抗菌効果評価のためのASTM E2799-22プロトコル
Hielscher UIP400MTPは、ASTM E2799-22プロトコルにおける超音波処理工程を効率化するために設計された、強力で効率的なマルチウェルプレート用超音波処理装置です。UIP400MTPは、マイクロタイタープレート全体に均一な超音波エネルギーを供給することで、細胞を損傷したり、サンプルの完全性を損なったりすることなく、ペグ付き蓋からバイオフィルムを一貫して確実に剥離します。高い処理能力と使いやすい操作により、再現性を高めながら処理時間を大幅に短縮できるため、バイオフィルムの生存性アッセイや抗菌効果試験を行う研究室にとって理想的なソリューションです。
ASTM E2799
ASTM E2799は、特に緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）に焦点を当て、バイオフィルムに対する抗菌剤の有効性を評価するために設計された標準化試験法です。バイオフィルムは、表面に付着し、抗菌処理に対して高い抵抗性を示す複雑な微生物群集であり、医療、産業、環境の各分野で大きな課題となっています。この方法は、最小バイオフィルム根絶濃度（MBEC）アッセイを用いて、実際の状況に即したバイオフィルム条件下で消毒剤を試験するための、信頼性と再現性の高い枠組みを提供します。
96ウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTP によるハイスループットスクリーニング
超音波処理はASTM E2799にどのように貢献するのでしょうか？
超音波処理は、試験表面からのバイオフィルムの剥離を促進し、処理後の微生物の生存性を正確に評価できるようにすることで、ASTM E2799プロトコルにおいて重要な役割を果たします。このプロトコルでは、制御された超音波エネルギーを用いることで、細胞を損傷することなくバイオフィルムを効率的かつ一貫して破壊し、精度と再現性の高い結果を得ることができます。このため、ASTM E2799は、バイオフィルム研究を進め、効果的な抗菌戦略を開発するために不可欠なツールとなっています。
ASTM E2799-22に準拠したMBECアッセイの実施方法
ASTM E2799-22プロトコルは、バイオフィルムに対する抗菌剤の有効性を評価する手順を示しています。Hielscher UIP400MTPマイクロタイタープレート用超音波処理装置を使用する場合、この高度な超音波処理法をバイオフィルムの剥離に組み込むようにプロトコルを調整できます。以下に、マイクロプレート用超音波処理装置UIP400MTPの使用に合わせた手順を説明します。
- バイオフィルムの調製
取り外し可能なペグ付き蓋を備えた滅菌済み96ウェルマイクロタイタープレートを用意します。
適切な増殖培地中の標準化された細菌懸濁液を各ウェルに接種します。
ペグが細菌懸濁液に完全に浸かるように、ペグ付き蓋をプレートに取り付けます。
ペグ上にバイオフィルムが形成されるよう、制御された条件（温度や時間など）でプレートを培養します。 - 抗菌剤による処理
バイオフィルムの形成後、培地を、試験対象の抗菌剤を異なる濃度で含む新鮮な培地に交換します。
ペグ付き蓋を再度取り付け、試験設計で指定された条件下で培養します。 - バイオフィルム剥離の準備
処理後、ペグ付き蓋を滅菌済みの洗浄液に浸してすすぎ、残留抗菌剤と、緩く付着した浮遊細胞を除去します。 - UIP400MTP超音波処理装置によるバイオフィルムの剥離
回収用培地（中和ブロスなど）を入れた新しい96ウェルマイクロタイタープレートを用意します。
ペグ付き蓋を回収用培地の入ったプレートのウェルに挿入して、バイオフィルムを剥離します。
蓋とプレートが正しく整列していることを確認し、プレートをUIP400MTP超音波処理装置に入れます。
細胞溶解を起こさずに一貫したバイオフィルム剥離を行うため、超音波処理装置の振幅を70%–80%に設定し、サイクルモードで3–4分間超音波処理します。 - バイオフィルムの生存性評価
超音波処理後、剥離したバイオフィルム細胞を含む回収用培地を、以下のような標準的な微生物学的手法または分析手法で処理します。- コロニー形成単位（CFU）の計数：段階希釈を行い、寒天培地に播種して生細胞数を測定します。
- 光学密度（OD）の測定：分光光度分析を用いて細胞密度を評価します。
- 蛍光に基づく生存性アッセイ：蛍光色素を用いて生細胞と死細胞を定量します。
- データ解析
処理済みと未処理のバイオフィルムの生存性データを比較し、抗菌剤の有効性を判定します。
生存しているバイオフィルム細胞を除去するために必要な濃度に基づき、最小バイオフィルム根絶濃度（MBEC）を算出します。 - 品質管理
UIP400MTPを定期的に校正し、バイオフィルムの剥離過程で著しい細胞溶解や細胞破壊が生じないことを確認することで、一貫した超音波処理条件を確保します。
結果の妥当性を確認するため、未処理のバイオフィルムや培地のみのブランクなど、適切な対照を含めます。
ピン上に形成されたバイオフィルム細胞は、細胞回収用の新鮮な培養培地を入れた96ウェルプレート内で、5 minの超音波処理（Hielscher Ultrasound Technology、Teltow、Germany、UIP250MTP）により剥離されました。
（画像および研究：©de Oliveira et al., 2016）
UIP400MTPをASTM E2799-22のワークフローに組み込むことで、バイオフィルムの剥離工程が、一貫性、効率性、ハイスループット用途に向けて最適化されます。
文献／参考資料
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- ASTM E2799-22 Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosa Biofilm using the MBEC Assay
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
よくある質問
ASTM E2799とは何ですか？
ASTM E2799は、MBECアッセイを用いて緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のバイオフィルムに対する消毒剤の有効性を試験するために、ASTM Internationalが制定した標準試験法です。この方法は、バイオフィルムの形成、抗菌効果、材料表面との相互作用の評価に広く使用されており、バイオフィルム関連研究における標準化された比較を可能にします。
ASTM E2799-22とASTM E2799-11、ASTM E2799-12、ASTM E2799-17の違いは何ですか？
ASTM E2799は、MBEC（最小バイオフィルム根絶濃度）アッセイを用いて、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のバイオフィルムに対する消毒剤の有効性を評価する標準化試験法です。この方法は、精度と適用性を高めるために数回改訂されています。
- ASTM E2799-11：この規格の初版であり、MBECアッセイを用いてP. aeruginosaのバイオフィルムに対する消毒剤の有効性を評価するための基本的な手順を確立しました。
- ASTM E2799-12：この改訂では、明確さを向上させ、2011年版で確認された曖昧さを解消するため、軽微な技術的更新が加えられました。
- ASTM E2799-17：この更新では、再現性を高め、バイオフィルム研究の進歩との整合性を向上させることを目的に、バイオフィルムの培養工程、処理の適用、中和手順の調整を含む、より大幅な変更がプロトコルに加えられました。
- ASTM E2799-22：最新の改訂は、バイオフィルム研究における最新の科学的知見と技術的進歩を反映しています。バイオフィルムの増殖、処理、分析に関する改良された方法が含まれており、現在の消毒剤の有効性評価に対して、この試験法が適切かつ有効であり続けることを保証します。
ASTM E2799の各改訂は、この方法の信頼性、再現性、適切性を向上させるために行われており、バイオフィルム研究分野の科学的・技術的進歩に対応し続けられるようにしています。
MBECアッセイとMBICアッセイの違いは何ですか？
MBEC（最小バイオフィルム根絶濃度）アッセイとMBIC（最小バイオフィルム形成阻害濃度）アッセイの主な違いは、評価の焦点にあります。
MBECアッセイは あらかじめ形成されたバイオフィルムを完全に根絶するために必要な抗菌剤の最低濃度を測定し、バイオフィルム内部の微生物を死滅させる物質の能力を評価します。
MBICアッセイは バイオフィルムの初期形成を防ぐ抗菌剤の最低濃度を決定し、バイオフィルムの発達を阻害する能力を評価します。
どちらのアッセイも、バイオフィルムに対する抗菌剤の有効性を理解するうえで重要ですが、バイオフィルムのライフサイクルの異なる段階を対象としています。
MBICアッセイでのバイオフィルム剥離に、UIP400MTPマイクロプレート用超音波処理装置がどのように使用されるかをご覧ください！
頑固なバイオフィルムを破壊する新しいマイクロプレート用超音波処理装置
Hielscher Ultrasonicsは、 ラボ用 から 産業用サイズまでの高性能超音波ホモジナイザーを製造しています。