FFPEのハイスループットサンプル調製：タンパク質抽出と核酸のせん断
Hielscher Ultrasonicsは、ハイスループット超音波処理装置UIP400MTPにより、ホルマリン固定・パラフィン包埋（FFPE）組織の調製に伴う課題に対応します。超音波処理によって、多数のFFPEサンプルの脱パラフィン、組織溶解、ホモジナイズ、タンパク質抽出、DNA/RNAのせん断をどのように行うかをご覧ください！超音波によるFFPE組織調製を活用し、マルチウェルプレートで多数のサンプルを処理しましょう！高品質のサンプルを多数取得し、信頼性の高い研究結果を得ましょう！そして最後に、時間と費用の節約も忘れてはならない利点です！
ハイスループット超音波処理で容易になるFFPEサンプル調製
ホルマリン固定・パラフィン包埋（FFPE）は、固形組織の保存と保管に最も一般的に用いられる方法です。FFPE組織サンプルからの生体分子抽出は、保存されたサンプルの品質に起因して、大きな課題を伴うことがよくあります。分子生物学や臨床研究において非常に貴重な資産であるこれらのサンプルは、後ろ向き研究や診断用バイオマーカーの検証のための豊富な生物学的情報源となります。しかし、ホルマリン固定・パラフィン包埋の工程は、組織の構築と形態を保持する一方で、高品質な核酸やタンパク質の抽出を困難にします。ホルマリンは核酸とタンパク質の架橋を誘発し、分子の断片化や化学修飾を引き起こします。 ハイスループット超音波処理装置UIP400MTPがFFPEサンプル調製の課題をどのように克服するかをご覧ください！
効率的なFFPEサンプル調製のための超音波処理装置
- 使いやすいワークフロー：使いやすく簡素化された工程。
- 脱パラフィン、タンパク質抽出、DNA / RNAのせん断
- 迅速なハイスループット処理：マルチウェルプレートを効率的に処理。
- 効果的な脱パラフィン：タンパク質の可溶化を改善。
- 無毒性の溶媒：キシレンなどの有害な有機溶媒の使用を回避。
UIP400MTPハイスループット超音波処理装置 は、マルチウェルプレートでのFFPEサンプルのハイスループット処理に使用できます
FFPE組織からのタンパク質抽出技術の進歩
Hielscher Ultrasonicsは、ハイスループットFFPEサンプル調製の課題に対応します。超音波処理は、超音波を用いて機械的振動と集中的なキャビテーションを発生させ、細胞構造を効果的に破砕するとともに、生体分子の可溶化を促進します。この技術は、FFPE組織からの核酸およびタンパク質抽出の効率と収量を高め、さらにライブラリー調製のためのDNAとRNAのせん断も行えることから、普及が進んでいます。UIP400MTPマルチウェルプレート超音波処理装置による超音波処理が、後続の用途に向けてこれらの生体分子の完全性を保持する点は、特に強調すべき重要な点です。
ハイスループット超音波処理による核酸のせん断
ハイスループット環境で使用するマルチウェル超音波処理装置UIP400MTPは、FFPEサンプル調製を新たな水準へと引き上げます。このマルチウェルプレート超音波処理法は、複数のサンプルを同時に処理するための効率的で信頼性の高いソリューションを提供します。次世代シーケンシング（NGS）、定量PCR、プロテオーム解析など、さまざまな分析技術で重要となるDNA、RNA、タンパク質を、迅速かつ再現性高く抽出できます。振幅、処理時間、温度などの超音波処理パラメーターを最適化することで、抽出される生体分子の品質と量がさらに向上します。
マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPは、FFPE組織由来のDNAとRNAの断片化およびせん断に大きな利点をもたらします。このシステムの際立った特長の一つは、DNAとRNAの断片サイズを狭い範囲に制御できることです。超音波処理の強度を精密に調整することで、150–200塩基対（bp）の短い断片、または15–20キロ塩基対（kbp）のより長い断片を得られます。この汎用性により、UIP400MTPはショートリードとロングリードの両方のシーケンシング用途に不可欠な装置となり、次世代シーケンシング（NGS）や全ゲノムシーケンシング（WGS）で高品質な結果を保証します。断片サイズを精密に制御できることは、仕様に合わせたサンプル調製を可能にするため、ゲノミクスのあらゆる分野の研究者にとって極めて重要です。
FFPE組織向けの高度なソリューションについてお問い合わせください
FFPEサンプルから生体分子を効率的に回収し、抽出した核酸とタンパク質の完全性を保持するとともに、結果の再現性を保証するUIP400MTPマルチウェルプレート超音波処理装置をご覧ください。この技術は、ほかの調製・分析ワークフローとシームレスに統合でき、保存されたFFPE組織を用いた分子研究を効率化し、向上させます。
固定剤とその作用
固定は、細胞構造を保持し、生化学反応を停止させ、分解を防ぐ、サンプル調製における重要な工程です。実験の具体的な要件に応じて、さまざまな固定剤が使用されます。最も一般的な二つの固定剤はホルムアルデヒドとパラホルムアルデヒドで、タンパク質と核酸を架橋し、細胞や組織の形態と抗原性を保持します。エタノール、メタノール、グルタルアルデヒドなどのほかの固定剤は、特定の用途に使用されます。
ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドの固定剤は、アミノ基間にメチレン架橋を形成し、タンパク質の架橋を引き起こします。この工程によって細胞成分が効果的に固定化され、その後の分析工程でも完全性が保持されます。これらの固定剤の作用は、濃度、pH、温度などの因子に左右されることがあり、細胞構造を最適な状態で保存するためには、これらのパラメーターの最適化が重要です。
超音波によるFFPE調製の利点
超音波処理は、固定された細胞や組織を破砕するための強力な技術であり、従来の技術を上回ります。従来の溶解法と比べて、いくつもの顕著な利点があります。
- 速度と効率： 超音波溶解は、細胞や組織を迅速に破砕し、機械的または化学的な溶解法と比べて処理時間を大幅に短縮します。超音波プローブが発生させる高周波の音波は機械的なせん断力を生み、固定された細胞構造を破砕します。この迅速かつ効率的な破砕によって、研究者は短時間で大量のサンプルを処理できます。
- 穏やかで調整可能： 超音波溶解は、タンパク質、核酸、酵素などの損傷を受けやすい生体分子へのダメージを最小限に抑える、穏やかな破砕機構を提供します。過剰な熱やせん断力を生じる機械的方法とは異なり、超音波溶解は制御されたキャビテーションを利用して細胞を破砕しながら、細胞内成分の完全性と機能を保持します。
- 汎用性： 超音波溶解は、さまざまな固定剤で処理されたサンプルに適用でき、研究者は幅広い固定サンプルを扱えます。ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、または別の固定剤のいずれを使用した場合でも、超音波溶解は一貫して効率的な破砕を実現し、細胞成分の最適な回収を保証します。
- 高い収量と品質： 超音波溶解は、固定された細胞や組織を均一に破砕できるため、完全性を保った細胞成分を高収量で回収できます。これにより、タンパク質分析、核酸抽出、酵素アッセイなどの後続の用途で、信頼性と再現性の高い結果が得られます。
- 自動化への適合性： 超音波溶解は自動化システムに容易に統合でき、ハイスループットのサンプル処理を可能にします。この適合性により、研究者は特に大規模な研究でワークフローを効率化し、生産性を向上できます。
VialTweeterマルチチューブ超音波処理装置を使用した脱パラフィンとタンパク質抽出の詳細なプロトコルをご覧ください！
96ウェルプレート超音波処理装置UIP400MTP は、マイクロタイタープレートとマルチウェルプレートの超音波処理に使用できます
超音波溶解は、固定された細胞や組織の破砕に革新をもたらし、従来の溶解法に比べて多くの利点を提供します。その速度、効率、選択性、汎用性、高収量、自動化への適合性により、分子生物学やバイオテクノロジーの研究に不可欠なツールとなっています。Hielscher Ultrasonicsは、非接触式およびプローブ式の超音波処理装置を提供し、お客様のライフサイエンス用途に最も適した超音波ホモジナイザーをご提案します。単一サンプル、複数サンプル、または極めて多数のサンプルを同時に処理する場合でも、研究および診断の要件に合う最良の超音波処理装置をご提供します。
複数サンプルおよびハイスループットのサンプル調製に適したHielscherの非接触式超音波処理装置について、詳しくご覧ください！
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- 簡単で安全な操作
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設計、製造、コンサルティング – ドイツ製の品質
Hielscherの超音波処理装置は、最高水準の品質と設計基準で知られています。堅牢性と操作の容易さにより、当社の超音波処理装置を産業施設に円滑に導入できます。過酷な条件や厳しい環境にも、Hielscherの超音波処理装置は容易に対応します。
Hielscher UltrasonicsはISO認証企業であり、最先端技術と使いやすさを備えた高性能超音波処理装置に特に力を入れています。当然ながら、Hielscherの超音波処理装置はCEに適合し、UL、CSA、RoHsの要件を満たしています。
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UIP400MTP超音波処理装置： マルチウェルプレートでのハイスループットFFPEサンプル調製
よくあるご質問
以下では、FFPE組織の調製とFFPEサンプルの超音波処理に関するよくあるご質問にお答えします。
FFPE組織はどのように調製しますか？
FFPE組織調製の手順：高品質のFFPEサンプルを作製するには、新鮮な組織を細心の注意を払って取り扱い、処理することが重要です。正確な後続の分析には、細胞の構築、核酸、タンパク質を確実に保持することが不可欠です。採取から包埋までの各工程には、組織学的検査、免疫組織化学、分子研究などのさまざまな分析に向けてサンプルの完全性を維持するための精密さが求められます。この固定・包埋工程を適切に実施することで、保存組織が生体内の状態を正確に反映し、信頼性の高い診断結果や研究成果につながります。
FFPE組織サンプルの包埋工程における6つの主要な手順をご説明します。
- 組織の採取
生きた哺乳類からの生検と組織培養は、いずれもFFPEサンプル調製用の新鮮な組織を得るための適切な供給源です。
無菌操作を行うことが重要です。汚染を避けるため、滅菌済みの器具と手袋を使用してください。理想的には、手術室や層流フードなどの無菌環境で組織を採取します。
検体は非常に脆弱であるため、慎重な取り扱いが不可欠です。処理の遅れを最小限に抑え、切除後は直ちにその後の組織処理を開始してください。これは自己融解と分解を防ぐために重要です。組織は室温に保ち、氷結晶の形成や組織損傷を引き起こすおそれがあるため、凍結を避けてください。 - 組織の固定
まず、組織を固定液で処理します。中性pHに緩衝された、水中の4%ホルムアルデヒドに相当する10%中性緩衝ホルマリン（NBF）を使用してください。
組織をホルマリンに完全に浸してください。固定液と組織の体積比を少なくとも10:1にしてください。固定時間は、組織の種類と大きさに応じて、通常6–24時間です。固定液が組織全体に十分に浸透できることが重要です。ただし、過剰な固定は抗原賦活化を困難にする架橋を引き起こす可能性があり、固定不足は組織の保存不良につながる可能性があります。 - 組織のトリミング
次に、固定液が十分に浸透できるよう、組織を約3–5 mmの厚さに切りそろえます。対象となる組織学的構造を捉えられるよう、組織を適切な向きにしてください。これにより、後に組織を分析に使用する際の抽出工程が容易になります。 - 固定サンプルの処理
続いて、固定された組織を脱水する必要があります。固定後は、パラフィンワックスが十分に浸透するように組織を脱水します。組織を段階的な濃度のエタノール（70%、80%、90%、100%）に順次通し、水分を除去してください。
キシレンによる透徹：パラフィンワックスは水には不溶ですが、キシレンには溶解します。そのため、組織内の水をキシレンに置換する必要があります。ただし、キシレン自体は水には不溶で、アルコールには溶解するため、まず水をアルコールに置換する中間工程が必要です。組織をキシレンまたはキシレン代替剤に浸してエタノールを除去し、パラフィン浸透に備えてください。
パラフィンによる浸透：組織を溶融パラフィンワックスに包埋し、完全に浸透させてください。この工程では通常、十分な含浸を確保するためにパラフィンを数回交換します。 - 組織の包埋
この工程では、組織を組織ブロックに成形します。組織を目的の向きで型に入れ、その上から溶融パラフィンを注いでください。室温または冷却プレート上で冷却し、パラフィンを固化させます。 - 薄切とスライドへの載置
ミクロトームによる薄切：包埋した組織を薄切するには、ミクロトームを使用し、パラフィンブロックから薄い切片（通常4–5マイクロメートル）を切り出します。その後、切片をスライドガラスに載せ、後続の染色と顕微鏡分析に備えます。
最後に、組織標本の品質を確認します。最初の切片を顕微鏡下で評価し、固定と処理が適切であることを確認してください。組織の種類と観察された品質に基づき、必要に応じてプロトコルを調整してください。
FFPE組織は、RNA、DNA、タンパク質の回収や、がんまたはその他の疾患の徴候の発見に使用できます。何年にもわたって保存でき、研究者や医師が診断と研究のために組織サンプルを活用するうえで不可欠なものです。
FFPE組織によく見られる問題や課題は何ですか？
ホルマリン固定・パラフィン包埋（FFPE）組織サンプルは研究や診断で広く使用されていますが、いくつかの課題や共通する問題があります。
- 生体分子の分解： 長時間の固定はDNA、RNA、タンパク質の分解につながる可能性があり、後続の用途に向けた高品質の核酸やタンパク質の抽出を困難にします。組織を保存するには、適切な固定（固定不足と過剰な固定を避けること）が不可欠です。
- 抗原のマスキング： 固定工程は抗原部位をマスキングする可能性があり、免疫組織化学やその他の免疫学的アッセイにおける抗体結合の有効性を低下させます。そのため、エピトープのマスキングを解除し、エピトープと抗体の結合を回復させる処理である抗原賦活化が必要になることがよくあります。ただし、抗原性が常に完全に回復するとは限りません。
- 固定品質のばらつき： 固定時間や条件の違いは、サンプル品質の不均一につながり、結果の再現性や比較可能性に影響を及ぼす可能性があります。信頼性の高い固定プロトコルを使用し、固定不足と過剰な固定を避けてください。
- DNAの損傷と断片化： FFPEサンプルのホルマリン固定は、シトシンの脱アミノ化（CからTへの変異）、酸化損傷（例：GからTへの変異を引き起こす8-oxo-guanine）などのさまざまなDNA損傷に加え、DNAポリメラーゼの活性を妨げるニック、ギャップ、脱塩基部位などの物理的な損傷を引き起こす可能性があります。ホルマリン固定工程はDNAの断片化を引き起こす可能性があり、PCRやシーケンシングなどの遺伝学的解析およびゲノム解析を困難にします。
- RNAの品質： FFPE組織から抽出したRNAは、断片化や化学修飾を受けていることが多く、高品質なトランスクリプトーム解析の実施が困難になります。
- タンパク質の修飾： ホルマリンはタンパク質に化学修飾を誘発し、その構造と機能に影響を及ぼす可能性があり、プロテオーム解析を妨げることがあります。
- サンプル処理によるアーティファクト： 包埋と薄切の工程では、機械的応力や熱がアーティファクトを生じさせ、組織にさらなる損傷を与える可能性があります。
- バッチ間のばらつき： バッチごとの固定・包埋プロトコルの違いは、結果に大きなばらつきを生じさせ、研究間の比較を困難にする可能性があります。
- 保存上の問題： FFPEブロックの長期保存は、経時的なさらなる分解や核酸の完全性の低下につながる可能性があり、後ろ向き研究における保存サンプルの利用可能性に影響を及ぼします。
架橋： ホルマリン固定はタンパク質と核酸の架橋を引き起こし、分子分析を妨げ、免疫組織化学やその他のアッセイの精度に影響を及ぼす可能性があります。
最適化されたプロトコルの使用、慎重なサンプルの取り扱い、高度な技術の適用は、FFPE組織から得られるデータの品質と信頼性の向上に役立ちます。
FFPE組織と凍結組織の違いは何ですか？
FFPE（ホルマリン固定・パラフィン包埋）組織は、ホルマリンで固定した後にパラフィンワックスに包埋して保存するため、組織形態を維持しながら室温で長期保存できます。一方、凍結組織は凍結によって迅速に保存され、核酸とタンパク質の完全性をより良好に保持しますが、非常に低い温度での保存が必要です。
FFPE包埋にはどのような化学物質を使用しますか？
FFPE包埋に使用する化学物質には通常、固定用のホルマリンと包埋用のパラフィンワックスが含まれます。FFPE包埋では、組織は通常、10%（v/v）中性緩衝ホルマリン（FA）またはパラホルムアルデヒド粉末から新たに調製した4%（w/v）ホルムアルデヒド溶液（PFA）のいずれかで固定します。ホルマリンはホルムアルデヒドの水溶液であり、組織形態を保持し、過剰な架橋を防ぐために中性pHに緩衝されています。パラホルムアルデヒドを原料とする溶液も、タンパク質を架橋することで効果的な固定を行い、その後のパラフィンワックスへの包埋に向けて組織構造を安定化させます。これらの化学物質は、固定・包埋工程で組織の完全性と形態を維持するために不可欠です。
FFPEサンプルからパラフィンをどのように除去しますか？
FFPEサンプルからパラフィンを除去するには、通常、組織切片をキシレンで繰り返し洗浄し、その後、段階的な濃度のアルコール、最後に水を用いて再水和します。キシレンは毒性が非常に高く、呼吸器の問題、皮膚刺激、反復曝露による潜在的な長期影響などの健康リスクをもたらすため、多くの研究室で超音波によるパラフィン除去が有望な代替法として注目されています。この方法は強力な超音波を用い、キシレンのような有毒な溶媒を必要とせずにパラフィンを効率的かつ安全に除去することで、研究室職員のリスクを低減し、より安全な作業環境を実現します。
良好なFFPEサンプル品質を得るには、組織をどのくらいの時間固定すべきですか？
固定時間に関する一般的な推奨では、通常、組織サンプルをホルマリンで24–48時間固定することが勧められます。この時間は一般に、組織形態と細胞構造を保持しながら、過剰な架橋や核酸・タンパク質の分解につながる可能性のある過剰な固定を最小限に抑えるのに十分です。ただし、最適な固定時間は組織の大きさや種類によって異なり、より小さい、またはより繊細なサンプルでは、より短い固定時間が必要です。組織の自己融解や分解を防ぐために十分な固定を行う一方で、後続の分子分析を困難にするおそれのある長時間の固定を避けるというバランスを取ることが重要です。