バイオフィルムおよびプロテオーム解析にHielscherの複数サンプル用超音波処理装置を使用するプロトコル

VialTweeter複数チューブ用超音波処理装置やUIP400MTPマイクロプレート用超音波処理装置などの複数サンプル用超音波処理装置を使用することで、ハイスループット用途の実験室ワークフローを効率化できます。両装置は複数のサンプルに対して精密かつ均一な超音波処理を可能にし、ばらつきを最小限に抑え、再現性を高めます。これは、サンプルの溶解、バイオフィルムの剥離、タンパク質抽出、タンパク質分解酵素による消化を一貫した条件で行う必要がある実験で特に有利です。こうした実験では、手作業や単一サンプルを処理する方法は効率が低く、結果にばらつきが生じやすいためです。

複数サンプル用超音波処理装置でワークフローを効率化

例えば、UIP400MTPはマイクロプレートの各ウェルを同時に超音波処理でき、バイオフィルムや細胞由来物質を均一に剥離します。一方、VialTweeterは交差汚染を起こすことなく、複数のチューブ内のサンプルを精密に溶解・均質化します。これらの超音波処理装置は処理時間を大幅に短縮し、実験の再現性を向上させ、サンプルの完全性を高い水準で維持するため、微生物学、プロテオミクス、分子生物学研究に不可欠なツールです。
以下に、E. coliのバイオフィルム形成とその後のプロテオーム解析を伴う研究において、Hielscherの複数サンプル用超音波処理装置であるVialTweeter複数チューブ用超音波処理装置とマイクロプレート用超音波処理装置UIP400MTPを使用する例を示した詳細なプロトコルを紹介します。

プロトコル：Hielscherの複数サンプル用超音波処理装置を使用したバイオフィルム形成、剥離、プロテオーム解析

1. 細菌培養の準備

• E. coli（W3110株）を、E. coliのバイオフィルム形成に適した温度である30°Cで、以下を含むトリプトンブロス（TB）培地で培養します。
  – 10 g/L トリプトン
  – 5 g/L NaCl
• プラスミドの保持を確実にするため、必要に応じて抗生物質を添加します。
• 顕微鏡観察およびプロモーター活性の研究には、rplLプロモーターの制御下にある増強型GFP（eGFP）レポーターをゲノムに持つE. coli W3110株を使用します。
• さまざまなプロモーター（例： csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ）用のGFPレポータープラスミドを使用して、プロモーター活性を測定します。

2. バイオフィルムの培養と剥離

• 希釈した細菌培養液を、12ウェルプレート（CellStar 12ウェルプレート、Greiner Bio-One）の各ウェルに1.5 mLずつ播種します。
• バイオフィルムが形成されるようにインキュベートします。
• 浮遊性（非付着性）の培養液を慎重に除去します。

– 各ウェルを500 µLのPBSで洗浄します。
– UIP400MTPマイクロプレート用超音波処理装置で12ウェルプレートを超音波処理し、付着細胞を剥離します。UIP400MTPはすべてのウェルに一貫した超音波エネルギーを供給することで、均一な剥離を実現します。
– 超音波処理設定：振幅60%、サイクルモード：60 sec ON / 30 sec OFF。

3. 細胞の回収と溶解

• 剥離したバイオフィルム細胞を4,500 gで5分間遠心分離します。
• ペレット化した細胞をPBSで洗浄します。
• 細胞を100 µLの2%ラウロイルサルコシンナトリウム（SLS）に再懸濁し、95°Cで15分間インキュベートします。
• 細胞を完全に溶解するため、VialTweeter複数チューブ用超音波処理装置を使用して超音波処理します。
  – 超音波処理設定：振幅100%、50 s ON / 10 s OFF、総運転時間10 min。サンプルは氷上に保持します。

4. 還元とアルキル化

• ジスルフィド結合を還元するために5 mMのTris(2-carboxyethyl)phosphine（TCEP）を添加し、95°Cで15分間インキュベートします。
• 10 mMのヨードアセトアミドで、25°Cで30分間タンパク質をアルキル化します。

5. タンパク質の定量と消化

• 溶解液を遠心分離して残渣を除去します。
• Pierce BCA Protein Assay Kitを使用して総タンパク質量を定量します。
• 2% SLSおよび100 mM炭酸水素アンモニウムを含む溶液中で、50 µgの総タンパク質を1 µgのトリプシンで消化します。
• 消化反応液を30°Cで一晩インキュベートします。

6. ペプチドの精製

• 1.5%トリフルオロ酢酸（TFA）を添加してSLSを沈殿させ、その後遠心分離します。
• C18マイクロスピンカラムを使用してペプチドを精製します。
• 精製したペプチドを乾燥させ、0.1% TFAに再懸濁します。

7. 液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS/MS）

• Ultimate 3000 RSLC nanoシステムに接続したQ-Exactive Plus質量分析計でペプチドを分析します。
• C18樹脂（2.4 µm）を充填した逆相HPLCカラム（75 µm × 42 cm）を使用してペプチドを分離します。
• 140分間かけて、溶媒B（0.15%ギ酸を含むアセトニトリル）の割合を2%から35%に変化させるグラジエントを適用します。
• 高分解能MSスキャンに続いて、強度が最も高い10個のイオンのタンデムMS/MSスキャンを行い、データを取得します。

8. データ解析

• Progenesisソフトウェアを使用して生のLC-MSデータを処理します。
• .mgfファイルをエクスポートし、MASCOTで解析します。
• 品質管理と偽発見の補正のために、SafeQuantを使用してペプチドを定量します。
• 再現性を確保するため、すべての実験をデュプリケートまたはトリプリケートで実施します。

ハイスループットなサンプル調製のための複数サンプル用超音波処理装置

複数サンプル用超音波処理装置VialTweeterとUIP400MTPは、特にバイオフィルム研究やプロテオミクスにおいて、実験ワークフローの精度と効率を大幅に向上させます。複数のサンプルを均一に処理する能力により、データ品質を損なうことなく高い処理能力を確保できます。これらの利点と、上記で説明した効率的なワークフローにより、Hielscherの複数サンプル用超音波処理装置は現代の生物学研究に欠かせないツールとなっています。

設計、製造、コンサルティング – ドイツ製の品質

Hielscherの超音波処理装置は、最高水準の品質と設計基準で広く知られています。堅牢性と操作の容易さにより、当社の超音波処理装置を産業施設に円滑に導入できます。Hielscherの超音波処理装置は、過酷な条件や厳しい環境にも容易に対応します。

Hielscher UltrasonicsはISO認証取得企業であり、最先端技術と使いやすさを備えた高性能超音波処理装置に特に重点を置いています。当然ながら、Hielscherの超音波処理装置はCEに適合し、UL、CSA、RoHsの要件を満たしています。