ट्यूमर ऊतक से Sonication-सहायता प्राप्त प्रोटीन निष्कर्षण – प्रोटोकॉल
यह प्रोटोकॉल ट्यूमर ऊतक के लिए एक sonication-सहायता प्राप्त प्रोटीन निष्कर्षण विधि का वर्णन करता है जो ऊतक व्यवधान के दौरान एक नियंत्रित जांच-sonication कदम जोड़कर मानक CPTAC यूरिया लसीका वर्कफ़्लो को आगे बढ़ाता है। स्थापित गहरे पैमाने पर CPTAC प्रोटिओम और फॉस्फोप्रोटियम तैयारी रणनीति पर निर्माण, यह संशोधन सेल और उप-कोशिकीय संरचना व्यवधान में सुधार करता है, नमूना चिपचिपाहट को कम करता है, और प्रोटीन की रिहाई को बढ़ाता है जो आमतौर पर अकेले यूरिया लसीका के साथ ठीक होने के लिए कठिन होते हैं, विशेष रूप से झिल्ली-बाध्यकारी और डीएनए-बाध्यकारी या नाभिक-संबंधित प्रोटीन। अंतर्निहित अध्ययन में, सोनिकेशन-सहायता प्राप्त वर्कफ़्लो ने डाउनस्ट्रीम सीपीटीएसी-शैली पाचन, टीएमटी लेबलिंग, अंशांकन, फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन और एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण पाइपलाइन के साथ संगतता को संरक्षित करते हुए प्रोटीन और फॉस्फोपेप्टाइड्स दोनों का पता लगाने में वृद्धि की।
गहरे प्रोटिओमिक और फॉस्फोप्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए ट्यूमर ऊतक से सोनिकेशन-असिस्टेड प्रोटीन निष्कर्षण
The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.
अल्ट्रासोनिक जांच UP200St प्रोटिओमिक्स में प्रोटीन निष्कर्षण के लिए
प्रोटोकॉल के लिए आवेदन क्षेत्र
इसके लिए इस प्रक्रिया का उपयोग करें:
- ताजा जमे हुए, क्रायोपुल्वराइज्ड ट्यूमर ऊतक
- सेल छर्रों या अन्य जैविक नमूने जहां यूरिया-आधारित निष्कर्षण पहले से ही स्थापित है
- ट्रिप्टिक पाचन और वैकल्पिक टीएमटी लेबलिंग का उपयोग करके वैश्विक प्रोटिओमिक्स और फॉस्फोप्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो
ली एट अल (2025) के अध्ययन में कहा गया है कि वर्कफ़्लो अन्य नमूना प्रकारों जैसे सेल लाइनों, रक्त और मूत्र पर भी लागू होता है, हालांकि नमूना प्रकार के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
कार्यान्वित sonication कदम के साथ अनुकूलित नमूना तैयारी वर्कफ़्लो। अनुकूलित वर्कफ़्लो और प्रयोगात्मक डिजाइन वैश्विक प्रोटिओमिक और फॉस्फोप्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए सीपीटीएसी नमूना तैयारी प्रोटोकॉल पर आधारित हैं।
अध्ययन और योजना: ©ली एट अल., 2025
काम करने का सिद्धांत
मूल अध्ययन ने मानक CPTAC यूरिया लसीका वर्कफ़्लो में सोनिकेशन जोड़ा और झिल्ली और नाभिक से जुड़े प्रोटीन का बेहतर पता लगाया। लेखकों का कहना है कि sonication मापदंडों नमूना आकार / एकाग्रता के बारे में ठीक किया जाना चाहिए – Sonotrode आकार का चयन करके, ऊर्जा इनपुट, और पल्स टाइमिंग।
अनुकरणीय, Hielscher UP200Ht और UP200St के लिए, इसका मतलब है:
- मुख्य नियंत्रण चर के रूप में आयाम और पल्स मोड का उपयोग करें
- नमूनों को ठंडा रखें (यानी बर्फ पर)
- रूढ़िवादी सेटिंग्स से शुरुआत करें
- नमूना स्पष्टता, तापमान, प्रोटीन उपज और डाउनस्ट्रीम पेप्टाइड गुणवत्ता के खिलाफ अनुकूलन करें
Hielscher 200 वाट सोनिकेटर मॉडल UP200Ht और UP200St दोनों को समायोज्य आयाम और पल्स सेटिंग्स के साथ छोटे और मध्यम नमूना संस्करणों के लिए डिज़ाइन किया गया है; दोनों अल्ट्रासोनिक homogenizers सटीक पैरामीटर समायोजन, स्वचालित डेटा रिकॉर्डिंग, प्लग करने योग्य तापमान सेंसर, रिमोट कंट्रोल, नमूना रोशनी के लिए डिजिटल टचस्क्रीन नियंत्रण प्रदान करते हैं।
Sonication-सहायता प्राप्त प्रोटीन निष्कर्षण के लिए अभिकर्मक
यूरिया लसीका बफर
उपयोग करने से तुरंत पहले ताजा तैयार करें:
- 8 एम यूरिया
- 75 मिमी NaCl
- 50 मिमी ट्रिस, पीएच 8.0
- 1 मिमी ईडीटीए
- 2 माइक्रोग्राम/एमएल एप्रोटीनिन
- 10 माइक्रोग्राम/एमएल ल्यूपेप्टिन
- 1 मिमी पीएमएसएफ
- 10 मिमी NaF
- 20 माइक्रोन PUGNAc
- फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल 2, 1:100 (v/v)
- फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल 3, 1:100 (v/v)
एडिटिव्स जोड़ने से पहले यूरिया को पूरी तरह से भंग कर देना चाहिए; उपयोग करने से तुरंत पहले अवरोधकों को जोड़ा जाना चाहिए; बफर को बर्फ पर रखा जाना चाहिए; और एडिटिव्स जोड़ने के बाद जोरदार भंवर के बजाय घूमने की सिफारिश की जाती है।
अतिरिक्त अभिकर्मक:
- बीसीए प्रोटीन परख अभिकर्मकों
- 50 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0
- डीटीटी
- आयोडोएसिटामाइड
- एलआईएससी
- ट्रिप्सिन
- फॉर्मिक एसिड
- टीएमटी अभिकर्मक, यदि मल्टीप्लेक्स मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स का उपयोग कर रहे हैं
- IMAC अभिकर्मक, अगर फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन कर रहे हैं
अल्ट्रासोनिकेटर UP200Ht माइक्रोटिप S26d2 के साथ नमूना तैयार करने के लिए
Sonication-सहायता प्राप्त प्रोटीन निष्कर्षण के लिए उपकरण
आवश्यक
अनुशंसित जांच चयन
200-1000 माइक्रोन के आसपास के नमूनों के लिए, छोटी मात्रा के प्रत्यक्ष उच्च तीव्रता प्रसंस्करण के लिए उपयुक्त एक छोटे व्यास sonotrode का उपयोग करें। Hielscher कई sonotrode व्यास प्रदान करता है, और छोटे टिप व्यास टिप पर उच्च तीव्रता प्रदान करते हैं।
व्यावहारिक नोट: सबसे छोटी जांच का उपयोग करें जो अत्यधिक झाग या पोत की दीवार के संपर्क के बिना कुशल मिश्रण देता है।
यदि आप एक ही समय में कई नमूनों के साथ काम करते हैं, तो आप विचार कर सकते हैं मल्टी-ट्यूब सोनिकेटर वायलट्वीटर नहीं तो माइक्रोप्लेट सोनिकेटर UIP400MTP!
चरण-दर-चरण निर्देश: सोनिकेशन-असिस्टेड प्रोटीन निष्कर्षण की प्रक्रिया
A. पहले से ठंडा करें और तैयार करें
- अपकेंद्रित्र को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
- ताजा यूरिया लाइसिस बफर तैयार करें और इसे बर्फ पर रखें।
- UP200Ht या UP200St को ध्वनि बाड़े के अंदर एक स्टैंड पर स्थापित करें।
- नमूना ट्यूबों को सीधा और स्थिर रखने के लिए पर्याप्त बड़ा बर्फ स्नान तैयार करें।
ताजा बफर तैयार करना और ठंड से काम करना महत्वपूर्ण है।
बी. प्रारंभिक यूरिया निष्कर्षण
- बर्फ पर cryopulverized ऊतक रखें।
- 50 मिलीग्राम गीले ऊतक में 200 माइक्रोन ठंडा यूरिया लसीका बफर जोड़ें।
- भंवर 5-10 सेकेंड तेज गति पर।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट सेते हैं।
- भंवर-प्लस-ऊष्मायन चरण को एक बार फिर दोहराएं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
- लाइसेट/सतह पर तैरनेवाला को एक साफ कम-बाइंड ट्यूब में स्थानांतरित करें।
C. UP200Ht या UP200St का उपयोग करने के साथ सोनिकेशन
सोनिकेशन के लिए शुरुआती शर्तें
- आयाम: 20-30% से शुरू करें
- पल्स की लंबाई: 5 एस चालू
- शीतलक: दालों के बीच बर्फ पर 2 मिनट
- चक्रों की संख्या: 4 चक्र
- कुल सक्रिय सोनिकेशन समय: 20 एस
- ठंडा करने सहित कुल प्रक्रिया समय: लगभग 8-10 मिनट
सोनिकेशन चरण
- सोनिकेशन के लिए उपयुक्त ट्यूब में लाइसेट स्थानांतरित करें। एक संकीर्ण, पतली दीवार वाली ट्यूब का उपयोग करें जो अच्छे ताप विनिमय और सुरक्षित जांच विसर्जन की अनुमति देती है।
- ट्यूब को बर्फ के स्नान में रखें। कागज गर्मी क्षति को रोकने के लिए sonication के दौरान शीतलन को महत्वपूर्ण मानता है।
- जांच टिप को नमूने में डुबोएं। स्थिर गुहिकायन के लिए टिप को पर्याप्त रूप से जलमग्न रखें, लेकिन इसे ट्यूब की दीवार या नीचे को छूने न दें।
- एक चलाएँ 5 एस पल्स शुरुआती आयाम पर।
- तुरंत 2 मिनट के लिए बर्फ के लिए पूरी तरह से नमूना लौटाएं।
- 4 चक्र पूरे होने तक दोहराएं।
- चक्र के बाद लाइसेट का निरीक्षण करें।
- केवल जरूरत पड़ने पर ही जारी रखें, एक समय में एक अतिरिक्त 5 एस पल्स का उपयोग करें, हमेशा पूर्ण शीतलन के बाद।
- एक बार जब लाइसेट अधिक समान और कम रेशेदार/चिपचिपा हो जाए तो रुकें।
समापन बिंदु एक अधिक पारभासी लाइसेट है जो निरंतर चिपचिपा प्रवाह के बजाय बूंदों का निर्माण करता है। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए लगभग 16,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
- स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
वैश्विक proteomics और फॉस्फोप्रोटिओमिक्स की तुलना sonicated और गैर-sonicated नमूनों के बीच।
a. सभी पीडीएक्स ट्यूमर ऊतकों में पहचाने गए प्रोटीन (वैश्विक प्रोटिओमिक्स) की संख्या सोनिकेशन के साथ या बिना। जन्म। सभी पीडीएक्स ट्यूमर ऊतकों में पहचाने गए फॉस्फोपेप्टाइड्स (आईएमएसी संवर्धन) की संख्या सोनिकेशन के साथ या बिना। केवल 25 वें प्रतिशत से अधिक या उसके बराबर बहुतायत अनुपात वाले प्रोटीन और फॉस्फोपेप्टाइड्स की गणना की गई थी। बहुतायत अनुपात की गणना एक ही प्रकार के नमूनों के बीच की गई थी।
अध्ययन और रेखांकन: ©ली एट अल., 2025
डाउनस्ट्रीम पाचन और विश्लेषण
सोनिकेशन और स्पष्टीकरण के बाद, मूल सीपीटीएसी-शैली वर्कफ़्लो में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें:
- यूरिया को कम करने के लिए 50 मिमी ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0 के साथ लाइसेट 1: 3 (वी / वी) को पतला करें <2 M.
- 50 माइक्रोग्राम प्रोटीन प्रति 1 एमएयू पर एलवाईएससी जोड़ें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे इनक्यूबेट करें।
- 1:49 एंजाइम पर ट्रिप्सिन जोड़ें: सब्सट्रेट (w/w) और 25 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पचाएं।
- फॉर्मिक एसिड के साथ 1% अंतिम तक बुझाएं।
- आवश्यकतानुसार डीसाल्टिंग, टीएमटी लेबलिंग, फ्रैक्शनेशन, फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन और एलसी-एमएस/एमएस जारी रखें।
टीएमटी-लेबल वाले एमएस से फॉस्फोपेप्टाइड्स की विभेदक अभिव्यक्ति।
a. बेसल उपप्रकार, कुछ मानव फॉस्फोपेप्टाइड्स (प्रोटीन-अनुक्रम शुरू और अंत) को उजागर करता है जो नॉनसोनिकेटेड नमूनों की तुलना में सोनिकेटेड नमूनों में अपग्रेड किया जाता है। जन्म। ल्यूमिनल उपप्रकार, कुछ मानव फॉस्फोपेप्टाइड्स (protein_sequence शुरू और अंत) को उजागर करता है, नॉनसोनिकेटेड नमूनों की तुलना में सोनिकेटेड नमूनों में अपग्रेड किया जाता है। c. ट्यूमर के sonicated बेसल उपप्रकार में upregulated फॉस्फोपेप्टाइड्स के प्रोटीन के आधार पर समृद्ध KEGG मार्ग। d. ट्यूमर के sonicated ल्यूमिनल उपप्रकार में अपरेगुलेटेड फॉस्फोपेप्टाइड्स के प्रोटीन के आधार पर समृद्ध KEGG मार्ग।
अध्ययन और रेखांकन: ©ली एट अल., 2025
डिजाइन, विनिर्माण और परामर्श – गुणवत्ता जर्मनी में निर्मित
Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर अपने उच्चतम गुणवत्ता और डिजाइन मानकों के लिए प्रसिद्ध हैं। मजबूती और आसान संचालन औद्योगिक सुविधाओं में हमारे अल्ट्रासोनिकेटर के सुचारू एकीकरण की अनुमति देता है। किसी न किसी स्थिति और मांग वातावरण आसानी से Hielscher ultrasonicators द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं।
Hielscher Ultrasonics एक आईएसओ प्रमाणित कंपनी है और अत्याधुनिक प्रौद्योगिकी और उपयोगकर्ता-मित्रता की विशेषता वाले उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिकेटर पर विशेष जोर देती है। बेशक, Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर सीई के अनुरूप हैं और उल, सीएसए और RoHs की आवश्यकताओं को पूरा करते हैं।
मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP नमूनों से उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन निष्कर्षण के लिए
साहित्य/सन्दर्भ
- Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
- Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
- Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.
अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
प्लांट टिश्यू बनाम स्तनधारी ऊतक से प्रोटीन निष्कर्षण के बीच अंतर क्या है?
पौधे के ऊतकों से प्रोटीन निष्कर्षण आमतौर पर स्तनधारी ऊतक की तुलना में अधिक कठिन होता है क्योंकि पौधों की कोशिकाओं में एक कठोर सेलूलोज-समृद्ध कोशिका भित्ति, प्रचुर मात्रा में पॉलीसेकेराइड, फेनोलिक यौगिक, पिगमेंट और सक्रिय अंतर्जात एंजाइम होते हैं जो प्रोटीन घुलनशीलता में हस्तक्षेप कर सकते हैं, अर्क को दूषित कर सकते हैं, या प्रोटीन क्षरण को बढ़ावा दे सकते हैं। इसके विपरीत, स्तनधारी ऊतक में एक कोशिका भित्ति की कमी होती है और आम तौर पर रासायनिक रूप से बाधित करना आसान होता है, हालांकि इसमें अक्सर अधिक लिपिड, बाह्य मैट्रिक्स और प्रोटीज होते हैं जो अभी भी निष्कर्षण को जटिल बना सकते हैं। नतीजतन, प्लांट प्रोटोकॉल को आमतौर पर मजबूत यांत्रिक व्यवधान, कम तापमान पीसने, और पीवीपीपी, कम करने वाले एजेंटों, या फिनोल-आधारित सफाई जैसे एडिटिव्स की आवश्यकता होती है, जबकि स्तनधारी ऊतक को अक्सर डिटर्जेंट-आधारित बफ़र्स जैसे आरआईपीए या यूरिया-आधारित लसीका सिस्टम के साथ सफलतापूर्वक संभाला जाता है। दोनों, पौधे और स्तनधारी ऊतक, sonication द्वारा कुशलता से lysed किया जा सकता है!
RIPA बफर का उपयोग करके ऊतक से प्रोटीन निष्कर्षण में सुधार कैसे करें?
RIPA बफर के साथ ऊतक से प्रोटीन निष्कर्षण को नमूने के व्यवधान और सुरक्षा दोनों को अनुकूलित करके बेहतर बनाया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण उपाय ऊतक और बफर को ठंडा रखने के लिए हैं, ताजा तैयार प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों का उपयोग करें, लसीका से पहले ऊतक को अच्छी तरह से कीमा या चूर्णित करें, एक उपयुक्त बफर-टू-ऊतक अनुपात बनाए रखें, और घने ऊतक को तोड़ने और चिपचिपाहट को कम करने के लिए होमोजेनाइजेशन या संक्षिप्त जांच सोनिकेशन जैसे यांत्रिक व्यवधान कदम जोड़ें। निष्कर्षण दक्षता में भी सुधार होता है जब lysates आंतरायिक मिश्रण के साथ बर्फ पर ऊष्मायन किया जाता है, इसके बाद अघुलनशील मलबे को हटाने के लिए उच्च गति प्रशीतित सेंट्रीफ्यूजेशन होता है। रेशेदार, लिपिड युक्त, या अत्यधिक संरचित ऊतकों के लिए, एक बार निष्कर्षण को दोहराने या डिटर्जेंट जोखिम समय बढ़ाने से वसूली में सुधार हो सकता है, लेकिन अत्यधिक सोनिकेशन या लंबे समय तक कमरे के तापमान से निपटने से बचा जाना चाहिए क्योंकि वे प्रोटीन को विकृत कर सकते हैं या प्रोटियोलिसिस बढ़ा सकते हैं।
अल्ट्रासोनिक प्रोटीन निष्कर्षण के दौरान क्या सुरक्षा आवश्यकताओं को बनाए रखा जाना चाहिए?
ध्वनि सुरक्षा बॉक्स में या उपयुक्त श्रवण सुरक्षा के साथ जांच sonication करें। स्रोत प्रोटोकॉल विशेष रूप से sonication के दौरान उत्पन्न हानिकारक श्रव्य शोर के बारे में चेतावनी देता है।
आंखों की सुरक्षा, लैब कोट और दस्ताने पहनें।
जांच को त्वचा से दूर रखें और कभी भी स्पलैश सुरक्षा के बिना एक खुले बर्तन को सोनिकेट न करें।
स्थानीय रासायनिक सुरक्षा नियमों के अनुसार पीएमएसएफ और अन्य अवरोधकों को संभालें।
गर्मी से प्रेरित प्रोटीन क्षति को कम करने के लिए नमूने बर्फ पर रखें; पेपर बार-बार तापमान नियंत्रण को महत्वपूर्ण के रूप में पहचानता है।
वायलट्वीटर सोनिकेटर प्रोटिओमिक्स में प्रोटीन निष्कर्षण को तेज और बेहतर बनाता है
Hielscher Ultrasonics से उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक homogenizers बनाती है प्रयोगशाला तक औद्योगिक आकार।