96ウェルプレートソニケーターUIP400MTPを用いたMBECアッセイプロトコル
MBECアッセイは、ペグ蓋に形成されたバイオフィルムを除去するために必要な抗菌剤の濃度を決定するために使用される。バイオフィルムの生存率を評価するには、まず96ウェルプレートのペグ蓋からバイオフィルムを剥離する必要がある。ソニケーションは、この剥離のための最も確実で効率的な方法である。マルチウェルプレートソニケーターUIP400MTPは、アッセイプレートを最大限の効率と利便性で処理するために特別に設計されており、ハイスループットのMBECアッセイを合理化し、加速します。
バイオフィルム剥離のための超音波処理
ソニケーションは、最小バイオフィルム除去濃度（MBEC）アッセイにおいて重要なステップであり、表面に付着したバイオフィルム細胞の効果的な剥離を可能にする。バイオフィルムは本来、細胞外マトリックスに包まれた微生物の構造化された群集であり、そのため浮遊性細胞と比較して抗菌剤に対する耐性が著しく高い。MBECアッセイでは、超音波処理により制御されたキャビテーションを発生させ、バイオフィルムのマトリックスを破壊し、埋没細胞を懸濁液中に放出する。このステップにより、バイオフィルム細胞が回収培地中に均一に分散され、プレーティング、希釈、または分光光度法による正確な生存率評価が容易になります。バイオフィルムを適切に剥離しないと、残存するマトリックス成分が細胞を遮蔽し、抗菌効果の過小評価につながる可能性がある。したがって、超音波処理は、試験薬剤の真の除菌能力を反映する、信頼性と再現性のあるMBEC値を得るために不可欠である。マルチウェルプレートソニケーターUIP400MTPは、アッセイプレートでのハイスループットなサンプル調製を容易にします。
マルチウェルプレートソニケーター UIP400MTP は、アッセイプレートでのハイスループットなサンプル調製を容易にする。
最小バイオフィルム除去濃度（MBEC）アッセイプロトコル
ステップ1：バイオフィルム形成
- 細菌懸濁液を調製する：
適切な培地で細菌を対数相まで増殖させる。
細菌培養液を所定の光学密度（例えば、OD600～0.1）まで希釈する。 - 96ウェルプレートに接種する：
標準96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに細菌懸濁液（例えば、150～200μL）を加える。 - ペグの蓋を取り付ける：
ペグ表面にバイオフィルムが形成されるように、接種したプレートにペグの蓋をする。 - プレートをインキュベートする：
バイオフィルムの成長を促進するため、セットアップを適切な温度（37℃など）で24～48時間、振盪せずにインキュベートする。
ステップ2：抗菌剤による治療
- 抗菌溶液を準備する：
新鮮な培地で様々な濃度の抗菌剤を調製する。
バイオフィルムを抗菌剤にさらす：
細菌培養からペグふたを外し、滅菌生理食塩水またはPBSですすいで浮遊細胞を除去する。
ペグ蓋を抗菌液の入った新しい96ウェルプレートにセットする。 - プレートをインキュベートする：
決められた期間（例えば24時間）インキュベートし、抗菌薬に曝露させる。
マルチウェルプレートソニケーター UIP400MTP ハイスループット試料調製用
ステップ3：96ウェルプレートソニケーターUIP400MTPによる超音波処理
超音波処理ステップは、ペグ蓋からバイオフィルムを剥離して生存率を評価するために重要です。UIP400MTPソニケーターの場合は、以下の手順に従ってください：
- セットアップの準備
新しい96ウェルプレートに回収培地（例えば、中和ブロスまたは新しい増殖培地）を各ウェルに入れる。 - ペグの蓋を移す：
抗菌処理プレートからペグ蓋を外す。
ペグの蓋を滅菌生理食塩水またはPBSですすぎ、残留抗菌剤を除去する。 - プレートとソニケーターの位置を決める：
ペグの蓋を回収培地プレートに取り付ける。
回収培地プレートをUIP400MTPソニケータープラットフォームに置き、プレートが中央に安定していることを確認します。 - 超音波処理のパラメーターを調整する：
UIP400MTPで超音波処理パラメータを設定する（設定はバイオフィルムに合わせて調整可能）：
アンプリチュード：70～100％。
超音波処理時間：サイクルモードで1～3分（バイオフィルムの堅牢性により調整）。 - ソニッケイト
超音波処理を開始する。超音波振動により、ペグ表面から回収培地にバイオフィルムが剥がれ落ちる。 - プロセスを監視する：
ウェル内のサンプル温度をモニターするには、プラグ可能な温度センサーを使用します。UIP400MTPは冷却のためにラボ用チラーに接続することができます。 - ソニケーション後の処理：
回収培地（現在は剥離したバイオフィルムを含む）を直ちに新しい滅菌プレートに移し、下流の分析に使用する。
(A)2%グルコースを含むTSBを含むプレートで、バイオフィルム形成、細胞回収、および
MICとMBCBの測定；（B）ブドウ球菌バイオフィルムの形成のためのピン付き蓋。
ピン上に形成されたバイオフィルム細胞は、細胞の回収のため、新鮮な培養液を入れた96ウェルプレート中で超音波処理（Hielscher Ultrasound Technology）により5分間剥離された。
(写真と研究：©de Oliveira et al, 2016）
ステップ4：実行可能性評価
剥離したバイオフィルムをプレートで培養する：
- 回収培地を連続希釈し、寒天培地にプレートしてコロニー形成単位（CFU）を計数する。
あるいは、比色法または蛍光法ベースの生存率アッセイを用いる。 - 過去最高の成績：
検出可能なバイオフィルムの生存能力を根絶した抗菌薬の最低濃度としてMBECを決定する。
デザイン、製造、コンサルティング – 品質 ドイツ製
Hielscher社の超音波装置は、その最高の品質と設計基準でよく知られています。頑丈で操作が簡単なため、産業設備にスムーズに組み込むことができます。過酷な条件や厳しい環境でも、Hielscherの超音波発生装置は容易に対応できます。
Hielscher Ultrasonics社は、ISO認証取得企業であり、最先端の技術と使いやすさを特徴とする高性能超音波振動子に特に重点を置いています。もちろん、Hielscherの超音波装置はCEに準拠しており、UL、CSA、RoHsの要件を満たしています。
96ウェルプレートおよびアッセイプレートでのサンプル前処理を合理化 マルチウェルプレートソニケーターUIP400MTPを使用して
文献・参考文献
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
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よくある質問
MBECアッセイとは何ですか？
最小バイオフィルム根絶濃度（MBEC）アッセイは、バイオフィルム関連細菌を根絶するために必要な抗菌剤の最低濃度を決定するために使用される標準化された方法である。これは、特殊な表面上でバイオフィルムを増殖させ、異なる抗菌剤濃度に曝露し、通常超音波処理によってバイオフィルムを破壊した後に剥離した細胞の生存率を評価し、処理の有効性を評価するものである。
MBICとMBECの違いは？
最小バイオフィルム抑制濃度（MBIC）はバイオフィルムの形成を防ぐために必要な抗菌薬の最低濃度であり、最小バイオフィルム根絶濃度（MBEC）は確立したバイオフィルムを根絶するために必要な最低濃度である。MBICはバイオフィルムの予防に重点を置き、MBECは成熟したバイオフィルムに対する治療効果を評価する。
MBECアッセイにはどのようなプレートが一般的ですか？
MBECアッセイに一般的に使用されるマイクロタイタープレートは、一般的にポリスチレンまたはポリプロピレン製の96ウェルプレートである。これらの素材は、バイオフィルム形成に適した表面を提供し、アッセイ中に試験される抗菌剤に対して化学的に耐性がある。ポリスチレンプレートは、光学的に透明であるため、分光光度法や蛍光法などの下流の分析に有利であり、広く好まれている。これらのプレートのデザインには、取り外し可能なペグ蓋が含まれており、これは、増殖培地を含むウェルに浸されたペグ上にバイオフィルムが形成されるため、アッセイには不可欠である。MBECアッセイプロトコルに準拠したプレートなど、標準化されたプレートは、再現性とUIP400MTPソニケーターやその他の処理装置との互換性を確保するために特別に設計されています。
PEGリッドプレートとは何ですか？
PEGリッドプレートは、各ウェルに伸びる小さなポリエチレングリコール（PEG）ペグまたはピンが蓋に装備された特殊なマルチウェルプレートシステムである。これらのペグは、制御された条件下で微生物バイオフィルム形成のための表面を提供し、実際のバイオフィルム増殖を模倣する。この設計により、ウェルに増殖培地や抗菌剤を入れたまま、ペグ上にバイオフィルムを発生させることができ、MBECやMBICアッセイなどの処理に対するバイオフィルム感受性のハイスループット試験が可能になる。
