キャビネット内に無菌作業環境を準備する。
2. 0.25%のグルコースを含むTSBをマイクロタイタープレートのウェルに加える。グルコースを含まないTSBは一般的にバイオフィルム形成を支持しないので、必要な場合のみコントロールとして使用する。
3. ウェルに以下のように調製した細菌株を接種する：
4. 超音波処理を用いて懸濁液をホモジナイズするか、23ゲージの注射針でクラスターを破砕し、短時間ボルテックスすることにより、既存の細胞クラスターがないことを確認して、細菌懸濁液を調製する。
5. プレートを蓋で密閉し、バイオフィルム形成に最適な条件下で培養する（例えば、37℃で24時間）。
6. 信頼性を確保するため、各細菌株について3連で実験を行う（1株につき3ウェル）。
7. 陰性コントロール用に1プレートあたり6ウェルを割り当てる。96ウェルプレート1枚につき30株まで検査可能。

バイオフィルムの可視化と洗浄

1. 培養後、バイオフィルムを乱さないように注意深く培地を捨てる。
2. 各ウェルを生理的食塩水で4回洗浄し、浮遊菌を除去する。
3. ウェルの底にバイオフィルムの存在を示す白い斑点がないか検査する。

マルチウェルプレートソニケーターUIP400MTPによるバイオフィルムの剥離

デバイスのセットアップとパラメータ：

• UIP400MTP マルチウェルプレートソニケーター
• 動作設定：振幅60％、サイクルモード60秒ON／30秒OFF

ステップ

1. 洗浄したマイクロタイタープレートをUIP400MTPプラットフォームに置きます。
2. 推奨設定（振幅60％、60秒ON、30秒OFF）でサンプルを超音波処理する。細菌株に合わせて設定を調整する。
3. 超音波処理を開始し、バイオフィルムを剥離する。超音波がバイオフィルムのマトリックスを破壊し、付着した細菌を放出する。
4. UIP400MTPは、すべてのウェルで均一な露光を保証し、一貫した剥離結果を実現します。

分析ステップクリスタルバイオレット（CV）を用いた剥離ブドウ球菌バイオフィルムバイオマスの定量化

必要な材料：

• 00.1%クリスタルバイオレット（CV）溶液
• 95%エタノールまたは30%酢酸（可溶化用）
• 570 nmで読み取り可能なマイクロプレートリーダー
• 染色用滅菌マイクロタイタープレート

ステップ

1. 染色プレートの準備：超音波処理したプレートの各ウェルから、剥離したバイオフィルム懸濁液100 µLを清潔な滅菌済み96ウェルマイクロタイタープレートの対応するウェルに移す。これにより、染色のための透明で均一な環境が確保される。
2. 剥離したバイオフィルムを染色する：150µLの0.1%クリスタルバイオレット溶液を、剥離したバイオフィルム懸濁液を含む各ウェルに加える。バイオフィルム懸濁液とクリスタルバイオレットが均一に混ざるように静かにピペッティングする。
3. インキュベーション：クリスタルバイオレットがバイオマスを効果的に染色できるように、プレートを室温で15分間インキュベートする。
4. 洗浄： インキュベーション後、バイオマスを乱すことなく、ウェルからクリスタルバイオレット溶液を注意深く捨てる。各ウェルを滅菌生理的食塩水で3回洗浄し、結合していない染料を除去する。
5. 乾燥させる：プレートを室温または滅菌済み送風フード下で風乾させる。加熱は結果を変えることがあるので避ける。
6. 可溶化：結合したクリスタルバイオレットを可溶化するために、各ウェルに95％エタノール（標準的なラボのやり方によっては30％酢酸）を200μL加える。室温で10分間、ピペッティングまたはプレートを振って穏やかに混合する。
7. 測定：マイクロプレートリーダーを用いて、可溶化したクリスタルバイオレット溶液の光学密度（OD）を570nmで測定する。
8. データ解析：データ解析：バックグラウンド染色を考慮し、実験ウェルから陰性コントロール（TSBを添加したが細菌を接種していないウェル）の平均OD570値を差し引く。データを記録し、解析する。

注意：再現性を確保するため、各条件について3連で実験を行う。クリスタルバイオレットとエタノールは、安全性と廃棄に関するプロトコールに従い、適切に取り扱う。
 

UIP400MTPの主な利点が一目でわかります：

• ハイスループット処理： マルチウェルプレート専用に設計されており、複数のサンプルを同時に処理できます。
• 均一な超音波分布： ウェル全体の超音波強度が均等になるため、すべてのサンプルで一貫した結果が得られます。
• どの標準プレートでも使用可能： UIP400MTPは標準的なマルチウェルプレート、ペトリ皿、チューブラックに対応します。高価な専用プレートは必要ありません！
• ユーザーフレンドリーなインターフェイス： セットアップと制御が簡単で、ラボの生産性を高める優れたツールです。プログラム可能な設定と自動化により、プロセスの標準化を促進！