FFPE試料の脱パラフィンとタンパク質抽出
脱パラフィン、可溶化、およびVialTweeterマルチチューブ超音波処理装置による超音波処理を最適に組み合わせることで、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織切片からのタンパク質抽出を促進します。このプロトコルは、後工程の質量分析に基づくプロテオミクスに対応し、SP3クリーンアップおよび酵素消化ワークフローと互換性があります。
この標準作業手順書（SOP）は、高性能な超音波処理を用いたFFPE組織検体のプロテオーム解析に携わる実験室スタッフを対象としています。VialTweeterマルチチューブ超音波処理装置を用いて、最大十個のFFPE試料を並行処理するために最適化されています。
VialTweeter超音波処理装置 による10個の試料の同時超音波処理（例：FFPE試料の溶解およびタンパク質抽出）
プロトコル：VialTweeterを用いたFFPE試料からのタンパク質抽出
材料および試薬
試薬
- キシレン（組織学用グレード）
- エタノール（無水96%）
- 溶解バッファー：
- プロテアーゼ阻害剤（任意；例：cOmplete™ mini EDTA-free）
6 M グアニジン塩酸塩
50 mM Tris-HCl、pH 8.5
10 mM TCEP（Tris(2-carboxyethyl)phosphine）
40 mM CAA（2-Chloroacetamide）
機器
- VialTweeterマルチチューブ超音波処理装置
- 1.5 mLまたは2.0 mLの低吸着マイクロ遠心チューブ
- ヒートブロックまたはインキュベーター（95°Cおよび80°Cの設定）
- マイクロ遠心機
- サーモミキサー（任意ですが推奨）
試料投入量
- 試料あたり（すなわちバイアルあたり）、厚さ10 µmのFFPE組織切片1–2枚
- 試料あたり（すなわちバイアルあたり）、合計~100 µgの組織
または
注：パラフィン片による汚染を最小限に抑えるため、ミクロトームによる薄切には新しい刃を使用してください。
手順
- 脱パラフィン
- FFPE切片を低吸着マイクロ遠心チューブに移します。
- キシレン1 mLを加え、短時間ボルテックスで混合します。
- 室温で10分間インキュベートします。
- 14,000 × gで2分間遠心し、上清を廃棄します。
- キシレン洗浄をもう一度繰り返します（手順2–4）。
- ペレットを96%エタノール1 mLで洗浄し、ボルテックスで混合した後、14,000 × gで2分間遠心します。上清を廃棄します。
- エタノール洗浄をもう一度繰り返します（エタノール洗浄は合計2回）。
- 残留エタノールを蒸発させるため、蓋を開けたまま室温で10分間ペレットを自然乾燥させます。
- タンパク質抽出および超音波処理
- 乾燥した各ペレットに溶解バッファー200 µLを加えます。
注：超音波処理装置は最大1 mLに対応していますが、後工程の処理には200 µLが最適です。 - ボルテックスまたは穏やかなピペッティングで混合します。
- 乾燥した各ペレットに溶解バッファー200 µLを加えます。
- 初回の加熱インキュベーション
- サーモミキサーまたはヒートブロックを使用し、400 rpmで振とうしながら、チューブを95 °Cで30 minインキュベートします。
- 試料を室温で5 min冷却します。
- VialTweeterによる初回の超音波処理
- チューブをVialTweeterにセットします。
- VialTweeter UP200Stを以下の値に設定し、超音波処理を行います。
- 二回目の加熱インキュベーション
チューブを取り出し、再び95 °C、400 rpmで15 minインキュベートします。 - 二回目の超音波処理
同じ設定（上記参照）で、VialTweeterによる超音波処理をさらに10サイクル（合計15 min）繰り返します。 - 溶解液の清澄化
- 試料を23°C（室温）、13,000 × gで10 min遠心します。
- 上清を新しい2.0 mL Safe-lock Eppendorfチューブに慎重に回収します。ペレットを乱さないようにしてください。
- 後工程の処理
これで溶解液はSP3クリーンアップおよび酵素消化に使用できる状態になります。
• 振幅（A）を100%に設定
• パルスモード（C）を100%に設定
• 周期タイマー：オン
• オン時間：60s
• オフ時間：30s
• 制限値：15 min（10サイクルに相当）
（計算に関する注記：（オン60 s + オフ30 s）× 10サイクル = 900 s = 15 min）
Hielscher VialTweeter にEppendorfチューブ10本をセットした状態
注意事項および推奨事項
- プログラムされたオン／オフの繰り返しにより、超音波処理中の過熱リスクが軽減されます。
- タンパク質の凝集を防ぐため、超音波処理後のボルテックス混合は避けてください。
廃棄物処理および安全性
以下の表は、当社の実験室規模の超音波処理装置のおおよその処理能力を示しています：
| 推奨装置 | バッチ容量 | 流量 |
|---|---|---|
| UIP400MTP 96ウェルプレート超音波処理装置 | マルチウェル／マイクロタイタープレート | n.a. |
| 超音波CupHorn | バイアルまたはビーカー用CupHorn | n.a. |
| GDmini2 | 超音波マイクロフローリアクター | n.a. |
| VialTweeter | 0.5–1.5mL | n.a. |
| UP100H | 1–500mL | 10–200mL/min |
| UP200Ht, UP200St | 10–1000mL | 20–200mL/min |
| UP400St | 10–2000mL | 20–400mL/min |
| 超音波ふるい振とう機 | n.a. | n.a. |
Hielscher Ultrasonicsは、実験室、パイロット、および産業規模での混合用途、分散、乳化、抽出に対応する高性能超音波ホモジナイザーを製造しています。
文献／参考資料
- Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
- Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
- Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.
よくある質問
組織試料をFFPEとして固定するのはなぜですか？
ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）による保存は、ホルムアルデヒドを介して共有結合による架橋を形成することで、組織形態およびタンパク質構造を安定化します。パラフィンへの包埋により、後ろ向き解析に必要な組織学的および分子的な完全性を維持しながら、室温での長期保存が可能になります。
FFPE試料の脱パラフィンはどのように行いますか？
脱パラフィンでは、溶媒による順次洗浄でパラフィンを除去します。通常はキシレンで二回インキュベートした後、エタノール（96%）で二回洗浄します。遠心および乾燥後、組織は後工程の抽出に使用できる状態になります。この工程により、溶解および酵素消化のための試料へのアクセスが回復します。
加熱インキュベーションの目的は何ですか？
加熱インキュベーションとは、生化学的または物理的な変化を誘導するために、試料を一定の温度に一定時間、制御された条件下で曝露することです。プロテオミクスでは、タンパク質の変性、FFPE組織中のホルムアルデヒド架橋の解除、または溶解バッファーの効果の向上に一般的に用いられます。温度および時間は重要なパラメーターであり、目的とする反応や試料の種類に合わせて調整されます。
SP3消化とは何ですか？
単一容器内で固相により促進する試料調製法（SP3）は、ビーズを用いたプロテオミクスワークフローです。常磁性ビーズにタンパク質を結合させることで、変性条件下での効率的なクリーンアップ、濃縮、およびビーズ上での酵素消化を可能にします。SP3は試料損失を最小限に抑え、微量試料およびFFPE試料との適合性が高い方法です。
Hielscher Ultrasonicsは高性能超音波ホモジナイザーを、 実験室規模 から 産業規模まで製造しています。