バイオフィルムおよびプロテオーム解析におけるHielscher社製マルチサンプルソニッケーターを用いたプロトコール

VialTweeterマルチチューブソニケーターやUIP400MTPマイクロプレートソニケーターなどのマルチサンプルソニケーターを使用することで、ハイスループットなアプリケーションのためのラボワークフローを合理化することができます。どちらの装置も、複数のサンプルを正確かつ均一に超音波処理できるため、ばらつきを最小限に抑え、再現性を高めることができます。これは、手作業や単一サンプルの方法では効率が悪く、ばらつきが生じやすい、一貫したサンプル溶解、バイオフィルム剥離、タンパク質抽出、タンパク質分解を必要とする実験において特に有利です。

マルチサンプルソニケーターによるワークフローの合理化

例えば、UIP400MTPは、マイクロプレートウェルの超音波処理を同時に行い、バイオフィルムや細胞物質の均一な剥離を実現します。一方、VialTweeterは、複数のチューブサンプルをクロスコンタミネーションなしに正確に溶解・ホモジナイズします。これらのソニケーターは、処理時間の大幅な短縮、実験の再現性の向上、サンプルの高い完全性の維持を実現し、微生物学、プロテオミクス、分子生物学の研究に不可欠なツールとなっています。
以下は、大腸菌のバイオフィルム形成とその後のプロテオーム解析を含む研究における、Hielscherマルチサンプルソニケーターモデル、VialTweeterマルチチューブソニケーターとマイクロプレートソニケーターUIP400MTPの使用例を示す詳細なプロトコルです。

プロトコルHielscher社製マルチサンプルソニケーターによるバイオフィルム形成、剥離、プロテオーム解析

1.細菌培養の準備

• 大腸菌（W3110株）を、大腸菌のバイオフィルム形成に好適な温度である30℃で、トリプトン・ブロス（TB）培地で培養する：
  – 10 g/L トリプトン
  – 5 g/L NaCl
• プラスミドを確実に保持するために、必要に応じて抗生物質を補充する。
• 顕微鏡およびプロモーター活性の研究には、rplLプロモーターの制御下にあるゲノム強化GFP（eGFP）レポーターを持つW3110大腸菌株を使用する。
• 様々なプロモーターにGFPレポータープラスミドを利用する（例． csgA, csgD, fliA, fliC, flhD )を用いてプロモーター活性を測定した。

2.バイオフィルムの培養と剥離

• 12ウェルプレート（CellStar 12ウェルプレート、Greiner Bio-One）に1ウェル当たり1.5 mLの希釈細菌培養液を播種する。
• バイオフィルムが形成されるようにインキュベートする。
• 浮遊性（非付着性）培養物を注意深く取り除く。

– 各ウェルを500μLのPBSで洗浄する。
– UIP400MTPマイクロプレートソニケーターで12ウェルプレートを超音波処理して、付着した細胞を剥離します。UIP400MTPは、すべてのウェルに一貫した超音波エネルギーを供給することで、均一な剥離を保証します。
– ソニケーション設定：60%振幅、サイクルモード：60秒ON/30秒OFF。

3.細胞採取と溶解

• 剥離したバイオフィルム細胞を4,500 gで5分間遠心分離する。
• ペレット化した細胞をPBSで洗浄する。
• 細胞を100μLの2％ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（SLS）に懸濁し、95℃で15分間インキュベートする。
• VialTweeter Multi-Tube Sonicatorを使用してソニッケートし、細胞を完全に溶解させる。
  – ソニケーション設定：100%振幅、50秒ON/10秒OFF、総運転時間10分、サンプルは氷上に保存。

4.還元とアルキル化

• 5mMのTris(2-carboxyethyl)phosphine（TCEP）を加えてジスルフィド結合を還元し、95℃で15分間インキュベートする。
• 10mMのヨードアセトアミドでタンパク質を25℃で30分間アルキル化する。

5.タンパク質の定量と消化

• 溶解液を遠心分離し、残渣を取り除く。
• Pierce BCA Protein Assay Kit を用いて総タンパク質量を定量する。
• 2%SLSと100mM重炭酸アンモニウムを含む溶液中で、50μgの総タンパク質を1μgのトリプシンで消化する。
• 消化反応を30℃で一晩インキュベートする。

6.ペプチド精製

• 1.5%トリフルオロ酢酸（TFA）を加えてSLSを沈殿させ、遠心分離する。
• C18マイクロスピンカラムを用いてペプチドを精製する。
• 精製ペプチドを乾燥させ、0.1% TFAに懸濁する。

7.液体クロマトグラフィー-質量分析 (LC-MS/MS)

• Ultimate 3000 RSLC nanoシステムと組み合わせたQ-Exactive Plus質量分析計でペプチドを分析する。
• C18樹脂（2.4 µm）を充填した逆相HPLCカラム（75 µm × 42 cm）を用いてペプチドを分離する。
• 2%から35%の溶媒B（0.15%のギ酸を含むアセトニトリル）を140分かけてグラジエントする。
• 高分解能MSスキャンの後、最も強度の高い10個のイオンのタンデムMS/MSスキャンを行い、データを取得する。

8.データ分析

• Progenesis ソフトウェアを使用して生の LC-MS データを処理する。
• .mgfファイルをエクスポートし、MASCOTで分析。
• SafeQuantを用いてペプチドの定量を行い、品質管理およびfalse-discoveryの調整を行う。
• 再現性を確保するため、すべての実験を二重または三重で行う。

ハイスループット試料前処理用マルチサンプルソニケーター

マルチサンプルソニケーターモデルVialTweeterとUIP400MTPは、特にバイオフィルム研究とプロテオミクスにおいて、実験ワークフローの精度と効率を大幅に向上させます。複数のサンプルを均一に処理できるため、データの質を損なうことなくハイスループットを実現します。これらの利点は、上記の合理化されたワークフローと相まって、Hielscherマルチサンプルソニケーターが現代の生物学研究に不可欠なツールとなっています。

デザイン、製造、コンサルティング – 品質 ドイツ製

Hielscher社の超音波装置は、その最高の品質と設計基準でよく知られています。頑丈で操作が簡単なため、産業設備にスムーズに組み込むことができます。過酷な条件や厳しい環境でも、Hielscherの超音波装置は容易に対応できます。

Hielscher Ultrasonics社は、ISO認証取得企業であり、最先端の技術と使いやすさを特徴とする高性能超音波振動子に特に重点を置いています。もちろん、Hielscherの超音波装置はCEに準拠しており、UL、CSA、RoHsの要件を満たしています。