FFPEハイスループットサンプル前処理：タンパク質抽出と核酸剪断
ハイスループット超音波処理装置UIP400MTPにより、Hielscher Ultrasonicsはホルマリン固定・パラフィン包埋（FFPE）組織前処理の課題に対応します。FFPE脱パラフィン化、組織溶解、ホモジナイズ、タンパク質抽出、DNA/RNAせん断など、超音波によるFFPEサンプルの大量処理についてご紹介します！超音波によるFFPE組織前処理の利点 – マルチウェルプレートでの大量サンプル処理信頼性の高い研究結果を得るために、高品質なサンプルを大量に得ることができます！そして最後に、時間とお金の節約です！
ハイスループット超音波処理によるFFPEサンプルの調製
ホルマリン固定・パラフィン包埋法（FFPE）は、固形組織を保存・保管するための最も一般的な方法である。FFPE組織サンプルからの生体分子の抽出は、保存されているサンプルの質のために、しばしば大きな困難を伴う。分子生物学や臨床研究においてかけがえのない財産であるこれらのサンプルは、レトロスペクティブ研究や診断バイオマーカーのバリデーションに豊富な生物学的情報を提供する。しかし、ホルマリン固定とパラフィン包埋のプロセスは、組織の構造と形態を保持する一方で、高品質の核酸とタンパク質の抽出を複雑にしている。ホルマリンは核酸やタンパク質の架橋を誘導し、分子の断片化や化学修飾を引き起こす。 ハイスループット超音波装置UIP400MTPがFFPEサンプル前処理の課題をどのように克服したかをご覧ください！
効率的なFFPEサンプル前処理のための超音波装置
- 使いやすいワークフロー：ユーザーフレンドリーな簡素化されたプロセス。
- 脱パラフィン、タンパク質抽出、DNA/RNAシャーリング
- 迅速なハイスループット処理：マルチウェルプレートの効率的なハンドリング
- 効果的な脱パラフィンタンパク質の可溶化を改善。
- 無害な溶剤：キシレンなどの有害な有機溶剤を使用しない。
UIP400MTP 高スループットソニケーター マルチウェルプレートでのハイスループットFFPEサンプル処理用
FFPE組織からのタンパク質抽出技術の進歩
Hielscher Ultrasonicsは、ハイスループットのFFPEサンプル前処理における課題に対応します。ソニケーションは、超音波を用いて機械的振動と集中的キャビテーションを発生させ、細胞構造を効果的に破壊し、生体分子の可溶化を促進します。この技術は、FFPE組織からの核酸およびタンパク質抽出の効率と収率を向上させるだけでなく、ライブラリー調製のためのDNAおよびRNAの剪断を行う能力で人気を博している。UIP400MTPマルチウェルプレートソニケーターを使用した超音波処理により、これらの生体分子の完全性が維持され、下流のアプリケーションに使用できることが非常に重要です。
ハイスループット超音波処理による核酸剪断
ハイスループット環境で使用できるマルチウェル超音波処理装置UIP400MTPは、FFPEサンプルの前処理に新たなレベルをもたらします。このマルチウェルプレート超音波処理法は、複数のサンプルを同時に処理するための効率的で信頼性の高いソリューションを提供します。次世代シーケンシング（NGS）、定量PCR、プロテオミクス解析など、さまざまな分析技術に不可欠なDNA、RNA、タンパク質の迅速かつ再現性の高い抽出を容易にします。超音波処理の振幅、時間、温度などのパラメーターを最適化することで、抽出された生体分子の質と量がさらに向上します。
マルチウェルプレート用UIP400MTPソニケーターは、FFPE組織からのDNAとRNAの断片化とせん断に大きな利点を提供します。このシステムの際立った特徴の一つは、DNAとRNAの狭い断片サイズを達成する能力であり、150～200塩基対（bp）の短い断片または15～20キロ塩基対（kbp）の長い断片を得るために超音波処理の強度を正確に調整することができます。この汎用性により、UIP400MTPはショートリードとロングリードの両方のシーケンスアプリケーションに不可欠であり、次世代シーケンス（NGS）と全ゲノムシーケンス（WGS）の高品質な結果を保証します。フラグメントサイズの正確な制御は、仕様に沿ったサンプル調製を可能にするため、ゲノミクスのあらゆる分野の研究者にとって極めて重要です。
FFPE組織における高度なソリューションに関するお問い合わせ
FFPEサンプルから効率的に生体分子を回収し、抽出した核酸とタンパク質の完全性を維持し、結果の再現性を確保するUIP400MTPマルチウェルプレートソニケーターをご紹介します。この技術は、他の分取・分析ワークフローとシームレスに統合され、FFPE組織アーカイブを使用した分子研究を合理化し、強化します。
固定剤とその効果
固定は、細胞構造を保存し、生化学反応を停止させ、劣化を防ぐサンプル調製の重要なステップである。特定の実験要件に応じて、様々な固定剤が採用される。最も一般的な2つの固定剤はホルムアルデヒドとパラホルムアルデヒドで、タンパク質と核酸を架橋し、細胞や組織の形態と抗原性を保持する。エタノール、メタノール、グルタルアルデヒドのような他の固定剤は、特定の用途に使用される。
ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒド固定剤は、アミノ基間にメチレン架橋を形成し、タンパク質の架橋をもたらす。このプロセスにより、細胞成分が効果的に固定化され、その後の分析ステップの間、その完全性が保たれる。これらの固定剤の効果は、濃度、pH、温度などの因子に影響されることがあり、これらのパラメーターを最適化することは、細胞構造を最適に保存するために極めて重要である。
超音波FFPE調製の利点
超音波処理は、固定された細胞や組織を破壊するための強力な技術であり、従来の技術よりも優れている。従来の溶解法に比べて、いくつかの特筆すべき利点がある：
- スピードと効率： 超音波溶解は、細胞や組織を迅速に破壊するため、機械的または化学的溶解法に比べて処理時間を大幅に短縮できる。超音波プローブから発生する高周波の音波が機械的なせん断力を生み出し、固定された細胞構造を破壊する。この高速かつ効率的な破砕により、研究者は短時間で大量のサンプルを処理することができる。
- 優しく、調節可能： 超音波溶解は、タンパク質、核酸、酵素などの繊細な生体分子への損傷を最小限に抑える、穏やかな破壊メカニズムを提供します。過度の熱やせん断力を発生させる機械的方法とは異なり、超音波溶解は制御されたキャビテーションを利用し、細胞内成分の完全性と機能性を維持しながら細胞を破壊します。
- 汎用性がある： 超音波溶解はさまざまな固定剤に適用できるため、研究者はさまざまな固定サンプルを扱うことができます。ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、代替固定剤のいずれを使用しても、超音波溶解は一貫して効率的な破壊を実現し、細胞成分の最適な回収を保証します。
- 高収量と高品質： 超音波溶解は、固定した細胞や組織を均一に破壊する能力により、インタクトな細胞成分の高い収率を促進する。これにより、タンパク質分析、核酸抽出、酵素アッセイなどの下流工程で、信頼性と再現性の高い結果を得ることができます。
- オートメーションの互換性： 超音波溶解は、自動化システムに容易に組み込むことができ、ハイスループットなサンプル処理を可能にする。この互換性により、研究者はワークフローを合理化し、特に大規模研究において生産性を向上させることができる。
VialTweeter Multi-Tube Sonicatorを使用した脱パラフィンおよびタンパク質抽出の詳細なプロトコルをご覧ください！
96ウェルプレートソニケーター UIP400MTP マイクロタイターおよびマルチウェルプレートの超音波処理用
超音波溶解は、固定化された細胞や組織の破壊に革命をもたらし、従来の溶解法よりも多くの利点を提供している。そのスピード、効率、選択性、多用途性、高い収率、オートメーションへの適合性により、分子生物学やバイオテクノロジー研究において不可欠なツールとなっています。非接触型ソニケーターとプローブ型ソニケーターを提供するHielscher Ultrasonics社は、お客様のライフサイエンス用途に最適な超音波ホモジナイザーを提供します。単一サンプルの処理、複数サンプルの処理、あるいは非常に多くのサンプルを同時に処理したい場合など、お客様の研究・診断要件に合った最適なソニケーターを提供します。
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96ウェルプレート、マイクロタイタープレート、マルチウェルプレート用のプレートソニケーターUIP400MTP。
デザイン、製造、コンサルティング – 品質 ドイツ製
Hielscher社の超音波装置は、その最高の品質と設計基準でよく知られています。頑丈で操作が簡単なため、産業設備にスムーズに組み込むことができます。過酷な条件や厳しい環境でも、Hielscherの超音波装置は容易に対応できます。
Hielscher Ultrasonics社は、ISO認証取得企業であり、最先端の技術と使いやすさを特徴とする高性能超音波振動子に特に重点を置いています。もちろん、Hielscherの超音波装置はCEに準拠しており、UL、CSA、RoHsの要件を満たしています。
お問い合わせ/ お問い合わせ
UIP400MTP 超音波発生器： マルチウェルプレートでのハイスループットFFPEサンプル前処理
よくあるご質問
以下では、FFPE組織の前処理とFFPEサンプルの超音波処理に関連する、よくある質問にお答えします。
FFPE組織はどのように調製するのですか？
FFPE組織調製の手順：高品質のFFPEサンプルを作製するためには、新鮮組織の入念な取り扱いと処理が不可欠である。細胞構造、核酸、タンパク質を確実に保存することは、下流の正確な分析に不可欠です。組織学的検査、免疫組織化学、分子生物学的研究など、さまざまな分析のためにサンプルの完全性を維持するためには、採取から包埋までの各工程で正確さが要求される。この固定と包埋のプロセスが適切に行われることで、保存された組織が生体内の状態を正確に反映するようになり、信頼性の高い診断や研究結果が可能になる。
FFPE組織サンプルのエンベッディングプロセスの6つの主要ステップをご紹介します。
- ティッシュ・コレクション
生きた哺乳動物からの生検と組織培養は、どちらもFFPEサンプル調製のための新鮮な組織を得るための実行可能なソースである。
無菌的手技を用いることが重要である：汚染を避けるため、滅菌した器具と手袋を使用する。理想的には、手術室や層流フードなどの無菌環境で組織を採取する。
標本は非常に壊れやすいので、繊細な取り扱いが不可欠である：処理の遅れは最小限にとどめ、切除後は直ちにその後の組織処理を開始する。これは、自己溶解や分解を防ぐために極めて重要である。組織は室温に保つ。凍結は氷晶形成や組織損傷の原因となるので避ける。 - 組織固定
まず、組織を固定液で処理する：10％中性緩衝ホルマリン（NBF）を使用する。これは水中4％ホルムアルデヒドに相当し、中性pHに緩衝されている。
組織をホルマリンに完全に浸す。固定液と組織の体積比が少なくとも10：1になるようにする。固定時間は組織の種類や大きさにもよるが、通常6～24時間である。固定剤が組織に十分に浸透することが重要である。しかし、過度の固定は架橋を引き起こし、抗原検索を複雑にする可能性があり、一方、過少の固定は組織の保存性を悪くする可能性がある。 - 組織トリミング
次に、固定液が十分に浸透するように、組織を約3～5mmの厚さに切り取る。関連する組織学的構造をとらえるために、組織の向きが適切であることを確認する。こうすることで、後に組織を分析に使用する際の抽出作業が容易になる。 - 固定化サンプルの処理
次に、固定した組織を脱水しなければならない：固定後、パラフィンワックスを十分に浸透させるために、組織を脱水する必要がある。組織を段階的なエタノール（70％、80％、90％、100％）に通し、水分を除去する。
キシレンを使ったクリアリングパラフィンワックスは水に溶けないが、キシレンには溶ける。したがって、組織中の水分をキシレンで置換しなければならない。しかし、キシレン自体は水に溶けないがアルコールには溶けるため、まず水をアルコールで置換する中間工程が必要となる。組織をキシレンまたはキシレン代替物に浸漬してエタノールを除去し、パラフィン浸透の準備をする。
パラフィンを用いた浸潤：組織を溶融パラフィンワックスに包埋し、完全に浸透させる。このステップでは通常、パラフィンを数回交換して完全に含浸させる。 - 組織を埋め込む
このステップでは、組織を組織ブロックに成形する：組織を希望の方向に型に入れ、その上から溶融パラフィンを流し込む。室温またはコールドプレート上で冷却し、パラフィンを固化させる。 - 分割と取り付け
ミクロトミー：包埋組織をスライスするために、ミクロトームを使ってパラフィンブロックから薄い切片（通常4～5マイクロメートル）を切り出す。次にサンプルをマウントし、切片をスライドグラスに載せて、その後の染色と顕微鏡分析を行う。
最後に、組織検査の質をチェックする：最初の切片を顕微鏡で評価し、適切な固定と処理を確認する。組織の種類と観察された品質に基づいて、必要に応じてプロトコルを調整する。
FFPE組織は、RNA、DNA、タンパク質を回収し、癌やその他の疾患の徴候を発見するために使用することができる。FFPE組織は何年も保存可能であり、研究者や医師が診断や研究に組織サンプルを活用する上で不可欠なものである。
FFPE組織の一般的な問題や課題は何ですか？
ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織サンプルは、研究や診断に広く使用されているが、いくつかの課題や共通の問題がある：
- 生体分子の分解： 長時間の固定は、DNA、RNA、タンパク質の分解を引き起こし、下流の用途のために高品質の核酸やタンパク質を抽出することを困難にする。組織の保存には、正しい固定（過不足固定の回避）が不可欠である。
- 抗原マスキング： 固定プロセスは抗原部位をマスキングし、免疫組織化学やその他の免疫学的アッセイにおける抗体結合の有効性を低下させる可能性がある。このような場合、抗原の回収が必要となることが多いが、これはエピトープのマスキングを元に戻し、エピトープと抗体の結合を回復させる処置である。しかし、抗原性が完全に回復するとは限らない。
- 可変的な固定品質： 固定時間や固定条件が異なると、サンプルの品質にばらつきが生じ、結果の再現性や比較可能性に影響します。信頼性の高い固定プロトコルを使用し、過不足固定を避ける。
- DNAの損傷と断片化： FFPEサンプルのホルマリン固定は、シトシン脱アミノ化（CからTへの変異）、酸化的損傷（例えば、GからTへの変異につながる8-オキソグアニン）、DNAポリメラーゼ活性を阻害する刻み目、隙間、アベーシック部位などの物理的障害など、様々な種類のDNA損傷を引き起こす可能性がある。ホルマリン固定はDNAの断片化を引き起こし、PCRや塩基配列決定などの遺伝学的およびゲノム解析を複雑にする。
- RNAの品質： FFPE組織から抽出されたRNAはしばしば断片化し、化学的に修飾されているため、高品質のトランスクリプトーム解析を行うことは困難である。
- タンパク質の修飾： ホルマリンはタンパク質に化学修飾を引き起こし、その構造や機能に影響を与えるため、プロテオミクス解析の妨げになる可能性がある。
- サンプル処理の成果物： 包埋や切片化の過程で、機械的ストレスや熱がアーチファクトを引き起こし、組織にさらなる損傷を与える可能性がある。
- バッチ間のばらつき： 固定と包埋のプロトコールがロットによって異なると、結果に大きなばらつきが生じ、研究間の比較が複雑になる。
- ストレージの問題： FFPEブロックの長期保存は、時間の経過とともにさらなる劣化と核酸の完全性の喪失につながり、遡及的研究のための保存サンプルの生存率に影響を与える可能性がある。
架橋： ホルマリン固定は、タンパク質や核酸の架橋を引き起こし、分子解析を妨げ、免疫組織化学やその他のアッセイの精度に影響を与える。
最適化されたプロトコールを使用し、慎重にサンプルを取り扱い、高度な技術を適用することで、FFPE組織から得られるデータの質と信頼性を向上させることができる。
FFPEと凍結組織の違いは何ですか？
FFPE（ホルマリン固定パラフィン包埋）組織は、ホルマリンを用いて組織を固定し、パラフィンワックスに包埋して保存される。対照的に、凍結組織は凍結によって迅速に保存され、核酸やタンパク質の完全性はよりよく維持されるが、非常に低温での保存が必要となる。
FFPEの包埋にはどのような薬品を使用するのですか？
通常、FFPE包埋に使用される薬品には、固定用のホルマリンと包埋用のパラフィンワックスがある。FFPE包埋のために、組織は通常、10％（v/v）中性緩衝ホルマリン（FA）またはパラホルムアルデヒド粉末から作られた新鮮な4％（w/v）ホルムアルデヒド溶液（PFA）のいずれかを用いて固定される。ホルムアルデヒドの水溶液であるホルマリンは、組織の形態を保持し、過度の架橋を防ぐために中性pHに緩衝化されている。パラホルムアルデヒドベースの溶液はまた、タンパク質を架橋することによって効果的な固定を提供し、それによってその後のパラフィンワックスへの包埋のために組織構造を安定化させる。これらの化学薬品は、固定と包埋の過程で組織の完全性と形態を維持するために不可欠である。
FFPEサンプルからパラフィンはどのように除去されますか？
FFPEサンプルからパラフィンを除去するために、組織切片は通常、一連のキシレン洗浄にかけられ、その後、段階的な一連のアルコール、そして最後に水で再水和される。キシレンは非常に有毒であり、呼吸器系の問題、皮膚刺激、繰り返し暴露による長期的影響の可能性などの健康リスクをもたらすため、超音波によるパラフィン除去が多くの研究室で有望な代替法として浮上している。この方法では、強力な超音波を使用して、キシレンのような有毒な溶剤を使用することなく、パラフィンを効率的かつ安全に除去することができるため、研究室の作業員に対するリスクが軽減され、より安全な作業環境が実現します。
FFPEサンプルの質を高めるには、どのくらいの期間組織を固定すればよいですか？
固定時間に関する一般的な推奨事項では、組織サンプルをホルマリン中で24～48時間固定することが一般的に推奨されている。この時間は一般的に、組織の形態や細胞構造を保持するのに十分であり、同時に過剰固定を最小限に抑えることができ、核酸やタンパク質の過剰な架橋や分解につながる可能性がある。しかし、最適な固定時間は組織の大きさや種類によって異なり、より小さいサンプルやよりデリケートなサンプルでは、より短い固定時間が必要となる。組織の自己分解や分解を防ぐために適切な固定を行う一方で、下流の分子解析を複雑にする可能性のある長時間の固定を避けるという、バランスのとれた固定が極めて重要である。