96ウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPを使用したMBECアッセイのプロトコル
MBECアッセイは、ペグ付き蓋に形成されたバイオフィルムを除去するために必要な抗菌剤の濃度を測定するために用いられます。バイオフィルムの生存性を評価するには、まず96ウェルプレートのペグ付き蓋からバイオフィルムを剥離する必要があります。超音波処理は、この剥離を行うための最も信頼性が高く、効率的な方法です。マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPは、アッセイプレートを最大限の効率と利便性で処理するために特別に設計されており、ハイスループットMBECアッセイを効率化し、加速します。
バイオフィルム剥離のための超音波処理
超音波処理は、最小バイオフィルム根絶濃度（MBEC）アッセイにおける重要な工程であり、表面に付着したバイオフィルム細胞を効果的に剥離します。バイオフィルムは、本質的に細胞外マトリックスに包まれた構造化された微生物群集であり、そのため浮遊細胞に比べて抗菌剤に対する抵抗性が著しく高くなっています。MBECアッセイでは、超音波処理によって超音波を用いて制御されたキャビテーションを発生させ、バイオフィルムのマトリックスを破壊し、内部の細胞を懸濁液中に放出します。この工程により、バイオフィルム細胞が回収培地中に均一に分散し、プレーティング、希釈、または分光光度法による正確な生存性評価が容易になります。バイオフィルムを適切に剥離しないと、残存するマトリックス成分が細胞を保護し、抗菌効果を過小評価する可能性があります。したがって、試験した薬剤の真の根絶能力を反映する、信頼性と再現性のあるMBEC値を得るには、超音波処理が不可欠です。マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPを使用すると、アッセイプレートでのハイスループットなサンプル調製を容易に行えます。
マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPは アッセイプレートでのハイスループットなサンプル調製を容易にします。
最小バイオフィルム根絶濃度（MBEC）アッセイのプロトコル
ステップ1：バイオフィルムの形成
- 細菌懸濁液の調製：
適切な培地で細菌を対数増殖期まで培養します。
細菌培養液を規定の光学濃度（例：OD600 ~0.1）に希釈します。 - 96ウェルプレートへの接種：
標準的な96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに細菌懸濁液（例：150–200 µL）を加えます。 - ペグ付き蓋の取り付け：
接種したプレートにペグ付き蓋を載せ、ペグ表面にバイオフィルムが形成されるようにします。 - プレートのインキュベーション：
バイオフィルムの増殖を促進するため、適切な温度（例：37°C）で24–48時間、振とうせずにインキュベートします。
ステップ2：抗菌剤による処理
- 抗菌剤溶液の調製：
新鮮な培地を用いて、濃度の異なる一連の抗菌剤溶液を調製します。
バイオフィルムの抗菌剤への曝露：
細菌培養液からペグ付き蓋を取り外し、滅菌生理食塩水またはPBSですすいで浮遊細胞を除去します。
抗菌剤溶液を入れた新しい96ウェルプレートにペグ付き蓋を載せます。 - プレートのインキュベーション：
抗菌剤に曝露するため、規定の期間（例：24時間）インキュベートします。
マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTP によるハイスループットなサンプル調製
ステップ3：96ウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPによる超音波処理
超音波処理工程は、生存性を評価するためにペグ付き蓋からバイオフィルムを剥離するうえで極めて重要です。超音波処理装置UIP400MTPでは、以下の手順に従ってください。
- 準備：
新しい96ウェルプレートの各ウェルに回収培地（例：中和ブロスまたは新鮮な増殖培地）を入れます。 - ペグ付き蓋の移動：
抗菌剤処理用プレートからペグ付き蓋を取り外します。
ペグ付き蓋を滅菌生理食塩水またはPBSですすいで、残留抗菌剤を除去します。 - プレートと超音波処理装置の配置：
回収培地を入れたプレートにペグ付き蓋を取り付けます。
回収培地を入れたプレートを超音波処理装置UIP400MTPのプラットフォームに載せ、プレートが中央に配置され、安定していることを確認します。 - 超音波処理パラメータの調整：
UIP400MTPで超音波処理パラメータを設定します（設定はバイオフィルムに合わせて調整できます）。
振幅：70–100%。
超音波処理時間：サイクルモードで1–3分（バイオフィルムの強固さに応じて調整）。 - 超音波処理：
超音波処理を開始します。超音波振動によって、ペグ表面のバイオフィルムが剥離し、回収培地中に放出されます。 - 処理の監視：
接続式温度センサーを使用して、ウェル内のサンプル温度を監視します。UIP400MTPは、冷却のために実験室用チラーに接続できます。 - 超音波処理後の取り扱い：
その後の分析のため、回収培地（この時点では剥離したバイオフィルムを含む）を直ちに新しい滅菌プレートに移します。
（A）2%グルコースを含むTSB入りで、バイオフィルム形成、細胞回収、および
MICとMBCBの測定に用いたプレート；（B）ブドウ球菌のバイオフィルム形成用のピン付き蓋。MICとMBCBの測定；（B）ブドウ球菌のバイオフィルム形成用のピン付き蓋。
ピン上に形成されたバイオフィルム細胞は、細胞回収用の新鮮な培養培地を入れた96ウェルプレート内で、5 minの超音波処理（Hielscher Ultrasound Technology）によって剥離されました。
（画像および研究：©de Oliveira et al., 2016）
ステップ4：生存性の評価
剥離したバイオフィルムのプレーティングと培養：
- 回収培地を段階希釈し、寒天培地に播種してコロニー形成単位（CFU）を計数します。
または、比色法もしくは蛍光法に基づく生存性アッセイを使用します。 - 結果の記録：
検出可能なバイオフィルムの生存性を根絶した抗菌剤の最低濃度をMBECとして決定します。
設計、製造、コンサルティング – ドイツ製の品質
Hielscherの超音波処理装置は、最高の品質と設計基準で広く知られています。堅牢性と操作の容易さにより、当社の超音波処理装置を産業施設に円滑に組み込むことができます。Hielscherの超音波処理装置は、過酷な条件や要求の厳しい環境にも容易に対応します。
Hielscher UltrasonicsはISO認証企業であり、最先端の技術と使いやすさを備えた高性能超音波処理装置に特に重点を置いています。もちろん、Hielscherの超音波処理装置はCEに適合し、UL、CSA、RoHsの要件を満たしています。
96ウェルプレートやアッセイプレートでのサンプル調製を効率化するために、 マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPを使用
文献 / 参考資料
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
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- Microplate Sonicator Validated in Peer-Reviewed Proteomics Study
よくある質問
MBECアッセイとは何ですか？
最小バイオフィルム根絶濃度（MBEC）アッセイは、バイオフィルムに関連する細菌を根絶するために必要な抗菌剤の最低濃度を測定する、標準化された方法です。専用の表面でバイオフィルムを増殖させ、異なる濃度の抗菌剤に曝露し、通常は超音波処理によってバイオフィルムを破壊した後、剥離した細胞の生存性を評価することで、処理の有効性を調べます。
MBICとMBECの違いは何ですか？
最小バイオフィルム形成阻止濃度（MBIC）は、バイオフィルムの形成を防ぐために必要な抗菌剤の最低濃度であり、最小バイオフィルム根絶濃度（MBEC）は、すでに形成されたバイオフィルムを根絶するために必要な最低濃度です。MBICはバイオフィルムの形成予防に焦点を当て、MBECは成熟したバイオフィルムに対する処理の有効性を評価します。
MBECアッセイには一般的にどのようなプレートが使用されますか？
MBECアッセイで一般的に使用されるマイクロタイタープレートは、通常、ポリスチレン製またはポリプロピレン製の96ウェルプレートです。これらの材料はバイオフィルム形成に適した表面を提供し、アッセイ中に試験する抗菌剤に対して耐薬品性を備えています。ポリスチレン製プレートは光学的透明性に優れており、その後の分光光度測定や蛍光測定などの分析に有利なため、広く選ばれています。これらのプレートには取り外し可能なペグ付き蓋が設けられています。増殖培地を入れたウェルに浸されたペグ上にバイオフィルムが形成されるため、この蓋はアッセイに不可欠です。MBECアッセイのプロトコルに適合するプレートなどの標準化されたプレートは、再現性と、超音波処理装置UIP400MTPまたはその他の処理装置との適合性を確保するために特別に設計されています。
PEG付き蓋のプレートとは何ですか？
PEG付き蓋のプレートは、各ウェル内へ伸びる小さなポリエチレングリコール（PEG）製のペグまたはピンを蓋に備えた、専用のマルチウェルプレートシステムです。これらのペグは、制御された条件下で微生物のバイオフィルムが形成される表面を提供し、実環境でのバイオフィルムの増殖を模倣します。この設計では、ウェルに増殖培地または抗菌剤を入れた状態でペグ上にバイオフィルムを発達させることができ、MBECやMBICアッセイなどにおいて、処理に対するバイオフィルムの感受性をハイスループットで試験できます。
Hielscher Ultrasonicsは、 実験室用 から 産業用サイズまでの高性能超音波ホモジナイザーを製造しています。