最小阻害濃度（MIC）アッセイプロトコル

バイオフィルムに基づく最小発育阻止濃度（MIC）測定法は、バイオフィルムに関連する微生物に対する抗菌剤の有効性を評価するために不可欠な方法である。このアッセイで重要なステップは、バイオフィルム構造を破壊し、正確な生存率評価のために埋め込まれた細胞を放出することである。UIP400MTPマルチウェルプレートソニケーターは、集束超音波を使用して制御されたキャビテーションを発生させ、バイオフィルム細胞を効率的に剥離して均一な懸濁液に分散させることで、このプロセスを促進します。この正確で再現性の高いバイオフィルム破壊により、MICアッセイの信頼性とスループットが向上し、UIP400MTPはバイオフィルム研究の推進に不可欠なツールとなっています。

バイオフィルム剥離のための超音波処理

バイオフィルムベースのMICアッセイでは通常、プレーティング、コロニー計数、光学密度測定などの方法を用いて細菌の生存率または増殖阻害を測定する。バイオフィルムに関連する微生物の抗菌薬感受性を評価する場合、バイオフィルムベースのMICアッセイでは超音波処理が重要なステップとなる。その主な役割は、正確な分析のために、バイオフィルム・マトリックスに埋め込まれた細胞を剥離し、均一な懸濁液に分散させることである。
バイオフィルムは浮遊性細胞に比べて抗菌剤に対する耐性が著しく高いため、正確な分析には適切な剥離が不可欠です。このプロセスの間、超音波は制御されたキャビテーションを発生させ、バイオフィルムのマトリックスを破壊し、埋め込まれた細胞を回収培地内の均一な懸濁液に放出します。このステップにより、プレーティング、希釈、コロニー計数などの方法で、バイオフィルムに分散した細胞の正確な生存率評価が可能になる。超音波処理によるバイオフィルムの適切な破壊は、マトリックス成分の残存による細胞の遮蔽を防ぎ、そうでなければ抗菌活性の過小評価につながる可能性があります。マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPは、この目的に特に適しており、正確で再現性の高い超音波処理条件を提供することで、信頼性の高いハイスループットなアッセイプレート作製を実現します。

バイオフィルムを用いた最小阻害濃度アッセイにおいて超音波処理が必要な理由

生存率測定と細胞計数には、単一細胞の完全で信頼性の高い剥離と分散が必要です。UIP400MTPは、均一でダメージを与えないバイオフィルムの剥離と細胞分散を促進し、確実なアッセイ結果をもたらします。

• バイオフィルムの複雑性： バイオフィルムは、細胞外高分子物質（EPS）マトリックスに包まれた構造化された微生物群集であり、このマトリックスが微生物を保護し、抗菌剤に対する耐性を高めている。
• 均一な分散： バイオフィルムに包埋された細胞の生存率や抗菌剤に対する感受性を正確に測定するには、まずバイオフィルムを剥離し、均一な懸濁液に分解する必要がある。

バイオフィルムに基づく最小阻害濃度アッセイプロトコル

最小発育阻止濃度（MIC）アッセイは、微生物の目に見える発育を阻止するのに必要な抗菌剤の最低濃度を決定する。このプロトコールは、UIP400MTP マルチウェルプレートソニケーターを使用したバイオフィルム関連微生物用のプロトコールです。

ステップ1：細菌接種片の調製

1. 細菌懸濁液を調製する：
   適切な培地で細菌を対数期中期まで増殖させる。
   培養液を標準細胞密度（例えば、マクファーランド標準0.5またはOD600～0.1）になるように希釈する。
2. 抗菌溶液を準備する：
   抗菌剤を適当な培地で希釈し、濃度範囲を作る（例えば、2倍連続希釈）。
3. 96ウェルプレートに分注する：
   標準96ウェルプレートのウェルに抗菌薬溶液を最終量が～150～200μLになるように加える。
   生育コントロール（抗菌剤なし）と無菌コントロール（細菌接種なし）を含む。

ステップ2：ペグ蓋のバイオフィルム形成

• ペグの蓋を取り付ける：
  接種したウェルに専用のペグふたをかぶせ、ペグが菌懸濁液に完全に浸るようにする。
• プレートをインキュベートする：
  ペグ上にバイオフィルムが形成されるように、静置条件下で適切な温度（例えば、37℃）で所定の時間（例えば、24時間）インキュベートする。

ステップ3：抗菌剤曝露

• ペグをすすぐ：
  菌懸濁液からペグ蓋を外し、滅菌生理食塩水またはPBSで軽くすすぎ、緩く付着した浮遊細胞を除去する。
• 抗菌剤にさらされる：
  ペグ蓋を、先に調製した抗菌薬希釈液の入った新しい96ウェルプレートに移す。
  抗菌剤がバイオフィルムに作用するように、静置状態で決められた期間（例えば24時間）インキュベートする。

ステップ4：マイクロプレートソニケーターUIP400MTPによるソニケーション

超音波処理ステップは、ペグ蓋からバイオフィルムを剥離して生存率を評価するために重要です。UIP400MTPソニケーターの場合は、以下の手順に従ってください：

1. セットアップの準備
   新しい96ウェルプレートに回収培地（例えば、中和ブロスまたは滅菌増殖培地）を各ウェルに入れる。
2. ペグの蓋を移す：
   抗菌処理プレートからペグ蓋を外す。
   ペグの蓋を滅菌生理食塩水またはPBSですすぎ、残留抗菌剤を除去する。
3. プレートをソニケーターにセットする：
   ペグの蓋を回収培地プレートに取り付ける。
   回収培地プレートをUIP400MTPソニケーターにセットし、マニュアルに記載されているように、プレートが中央に安定するようにします。
4. 超音波処理のパラメーターを調整する：
   UIP400MTPで超音波処理パラメータを設定する（設定はバイオフィルムに合わせて調整することができる）：
   アンプリチュード：70～100％。
   超音波処理時間：サイクルモードで1～3分（バイオフィルムの構造により調整）。
5. ソニッケイト
   超音波処理を開始する。超音波がバイオフィルムのマトリックスを破壊し、細胞を回収培地中に遊離させる。
6. プロセスを監視する：
   ウェル内のサンプル温度をモニターするには、プラグ可能な温度センサーを使用します。UIP400MTPは冷却のためにラボ用チラーに接続することができます。
7. ソニケーション後の処理：
   剥離したバイオフィルムを含む回収培地を直ちに新しい滅菌プレートに移し、その後の分析に使用する。

(A）バイオフィルム形成、細胞回収、MICおよびMBECの測定に使用した2％グルコース入りTSBを含むプレート；（B）ブドウ球菌のバイオフィルム形成に使用したピン付き蓋。
ピン上に形成されたバイオフィルム細胞は、細胞の回収のため、新鮮な培養液を入れた96ウェルプレート中で超音波処理（Hielscher Ultrasound Technology）により5分間剥離された。
(写真と研究：©de Oliveira et al, 2016）

ステップ4：実行可能性評価

剥離したバイオフィルムをプレートで培養する：

1. 回収培地を連続希釈し、寒天培地にプレートしてコロニー形成単位（CFU）を計数する。
2. 総務省を評価する：
   MICは、回収培地中で目に見える微生物の増殖を完全に阻害する最低の抗菌薬濃度として決定する。

MIC 最小阻害濃度：マイクロタイタープレートとマイクロダイリューション結果の解釈の例。
(研究・画像：©Jaskiewicz et al.）

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ASTM E2799プロトコルでUIP400MTPがどのようにバイオフィルム剥離に使用されているかはこちらをご覧ください。 – MBECアッセイを用いた緑膿菌バイオフィルムに対する消毒剤の有効性の試験。