最小発育阻止濃度（MIC）アッセイのプロトコル
バイオフィルムを対象とした最小発育阻止濃度（MIC）アッセイは、保護作用のある細胞外マトリックスによって抵抗性が高まっているバイオフィルム関連微生物に対する抗菌剤の有効性を評価するための不可欠な方法です。このアッセイでは、生存性を正確に評価するために、バイオフィルム構造を剥離して内部の細胞を放出させる工程が極めて重要です。マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPは、集束超音波によって制御されたキャビテーションを発生させ、バイオフィルムの細胞を効率的に剥離し、均一な懸濁液に分散させることで、この工程を容易にします。この精密で再現性のあるバイオフィルム破砕によって、MICアッセイの信頼性と処理能力が向上するため、UIP400MTPはバイオフィルム研究の進展に不可欠なツールとなります。
MICアッセイで超音波処理を使用する理由は？
- 正確で再現性のあるデータ： マトリックスによる遮蔽を解消する均一な細胞懸濁液を得ることで、コロニー数と光学密度の測定値に抗菌剤の有効性が確実に反映されます。
- 高い処理能力による効率化： 96ウェルプレート全体をわずか1–3分で同時に処理し、時間がかかり結果にばらつきのある手作業での掻き取りを、効率的なワークフローに置き換えます。
- 細胞の生存性を維持： 掻き取りによる物理的損傷を与えずに内部の細胞を穏やかに剥離し、より高い生存率を維持することで、信頼性の高いMIC/MBECの算出が可能になります。
- 交差汚染リスクゼロ： 非接触式のカップ型ホーン設計により、プローブが個々のサンプルやウェルに触れることなく、すべてのウェルを均一に処理できます。
- 規格に対応した適合性： ASTM E2799-22などの検証済み業界プロトコルに手法を合わせることで、規制対応や論文発表に用いるデータの信頼性を高めます。
- 信頼できる薬剤・治療法のスクリーニング： 信頼できる感受性試験結果に基づいて、抗菌効果、耐性プロファイリング、治療法の開発について、より的確な判断を行えます。
細胞の生存性を維持しながら、ラボの処理量を増やしましょう。ご使用のマイクロプレートの種類をお知らせください。高い処理能力を備えた超音波処理による効率的なバイオフィルム剥離と細胞分散のための推奨事項をご案内します。
UIP400MTPマイクロプレート用超音波処理装置 により、MICおよびMBECアッセイでバイオフィルムの剥離を精密に制御できます。
バイオフィルム剥離のための超音波処理
バイオフィルムを対象としたMICアッセイでは、通常、プレーティング、コロニー計数、光学密度測定などの方法を用いて、細菌の生存性または発育阻止を測定します。バイオフィルム関連微生物の抗菌剤感受性を評価する際、超音波処理はバイオフィルムを対象としたMICアッセイの極めて重要な工程です。その主な役割は、正確な分析のために、バイオフィルムのマトリックス内に埋め込まれた細胞を剥離し、均一な懸濁液に分散させることです。
バイオフィルムは浮遊細胞に比べて抗菌剤に対する抵抗性が著しく高いため、正確な分析には適切な剥離が極めて重要です。この工程では、超音波が制御されたキャビテーションを発生させ、バイオフィルムのマトリックスを破砕し、内部の細胞を回収培地中に放出して均一な懸濁液にします。この工程により、プレーティング、希釈、コロニー計数などの方法を用いて、バイオフィルムから分散させた細胞の生存性を精密に評価できます。超音波処理による適切なバイオフィルム破砕は、残存するマトリックス成分による細胞の遮蔽を防ぎます。この遮蔽が残ると、抗菌活性を過小評価するおそれがあります。マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPは、この目的に特に適しており、精密で再現性のある超音波処理条件を提供して、信頼性と処理能力の高いアッセイプレートの調製を可能にします。
バイオフィルムを対象とした最小発育阻止濃度アッセイに超音波処理が必要な理由
生存性の測定と細胞計数には、個々の細胞を完全かつ確実に剥離・分散させる必要があります。UIP400MTPは、損傷を与えずに均一なバイオフィルム剥離と細胞分散を促進し、堅牢なアッセイ結果をもたらします。
- バイオフィルムの複雑性： バイオフィルムは、細胞外高分子物質（EPS）のマトリックスに包まれた構造化された微生物群集です。このマトリックスが微生物を保護し、抗菌剤に対する抵抗性を高めます。
- 均一な分散： バイオフィルム内の細胞の生存性や抗菌剤に対する感受性を正確に測定するには、まずバイオフィルムを剥離・破砕して、均質な懸濁液にする必要があります。
標準的なMICは浮遊細胞の耐性を測定しますが、Biofilm-MICおよびMBECアッセイでは、適切なベースラインとなる細胞を確実に回収するために超音波処理が不可欠です。
バイオフィルムを対象とした最小発育阻止濃度アッセイのプロトコル
最小発育阻止濃度（MIC）アッセイは、微生物の目視可能な発育を阻止するために必要な抗菌剤の最低濃度を測定します。このプロトコルは、バイオフィルム関連微生物を対象としており、マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPを用いてバイオフィルムを破砕します。
ステップ1：細菌接種液の調製
- 細菌懸濁液を調製する：
適切な培地で細菌を対数増殖期の中期まで培養します。
培養液を希釈し、標準化された細胞密度（例：0.5 McFarland標準、またはOD600 ~0.1）に調整します。 - 抗菌剤溶液を調製する：
適切な培地で抗菌剤を希釈し、一連の濃度の溶液を作製します（例：倍々の段階希釈）。 - 96ウェルプレートに分注する：
標準的な96ウェルプレートの各ウェルに抗菌剤溶液を加え、各ウェルの最終液量を~150–200 µLにします。
発育対照（抗菌剤なし）および無菌性対照（細菌接種液なし）を含めます。
ステップ2：ペグ付き蓋でのバイオフィルム形成
- ペグ付き蓋を取り付ける：
接種済みのウェルに専用のペグ付き蓋を取り付け、ペグが細菌懸濁液に完全に浸るようにします。 - プレートをインキュベートする：
適切な温度（例：37°C）で所定の時間（例：24時間）、静置条件下でインキュベートし、ペグ上にバイオフィルムを形成させます。 - ペグをすすぐ：
ペグ付き蓋を細菌懸濁液から取り出し、滅菌生理食塩水またはPBSで穏やかにすすいで、緩く付着している浮遊細胞を除去します。 - 抗菌剤に曝露する：
先に調製した抗菌剤の希釈液を入れた新しい96ウェルプレートに、ペグ付き蓋を移します。
所定の時間（例：24時間）、静置条件下でインキュベートし、抗菌剤をバイオフィルムに作用させます。
ステップ3：抗菌剤への曝露
マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTP による高い処理能力でのサンプル調製
ステップ4：マイクロプレート用超音波処理装置UIP400MTPによる超音波処理
生存性を評価するためにペグ付き蓋からバイオフィルムを剥離するには、超音波処理工程が極めて重要です。UIP400MTP超音波処理装置では、以下の手順に従ってください：
- 処理の準備をする：
新しい96ウェルプレートの各ウェルに回収培地（例：中和ブロスまたは滅菌済みの増殖培地）を入れます。 - ペグ付き蓋を移す：
抗菌剤処理用プレートからペグ付き蓋を取り外します。
ペグ付き蓋を滅菌生理食塩水またはPBSですすぎ、残留抗菌剤を除去します。 - プレートを超音波処理装置に配置する：
回収培地を入れたプレートにペグ付き蓋を取り付けます。
回収培地を入れたプレートをUIP400MTP超音波処理装置に配置し、取扱説明書の記載どおりに、プレートが中央に安定して置かれていることを確認します。 - 超音波処理パラメータを調整する：
UIP400MTPで超音波処理パラメータを設定します（設定はバイオフィルムに合わせて調整できます）：
振幅：70–100%。
超音波処理時間：サイクルモードで1–3分（バイオフィルムの構造に応じて調整）。 - 超音波処理を行う：
超音波処理を開始します。超音波がバイオフィルムのマトリックスを破砕し、細胞を剥離して回収培地中に放出します。 - 処理を監視する：
接続式温度センサーを用いて、ウェル内のサンプル温度を監視します。UIP400MTPは、冷却のためにラボ用チラーに接続できます。 - 超音波処理後の取り扱い：
剥離したバイオフィルムを含む回収培地を、直ちに新しい滅菌プレートに移し、その後の分析に用います。
（A）バイオフィルム形成、細胞回収、MICおよびMBECの測定に使用した、2%グルコース添加TSBを含むプレート；（B）ブドウ球菌のバイオフィルム形成用ピン付き蓋。
ピン上に形成されたバイオフィルム細胞は、細胞回収用の新しい培養培地を入れた96ウェルプレート内で、5 minの超音波処理（Hielscher Ultrasound Technology）によって剥離されました。
（画像および研究：©de Oliveira et al., 2016）
ステップ4：生存性の評価
剥離したバイオフィルムをプレーティングして培養する：
- 回収培地を段階希釈し、寒天培地にプレーティングして、コロニー形成単位（CFU）を計数します。
- MICを評価する：
回収培地中の目視可能な微生物の発育を完全に阻止する抗菌剤の最低濃度を、MICとして測定します。
MIC 最小発育阻止濃度：マイクロタイタープレートの例と微量希釈法の結果の解釈。
（研究および画像：©Jaskiewicz et al. 2019）
精密な非接触式超音波処理に切り替えて、均一な細胞懸濁液と信頼できるMIC結果を確保しましょう！
MICアッセイ中の超音波処理は誰に役立ちますか？
- 医療機器メーカー： 表面コーティングの有効性を試験し、バイオフィルムが形成されやすい機器の洗浄プロトコルを検証するために役立ちます。
- 臨床微生物学者： 医療用器具から細菌を回収し、インプラント関連感染症（PJIなど）を正確に診断するために役立ちます。
- 医薬品開発者： バイオフィルム内の抵抗性の高い病原体に対する、新しい抗菌剤の有効性を評価するために役立ちます。
- 学術研究者： バイオフィルムの生物学と抗菌剤耐性の機序について、処理能力が高く再現性のある研究を行うために役立ちます。
- 産業分野の品質管理チーム： 産業環境における生物付着汚染と消毒剤の有効性を評価するために役立ちます（例：ASTM E2799-22規格を使用）。
設計、製造、コンサルティング – ドイツ製の品質
Hielscherの超音波処理装置は、最高水準の品質と設計基準で広く知られています。堅牢性と操作の容易さにより、当社の超音波処理装置を産業施設に円滑に導入できます。Hielscherの超音波処理装置は、過酷な条件や厳しい使用環境にも容易に対応します。
Hielscher UltrasonicsはISO認証取得企業であり、最先端の技術と使いやすさを備えた高性能な超音波処理装置に特に力を注いでいます。もちろん、Hielscherの超音波処理装置はCEに適合し、UL、CSAおよびRoHsの要件を満たしています。
96ウェルプレートおよびアッセイプレートでのサンプル調製を、 マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPを使用して効率化できます。
文献／参考文献
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
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よくある質問
MICアッセイとは何ですか？
最小発育阻止濃度（MIC）アッセイは、微生物の目視可能な発育を阻止するために必要な抗菌剤の最低濃度を測定する標準化された試験です。一般に、液体培地微量希釈法または寒天平板希釈法で実施され、微生物を抗菌剤の段階希釈液に曝露します。MICアッセイは、抗菌効果の評価、臨床治療の指針の決定、および浮遊微生物とバイオフィルム関連微生物の両方における耐性レベルの評価に極めて重要です。
バイオフィルムを対象とした最小発育阻止濃度アッセイとMBICアッセイの違いは何ですか？
バイオフィルムを対象とした最小発育阻止濃度（MIC）アッセイと最小バイオフィルム形成阻止濃度（MBIC）アッセイは関連していますが、目的と方法が異なります。
バイオフィルムを対象としたMICアッセイは、浮遊細菌ではなくバイオフィルム関連細胞に着目し、バイオフィルムの目視可能な発育または生存性を阻止するために必要な抗菌剤の最低濃度を評価します。一方、MBICアッセイは、すでに形成されたバイオフィルムの処理ではなく、抗菌剤がバイオフィルムの形成を防ぐ能力を特異的に測定します。どちらのアッセイもバイオフィルム関連細菌を扱いますが、バイオフィルムを対象としたMICアッセイは処理を対象とし、MBICアッセイは予防を重視します。そのため、バイオフィルムに対する抗菌効果を研究するための相互補完的なツールとなります。
MICアッセイではどのようなバイオフィルムを使用しますか？
最小発育阻止濃度（MIC）アッセイでは、異なる条件下での抗菌効果を研究するために、微生物のバイオフィルムと浮遊細胞の両方を使用します。
- 浮遊細胞：
浮遊細胞は、自由に浮遊する個々の微生物細胞であり、従来のMICアッセイの標準モデルとして用いられます。一般的な微生物には、Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureusおよびCandida albicansが含まれます。これらのアッセイでは、自由生活細胞の発育を阻止するために必要なMICを測定し、抗菌剤の初期スクリーニングに極めて重要な役割を果たします。 - バイオフィルム関連細胞：
バイオフィルム細胞は、細胞外マトリックス内に埋め込まれた微生物であり、このマトリックスによって抗菌剤に対する抵抗性が著しく高まります。バイオフィルムMICアッセイには、多くの場合、以下が含まれます：- グラム陰性細菌：Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosaおよびKlebsiella pneumoniae。感染症や産業環境でバイオフィルムを形成することで知られています。
- グラム陽性細菌：Staphylococcus aureus（MRSAを含む）、Staphylococcus epidermidisおよびEnterococcus faecalis。機器関連感染症に一般的に関与します。
- 真菌：Candida albicansおよび近縁種。バイオフィルム関連の真菌感染症で重要です。
- 複数種混合バイオフィルム：慢性創傷や産業における生物付着汚染などに見られる、自然の複数微生物種からなるバイオフィルムを再現するために使用されることがあります。
浮遊細胞とバイオフィルム関連細胞のMIC値を比較することで、研究者はバイオフィルムの高まった抵抗性を評価し、これらのより抵抗性の高い微生物群集に有効な薬剤を特定できます。
MICとMBECの違いは何ですか？
最小発育阻止濃度（MIC）は、バイオフィルムの形成を防ぐために必要な抗菌剤の最低濃度です。一方、最小バイオフィルム根絶濃度（MBEC）は、すでに形成されたバイオフィルムを根絶するために必要な最低濃度です。MICはバイオフィルムの形成予防に着目し、MBECは成熟したバイオフィルムに対する処理の有効性を評価します。
MBECアッセイでは一般にどのようなプレートを使用しますか？
MBECアッセイで一般に使用されるマイクロタイタープレートは、通常、ポリスチレンまたはポリプロピレン製の96ウェルプレートです。これらの材料はバイオフィルム形成に適した表面を提供し、アッセイ中に試験する抗菌剤に対して化学的耐性があります。ポリスチレン製プレートは光学的透明性のために広く好まれており、分光光度測定や蛍光に基づく測定などの後続分析に有利です。これらのプレートの設計には取り外し可能なペグ付き蓋が含まれます。増殖培地を含むウェルに浸したペグ上にバイオフィルムが形成されるため、この蓋はアッセイに不可欠です。MBECアッセイのプロトコルに適合するプレートなどの標準化されたプレートは、再現性と、UIP400MTP超音波処理装置または他の処理機器との互換性を確保するために特別に設計されています。
PEG付き蓋のプレートとは何ですか？
PEG付き蓋のプレートは、各ウェル内に伸びる小さなポリエチレングリコール（PEG）製のペグまたはピンを蓋に備えた、専用のマルチウェルプレートシステムです。これらのペグは、制御された条件下で微生物のバイオフィルムを形成するための表面を提供し、実環境でのバイオフィルムの発育を模倣します。この設計では、ウェルに増殖培地または抗菌剤を入れた状態でペグ上にバイオフィルムを発育させることができ、MBEC、MBICおよびMICアッセイなどで、処理に対するバイオフィルムの感受性を高い処理能力で試験できます。
細胞の掻き取りと比較した超音波によるバイオフィルム剥離の利点は何ですか？
超音波によるバイオフィルム剥離は、表面からバイオフィルムを除去する非侵襲的で均一かつ非常に効率的な方法を提供し、細胞の掻き取りに対して大きな利点があります。掻き取りは結果にばらつきが生じ、下地の表面や細胞を損傷する可能性がありますが、超音波はバイオフィルムのマトリックスに浸透し、隣接する構造の完全性を損なうことなくマトリックスを破砕します。この方法は再現性を確保し、汚染リスクを最小限に抑え、微生物学的研究や医療機器試験など、精密なバイオフィルム除去を必要とする用途に特に有効です。 UIP400MTP超音波処理装置が細胞の掻き取りより優れている理由について、詳しくご覧ください！
Hielscher Ultrasonicsは、高性能な超音波ホモジナイザーを、 ラボ用サイズ から 産業用サイズまで製造しています。