FFPEからの脱パラフィンおよびタンパク質抽出

ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織切片からのタンパク質抽出を、脱パラフィン、可溶化、およびVialTweeterマルチチューブ超音波処理装置の最適な組み合わせで促進します。このプロトコールは、下流の質量分析ベースのプロテオミクスをサポートし、SP3クリーンアップおよび酵素消化ワークフローに適合します。

このSOPは、高性能超音波処理を用いたFFPE組織試料のプロテオミクス解析に携わるラボ担当者を対象としています。このSOPは、VialTweeter Multi-Tube Sonicatorを使用して最大10個のFFPEサンプルを並行して処理するために最適化されています。

プロトコルVialTweeterを用いたFFPEサンプルからのタンパク質抽出

材料と試薬

試薬

• キシレン（組織グレード）
• エタノール（絶対96）
• 溶解バッファー：

6 M 塩酸グアニジン
50 mM Tris-HCl, pH 8.5
10 mM TCEP（トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン）
40 mM CAA（2-クロロアセトアミド）

• プロテアーゼ阻害剤（オプション；例：cOmplete™ mini EDTAフリー）

設備

• バイアルトゥイーター マルチチューブ超音波発生器
• 1.5 mLまたは2.0 mL低結合微量遠心チューブ
• ヒートブロックまたはインキュベーター（95℃および80℃設定）
• 遠心分離機
• サーモミキサー（オプションだが推奨）

サンプル入力

• 1サンプルにつき10µm厚のFFPE組織の切片1～2枚（すなわち1バイアルにつき）

または

• サンプルあたり（すなわちバイアルあたり）合計～100μgの組織

注：パラフィン残渣の汚染を最小限にするため、マイクロトミーには新しい刃を使用する。

手続き

1. 脱パラフィン
   1. FFPE切片を結合性の低い微量遠心チューブに移す。
   2. 1mLのキシレンを加え、短時間ボルテックスする。
   3. 室温で10分間インキュベートする。
   4. 14,000×gで2分間遠心し、上清を捨てる。
   5. キシレン洗浄をもう1回繰り返す（ステップ2-4）。
   6. ペレットを1mLの96％エタノールで洗浄し、ボルテックスした後、14,000×gで2分間遠心する。上清を捨てる。
   7. エタノール洗浄をもう1回繰り返す（合計2回のエタノール洗浄）。
   8. ペレットを蓋を開けたまま室温で10分間風乾し、残留エタノールを蒸発させる。
2. タンパク質の抽出と超音波処理
   1. 各乾燥ペレットに200μLの溶解バッファーを加える。
      注：ソニケーターは1mLまで対応するが、ダウンストリーム処理には200μLが最適である。

   2. ボルテックスまたは緩やかなピペッティングで混合する。
3. 最初の温度インキュベーション
   1. サーモミキサーまたはヒートブロックを用いて400rpmで撹拌しながら、チューブを95℃で30分間インキュベートする。
   2. サンプルを室温で5分間冷却する。
4. バイアルトゥイーターによる最初の超音波処理
   1. チューブをVialTweeterに入れる。
   2. VialTweeter UP200Stを以下の値に設定し、超音波処理を行う。
ソニケーター設定
- 振幅（A）を100％に設定する
- 脈動モード（C）を100％に設定する。
- ピリオドクロック：オン
- 定刻通り：60年代
- オフタイム：30秒
- 限界値：15分（10サイクルに相当）
(計算注：（60秒オン＋30秒オフ）×10サイクル＝900秒＝15分）
5. 2回目の温度インキュベーション
   チューブを取り出し、再度95℃で15分間、400rpmでインキュベートする。
6. セカンド・ソニケーション
   VialTweeterで同じ設定（上記と同じ）で超音波処理をさらに10サイクル（合計15分）繰り返す。
7. ライセートの清澄化
   1. サンプルを13,000×g、23℃（室温）で10分間遠心する。
   2. 上清を新しい2.0 mL セーフロックエッペンドルフチューブに注意深く集める。ペレットを乱さないようにする。
8. ダウンストリーム処理
   これでライセートは、SP3クリーンアップと酵素消化の準備が整った。

注意事項とベストプラクティス

1. 超音波処理中の過熱リスクは、プログラムされたON/OFFサイクルによって軽減されます。
2. タンパク質の凝集を防ぐため、超音波処理後のボルテックスは避ける。

廃棄物処理と安全性

下の表は、ラボ用超音波処理装置の処理能力の目安です：