ट्यूमर ऊतक से सोनिकेशन-सहायित प्रोटीन निष्कर्षण – प्रोटोकॉल

यह प्रोटोकॉल ट्यूमर ऊतक के लिए सोनिकेशन-सहायित प्रोटीन निष्कर्षण विधि का वर्णन करता है, जो ऊतक विघटन के दौरान एक नियंत्रित प्रोब-सोनिकेशन चरण जोड़कर मानक CPTAC यूरिया लयन कार्यप्रवाह को उन्नत करती है। व्यापक और गहन विश्लेषण के लिए स्थापित CPTAC प्रोटिओम और फॉस्फोप्रोटिओम तैयारी रणनीति पर आधारित यह संशोधन कोशिकाओं और उपकोशिकीय संरचनाओं के विघटन को बेहतर बनाता है, नमूने की श्यानता कम करता है और उन प्रोटीनों की मुक्ति बढ़ाता है जिन्हें सामान्यतः केवल यूरिया लयन से प्राप्त करना अधिक कठिन होता है, विशेष रूप से झिल्ली-बद्ध तथा DNA से बंधने वाले या केंद्रक से संबद्ध प्रोटीन। आधारभूत अध्ययन में, सोनिकेशन-सहायित कार्यप्रवाह ने प्रोटीनों और फॉस्फोपेप्टाइडों, दोनों की पहचान बढ़ाई और साथ ही आगे की CPTAC-शैली की पाचन, TMT लेबलिंग, प्रभाजन, फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन और LC-MS/MS विश्लेषण प्रक्रिया के साथ अनुकूलता बनाए रखी।

गहन प्रोटिओमिक और फॉस्फोप्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए ट्यूमर ऊतक से सोनिकेशन-सहायित प्रोटीन निष्कर्षण

निम्नलिखित प्रोटोकॉल 8 M यूरिया लयन बफर में अतिशीत अवस्था में चूर्णित ट्यूमर ऊतक से प्रोटीनों के निष्कर्षण के लिए अनुकूलित है: जोड़ा गया प्रोब-प्रकार का सोनिकेशन चरण पाचन और आगे के LC-MS/MS विश्लेषण से पहले कठिनाई से प्राप्त होने वाले प्रोटीन वर्गों, विशेष रूप से झिल्ली से संबद्ध तथा DNA/केंद्रक से संबद्ध प्रोटीनों, की प्राप्ति में सुधार करता है। Li et al. (2025) के आधारभूत अध्ययन में, सोनिकेशन जोड़ने से झिल्ली और केंद्रक से संबद्ध प्रोटीनों की पहचान बढ़ी और उनके कार्यप्रवाह के अंतर्गत >12,000 प्रोटीनों और >25,000 फॉस्फोपेप्टाइडों का व्यापक और गहन विश्लेषण संभव हुआ।

प्रोटोकॉल का अनुप्रयोग क्षेत्र

इस प्रक्रिया का उपयोग इनके लिए करें:

• ताज़ा जमाया गया, अतिशीत अवस्था में चूर्णित ट्यूमर ऊतक
• कोशिका पेलेट या अन्य जैविक नमूने जिनके लिए यूरिया-आधारित निष्कर्षण पहले से स्थापित है
• ट्रिप्सिन द्वारा पाचन और वैकल्पिक TMT लेबलिंग का उपयोग करने वाले समग्र प्रोटिओमिक्स और फॉस्फोप्रोटिओमिक्स कार्यप्रवाह

Li et al. (2025) के अध्ययन के अनुसार, यह कार्यप्रवाह कोशिका लाइनों, रक्त और मूत्र जैसे अन्य प्रकार के नमूनों पर भी लागू होता है, हालांकि नमूने के प्रकार के अनुसार अनुकूलन आवश्यक हो सकता है।

सोनिकेशन चरण को शामिल करते हुए अनुकूलित नमूना तैयारी कार्यप्रवाह। अनुकूलित कार्यप्रवाह और प्रायोगिक रूपरेखा समग्र प्रोटिओमिक और फॉस्फोप्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए CPTAC नमूना तैयारी प्रोटोकॉल पर आधारित हैं।
अध्ययन और आरेख: ©Li et al., 2025

कार्य सिद्धांत

मूल अध्ययन में मानक CPTAC यूरिया लयन कार्यप्रवाह में सोनिकेशन जोड़ा गया और झिल्लियों तथा केंद्रकों से संबद्ध प्रोटीनों की पहचान में सुधार पाया गया। लेखकों के अनुसार, नमूने के आकार/सांद्रता को ध्यान में रखते हुए सोनिकेशन मापदंडों का सूक्ष्म समायोजन करना आवश्यक है – इसके लिए सोनोट्रोड का आकार, ऊर्जा निवेश और पल्स का समय निर्धारण चुना जाता है।

उदाहरण के लिए, Hielscher UP200Ht और UP200St के संदर्भ में इसका अर्थ है:

• आयाम और पल्स मोड को मुख्य नियंत्रण चरों के रूप में उपयोग करें
• पूरी प्रक्रिया के दौरान नमूनों को ठंडा रखें (अर्थात बर्फ पर)
• कम तीव्रता वाली सेटिंग से शुरुआत करें
• नमूने की स्पष्टता, तापमान, प्रोटीन की प्राप्त मात्रा और आगे प्राप्त होने वाले पेप्टाइडों की गुणवत्ता के आधार पर अनुकूलन करें

 
Hielscher के दोनों 200 वाट सोनिकेटर मॉडल UP200Ht और UP200St छोटे और मध्यम आयतन वाले नमूनों के लिए बनाए गए हैं तथा इनमें आयाम और पल्स सेटिंग समायोजित की जा सकती हैं; दोनों अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र मापदंडों के सटीक समायोजन के लिए डिजिटल टचस्क्रीन नियंत्रण, स्वचालित डेटा रिकॉर्डिंग, प्लग से जोड़ा जा सकने वाला तापमान सेंसर, रिमोट नियंत्रण और नमूने के लिए प्रकाश व्यवस्था प्रदान करते हैं।
 

सोनिकेशन-सहायित प्रोटीन निष्कर्षण के लिए अभिकर्मक

यूरिया लयन बफर

उपयोग से ठीक पहले ताज़ा तैयार करें:

• 8 M यूरिया
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8.0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL एप्रोटिनिन
• 10 µg/mL ल्यूपेप्टिन
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• फॉस्फेटेज़ अवरोधक कॉकटेल 2, 1:100 (v/v)
• फॉस्फेटेज़ अवरोधक कॉकटेल 3, 1:100 (v/v)

योजक मिलाने से पहले यूरिया का पूरी तरह घुल जाना आवश्यक है; अवरोधक उपयोग से ठीक पहले मिलाने चाहिए; बफर को बर्फ पर रखना चाहिए; और योजक मिलाने के बाद तेज़ वॉर्टेक्स मिश्रण के बजाय हल्के गोलाकार घुमाव से मिलाने की सलाह दी जाती है।
 

अतिरिक्त अभिकर्मक:

• BCA प्रोटीन परख अभिकर्मक
• 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
• DTT
• आयोडोएसीटामाइड
• LysC
• ट्रिप्सिन
• फॉर्मिक अम्ल
• TMT अभिकर्मक, यदि मल्टीप्लेक्स मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स का उपयोग कर रहे हों
• IMAC अभिकर्मक, यदि फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन कर रहे हों

सोनिकेशन-सहायित प्रोटीन निष्कर्षण के लिए उपकरण

आवश्यक

अनुशंसित प्रोब चयन

लगभग 200–1000 µL के नमूनों के लिए, छोटे आयतन के प्रत्यक्ष उच्च-तीव्रता प्रसंस्करण हेतु उपयुक्त छोटे व्यास वाले सोनोट्रोड का उपयोग करें। Hielscher कई व्यासों में सोनोट्रोड प्रदान करता है, और छोटे व्यास वाली टिप्स टिप पर अधिक तीव्रता प्रदान करती हैं।

व्यावहारिक सुझाव: ऐसी सबसे छोटी प्रोब का उपयोग करें जो अत्यधिक झाग बनाए बिना या पात्र की दीवार को छुए बिना प्रभावी मिश्रण प्रदान करे।

यदि आप एक ही समय में कई नमूनों पर काम करते हैं, तो आप मल्टी-ट्यूब सोनिकेटर VialTweeter या माइक्रोप्लेट सोनिकेटर UIP400MTP पर विचार कर सकते हैं!

चरण-दर-चरण निर्देश: सोनिकेशन-सहायित प्रोटीन निष्कर्षण की प्रक्रिया

A. पहले ठंडा करें और तैयारी करें

1. सेंट्रीफ्यूज को 4°C तक ठंडा करें।
2. ताज़ा यूरिया लायसिस बफर तैयार करें और उसे बर्फ पर रखें।
3. UP200Ht या UP200St को ध्वनिरोधी आवरण के भीतर एक स्टैंड पर स्थापित करें।
4. इतना बड़ा बर्फ स्नान तैयार करें कि उसमें नमूना ट्यूबें सीधी और स्थिर रखी जा सकें।

ताज़ा बफर तैयार करना और नमूनों को ठंडा रखते हुए संभालना अत्यंत आवश्यक है।

B. प्रारंभिक यूरिया निष्कर्षण

1. अति-निम्न तापमान पर चूर्णित ऊतक को बर्फ पर रखें।
2. प्रति 50 mg गीले ऊतक में 200 µL ठंडा यूरिया लायसिस बफर मिलाएँ।
3. उच्च गति पर 5–10 s तक वॉर्टेक्स करें।
4. 4°C पर 15 min तक इन्क्यूबेट करें।
5. वॉर्टेक्स करने और फिर इन्क्यूबेट करने का चरण एक बार और दोहराएँ।
6. 4°C पर 20,000g पर 10 min तक सेंट्रीफ्यूज करें।
7. लाइसेट/अधिप्लवी द्रव को एक साफ़, कम प्रोटीन बंधन वाली ट्यूब में स्थानांतरित करें।

C. UP200Ht या UP200St का उपयोग करके सोनिकेशन

सोनिकेशन के लिए प्रारंभिक स्थितियाँ

• आयाम: 20–30% से शुरू करें
• पल्स अवधि: 5 s चालू
• शीतलन: पल्सों के बीच बर्फ पर 2 min
• चक्रों की संख्या: 4 चक्र
• कुल सक्रिय सोनिकेशन समय: 20 s
• शीतलन सहित कुल प्रक्रिया समय: लगभग 8–10 min

सोनिकेशन के चरण

1. लाइसेट को सोनिकेशन के लिए उपयुक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक संकरी, पतली दीवार वाली ट्यूब का उपयोग करें जो अच्छा ऊष्मा विनिमय और प्रोब को सुरक्षित रूप से डुबोना संभव बनाए।
2. ट्यूब को बर्फ स्नान में रखें। शोधपत्र में ऊष्मा से होने वाली क्षति रोकने के लिए सोनिकेशन के दौरान शीतलन को अत्यंत आवश्यक बताया गया है।
3. प्रोब की टिप को नमूने में डुबोएँ। स्थिर कैविटेशन के लिए टिप को पर्याप्त गहराई तक डुबोकर रखें, लेकिन उसे ट्यूब की दीवार या तली को छूने न दें।
4. प्रारंभिक आयाम पर 5 s की एक पल्स चलाएँ।
5. नमूने को तुरंत वापस पूरी तरह बर्फ में 2 min के लिए रखें।
6. 4 चक्र पूरे होने तक दोहराएँ।
7. चक्र के बाद लाइसेट का निरीक्षण करें।
8. केवल आवश्यकता होने पर ही जारी रखें, एक बार में 5 s की एक अतिरिक्त पल्स दें और हर बार उसके बाद पूरी तरह ठंडा करें।
9. लाइसेट अधिक एकसमान हो जाने और उसका तार खींचने जैसा व्यवहार/श्यानता कम हो जाने पर रुकें।
   अंतिम अवस्था अधिक पारभासी लाइसेट की है, जो निरंतर श्यान धारा के बजाय बूँदें बनाता है।
10. 4°C पर लगभग 16,000g पर 15 min तक सेंट्रीफ्यूज करें।
11. स्पष्ट किए गए अधिप्लवी द्रव को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और प्रोटीन सांद्रता मापें।

सोनिकेशन किए गए और सोनिकेशन न किए गए नमूनों के बीच वैश्विक प्रोटिओमिक्स और फॉस्फोप्रोटिओमिक्स की तुलना।
a. सोनिकेशन के साथ या उसके बिना सभी PDX ट्यूमर ऊतकों में पहचाने गए प्रोटीनों की संख्या (वैश्विक प्रोटिओमिक्स)। b. सोनिकेशन के साथ या उसके बिना सभी PDX ट्यूमर ऊतकों में पहचाने गए फॉस्फोपेप्टाइडों की संख्या (IMAC संवर्धन)। केवल उन प्रोटीनों और फॉस्फोपेप्टाइडों को गिना गया जिनका प्रचुरता अनुपात 25वें प्रतिशतक से अधिक या उसके बराबर था। प्रचुरता अनुपात की गणना समान प्रकार के नमूनों के बीच की गई थी।
अध्ययन और ग्राफ़: ©Li et al., 2025

आगे का पाचन और विश्लेषण

सोनिकेशन और स्पष्टीकरण के बाद, मूल CPTAC-शैली की कार्यप्रणाली में बताए अनुसार आगे बढ़ें:

1. यूरिया को <2 M तक कम करने के लिए लाइसेट को 50 mM Tris-HCl pH 8.0 से 1:3 (v/v) के अनुपात में तनु करें।
2. प्रति 50 µg प्रोटीन में 1 mAU LysC मिलाएँ और 25°C पर 2 h तक इन्क्यूबेट करें।
3. 1:49 एंजाइम:सब्सट्रेट (w/w) अनुपात में ट्रिप्सिन मिलाएँ और 25°C पर रात भर पाचन करें।
4. फॉर्मिक अम्ल मिलाकर उसकी अंतिम सांद्रता 1% करें और अभिक्रिया रोकें।
5. आवश्यकतानुसार लवण हटाने, TMT लेबलिंग, अंशांकन, फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन और LC-MS/MS की प्रक्रिया आगे बढ़ाएँ।

TMT-लेबलित MS से प्राप्त फॉस्फोपेप्टाइडों की विभेदक अभिव्यक्ति।
a. बेसल उपप्रकार, जिसमें कुछ मानव फॉस्फोपेप्टाइडों (protein-sequence का आरंभ और अंत) को दर्शाया गया है जिनकी अभिव्यक्ति बिना सोनिकेशन वाले नमूनों की तुलना में सोनिकेशन किए गए नमूनों में बढ़ी हुई है। b. ल्यूमिनल उपप्रकार, जिसमें कुछ मानव फॉस्फोपेप्टाइडों (protein_sequence का आरंभ और अंत) को दर्शाया गया है जिनकी अभिव्यक्ति बिना सोनिकेशन वाले नमूनों की तुलना में सोनिकेशन किए गए नमूनों में बढ़ी हुई है। c. सोनिकेशन किए गए बेसल उपप्रकार के ट्यूमर में बढ़ी हुई अभिव्यक्ति वाले फॉस्फोपेप्टाइडों के प्रोटीनों पर आधारित संवर्धित KEGG मार्ग। d. सोनिकेशन किए गए ल्यूमिनल उपप्रकार के ट्यूमर में बढ़ी हुई अभिव्यक्ति वाले फॉस्फोपेप्टाइडों के प्रोटीनों पर आधारित संवर्धित KEGG मार्ग।
अध्ययन और ग्राफ़: ©Li et al., 2025

डिज़ाइन, विनिर्माण और परामर्श – जर्मनी में निर्मित गुणवत्ता

Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर अपनी उच्चतम गुणवत्ता और डिज़ाइन मानकों के लिए प्रसिद्ध हैं। मज़बूती और आसान संचालन के कारण हमारे अल्ट्रासोनिकेटरों को औद्योगिक संयंत्रों में सुचारु रूप से एकीकृत किया जा सकता है। Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर कठोर परिस्थितियों और चुनौतीपूर्ण परिवेशों में आसानी से काम करते हैं।

Hielscher Ultrasonics एक ISO प्रमाणित कंपनी है और अत्याधुनिक तकनीक तथा उपयोग में आसानी वाले उच्च प्रदर्शन के अल्ट्रासोनिकेटरों पर विशेष ज़ोर देती है। बेशक, Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर CE के अनुरूप हैं और UL, CSA तथा RoHs की आवश्यकताओं को पूरा करते हैं।

साहित्य / संदर्भ

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.