UIP400MTPハイスループットソニケーターでセルスクレイピングを置き換える
マルチウェルプレートからの接着細胞株の剥離と抽出は、マルチオミクス解析のためにラボで日常的に行われている作業です。マルチウェルプレート用ソニケーターUIP400MTPを使用したハイスループット細胞剥離は、手作業による細胞掻き取りの代わりに、RNA、総脂質、総極性代謝物の高い収率につながります。新しい方法は、Hielscher UIP400MTPソニケーターとBeckman Coulter i7リキッドハンドリングワークステーションを統合し、RNA、代謝物、脂質抽出のための細胞のハイスループット、再現性、効率的な処理を可能にします。この方法は、様々な細胞タイプや実験条件において優れた再現性と収量を達成することで、従来の手作業による細胞スクレイピング法を凌駕している。
マイクロプレートソニケーターUIP400MTPによる細胞剥離の合理化
接着細胞培養系は、毒性学的研究や生物医学的研究において重要な役割を果たしている。このような状況の中で、Cruchley-Fugeら（2024）は、化学物質の危険性評価にオミックス技術を活用することに焦点を当てたPrecisionToxプロジェクトにおいて、重要な課題に取り組んだ。このプロジェクトでは、多様な化学物質で処理された何千ものサンプルのハイスループット解析を目指した。この要求に応えるため、研究者らはUIP400MTPソニケーターと液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）分析用の確立された二相抽出プロトコルを組み合わせた自動ワークフローを開発した。この研究では、UIP400MTPマルチウェルプレートソニケーターの付着細胞剥離における有効性を、手動スクレイピングや他の従来の方法と比較して評価しています。
あらゆる標準マイクロプレートからの接着細胞培養物の剥離 – UIP400MTPソニケーターでハイスループットで
マルチオミックスの合理化UIP400MTPによる接着細胞自動抽出
バーミンガム大学のLaura Cruchley-Fugeの研究チームは、3つのヒト細胞株を利用した：HepG2（肝臓がん細胞）、HepaRG（分化肝細胞様細胞）、H295R（副腎がん細胞）である。これらの細胞を24ウェルプレートと96ウェルプレートで培養し、アフラトキシンB1やフォルスコリンなどの試験化学物質に暴露した。
実験デザイン：
- 第1段階： UIP400MTPソニケーターの出力設定の最適化と、手動による細胞掻き取りおよび音波水浴との比較。RNA、代謝物、脂質の回収を評価するためにHepG2細胞を採用。
- 第2段階： Beckman Coulter i7 システムを用いた二相抽出ワークフローへの UIP400MTP の統合。HepaRGおよびH295R細胞を用いて検証を行った。
抽出ワークフロー： ワークフローには、マルチウェルプレートでの化学物質の曝露、UIP400MTPを用いた細胞剥離、Blighを用いた二相抽出が含まれる。 & ダイアー（B&D)法を用いた。LC-MS分析はThermo Scientific Orbitrap Exploris 120を用い、親油性化合物および極性化合物について行った。B&脂質定量法のゴールドスタンダードであるD法では、メタノール、クロロホルム、水による2段階の抽出を行い、その後クロロホルム相で脂質を定量する。
UIP400MTPマイクロプレートソニケーターは、マルチウェルプレートやペトリ皿からの接着細胞株の剥離を容易にします。
結果
- 第1段階： 最適な超音波処理条件は60％出力で特定された。
UIP400MTPは、手動スクレイピングやソニックバスと比較して、非常に高い再現性で最高のRNA回収率を示した。
極性代謝物の回収率はどの方法でも一貫していたが、脂質の回収率はUIP400MTPで顕著に優れていた。 - 第2段階： HepaRGおよびH295R細胞を用いた検証では、PCAスコアが緊密にクラスタ化されていることからわかるように、リピドミクスおよびメタボロミクスデータにおいて高い再現性が示された。
アフラトキシンB1処理とフォルスコリン処理はコントロールと効果的に区別され、この方法の感度と信頼性が強調された。
マイクロプレートソニケーター UIP400MTP ハイスループットな細胞剥離のために
“Hielscher UIP400MTP超音波処理装置は、手作業による細胞スクレイピングという「ゴールドスタンダード」に代わる、高品質で再現性の高いアプローチを提供し、RNA、総脂質、総極性代謝物の高い収率をもたらします。” (Cruchley-Fugeら、2024）。
Cruchley-Fugeらは、接着細胞処理におけるUIP400MTPソニケーターの利点を強調している。手作業によるスクレイピングを置き換えることで、この方法は再現性、スループット、収率を向上させ、PrecisionToxのような大規模研究にとって貴重なツールとなります。UIP400MTPを自動ワークフローに組み込むことで、ばらつきを抑えるだけでなく、労働集約的なプロセスを合理化し、高品質のマルチオミクスデータ取得を可能にします。
Cruchley-Fugeら(2024)の研究は、マルチオミクス解析のための接着細胞培養の処理を容易にし、合理化します。UIP400MTPソニケーターを自動ワークフローに統合することで、一貫した効率的なサンプル調製が可能になり、ハイスループットの毒性学的研究に最適です。
UIP400MTPは超音波バスではありません。集中超音波処理用の高強度カップホーンです。この強力な非接触式ソニケーターは、標準ウェルプレートのすべてのウェルに均一な超音波照射を行います。振幅、出力、パルスを正確に制御できます。タイマーと温度プローブが内蔵されているため、安定した結果が得られます。UIP400MTPプレートソニケーターは、ウォーターバスでサンプルを冷却します（外部冷却器はオプション）。
デザイン、製造、コンサルティング – 品質 ドイツ製
Hielscher社の超音波装置は、その最高の品質と設計基準でよく知られています。頑丈で操作が簡単なため、産業設備にスムーズに組み込むことができます。過酷な条件や厳しい環境でも、Hielscherの超音波装置は容易に対応できます。
Hielscher Ultrasonics社はISO認証取得企業であり、最先端技術と使いやすさを特徴とする高性能ソニケーターに特に重点を置いています。もちろん、Hielscherの超音波装置はCEに準拠しており、UL、CSA、RoHsの要件を満たしています。
細胞スクレイピングを必要としないハイスループット細胞剥離 – UIP400MTPソニケーターはラボ作業を容易にします。
文献・参考文献
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
よくある質問
細胞剥離とは何か？
研究における細胞の剥離とは、培養容器や基質の表面か ら接着細胞を分離するプロセスを指す。これは一般的に、分析、再培養、凍結保存な どの下流の用途のために細胞を採取するために行われる。剥離は、細胞のタイプや研究要件に応じて、酵素的方法（例 えばトリプシン）、化学的薬剤（例えばEDTA）、機械的方法（例 えばスクレイピング）、あるいは超音波処理のような物理的技 術を用いて達成することができる。
どのようにして接着細胞を剥離するのか？
ソニケーションを用いた接着細胞の剥離には、集束超音波を適用し、制御された環境内で細胞表面の接着を破壊することが含まれます。具体的には、UIP400MTP マイクロプレートソニケーターは、局所的な機械的振動を発生させ、細胞と培養表面の結合を破壊することでこれを実現します。主な手順は以下の通り：
- 準備だ： 細胞はマルチウェルプレートで培養され、実験デザインの一部として特定の化学物質にさらされることがある。
- ソニケーション： ソニケーターUIP400MTPは、細胞を損傷したり生体分子の完全性を損なったりすることなく効果的に剥離できるよう、最適化された設定（例えば、60％出力）でプログラムされています。
- 温度管理： この装置は、プロセス中の熱による細胞や分子の分解を防ぐため、温度安定性を維持する。
- デタッチメント後 剥離された細胞は、Blighのような下流の抽出プロトコールにかけられる。 & RNA、脂質、代謝物の回収のためのDyer二相法。
この方法は、自動化、再現性、ハイスループット試料を効率的に処理する能力により、手作業によるスクレイピングよりも優れている。
非損傷性細胞剥離とは？
非損傷性細胞剥離とは、細胞の生存能力、完全性、機能性を損なうことなく、接着細胞を基質から分離するプロセスを指す。制御された超音波処理や酵素を含まない溶液のような穏やかな方法を用いて達成される。
細胞を保存するためには、細胞の破壊を避けることが重要である’ 構造的および分子的特性は、マルチオミクス解析、機能的アッセイ、または治療的使用のような正確な下流アプリケーションに不可欠である。損傷した細胞は細胞内内容物を放出し、実験結果を混乱させたり、サンプルの質を損なう可能性がある。
酵素を使わない細胞剥離の利点とは？
酵素を使わない細胞剥離には、細胞表面タンパク質やレセプターの保持、細胞生存能の維持、生体分子への潜在的な酵素的損傷の回避など、いくつかの利点がある。このアプローチは、フローサイトメトリー、プロテオミクス、機能的アッセイなど、酵素による変化がデータの質や実験結果を損なう可能性のある、繊細な下流アプリケーションにとって特に有益である。さらに、酵素を使わない方法は再現性が高く、ハイスループットなワークフローに適応できることが多い。
