सी की अल्ट्रासोनिक तैयारी एलिगेंस नमूने

एलिगेंस, एक नेमाटोड कीड़ा, जीव विज्ञान में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल जीव है। विश्लेषण से पहले नमूना तैयार करने के लिए lysis, प्रोटीन और लिपिड निष्कर्षण के साथ-साथ आरएनए विखंडन की आवश्यकता होती है, जिसे सोनिकेशन के माध्यम से मज़बूती से किया जा सकता है। अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान सी एलिगेंस नमूनों की तेजी से तैयारी के लिए विश्वसनीय, परिष्कृत और उपयोग में आसान उपकरण हैं।

सी की अल्ट्रासोनिक तैयारी एलिगेंस नमूने

एलिगेंस राउंडवॉर्म हैं, जिनका व्यापक रूप से अनुसंधान प्रयोगशालाओं में जीनोमिक्स, विकासात्मक जीव विज्ञान और रोगों की जांच के लिए उपयोग किया जाता है। सी एलिगेंस के जीनोम में कई जीन मनुष्यों में कार्यात्मक समकक्ष हैं। इस प्रकार, नेमाटोड कृमि मानव रोगों के लिए एक अत्यंत उपयोगी मॉडल है। सी. एलिगेंस के व्यापक उपयोग के लिए अन्य लाभ बैक्टीरिया युक्त प्लेटों पर इसकी आसान और सस्ती खेती कर रहे हैं (जैसे, ई कोलाई), इसकी पारदर्शिता, सुविधाजनक हैंडलिंग, साथ ही एक लंबी अवधि के लिए कीड़े फ्रीज और स्टोर करने की संभावना.
प्रोटीन और लिपिड विश्लेषण प्रयोगशालाओं में नियमित प्रक्रियाएं हैं और अल्ट्रासोनिक नमूना तैयार करना हर विकास चरण (यानी भ्रूण, लार्वा एल 1-एल 4, वयस्कों) में सी. एलिगेंस नेमाटोड को लाइज़ करने की स्थापित विधि है। चूंकि सी. एलिगेंस भी अधिक व्यक्त लक्षित प्रोटीन के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली के रूप में प्रयोग किया जाता है, एक विश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य lysis और प्रोटीन निष्कर्षण विधि, जो उच्च प्रोटीन पैदावार देता है, की आवश्यकता है. अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान और निष्कर्षण प्रणाली जांच-प्रकार homogenizers के रूप में और बहु नमूना ultrasonicators के रूप में उपलब्ध हैं। सुविधाजनक नमूना तैयार करने और सभी प्रकार के नमूना आकार संख्याओं के लिए खानपान, Hielscher Ultrasonics में आपकी प्रयोगशाला प्रक्रिया के लिए आदर्श अल्ट्रासोनिक सेल विघटनकर्ता है।

अल्ट्रासोनिक सी. एलिगेंस Lysis के लिए

कृमि समरूप की तैयारी
प्रोटीन निष्कर्षण
लिपिड निष्कर्षण
प्रोटीन की मात्रा का ठहराव
इम्यूनोप्रिपिटेशन
वेस्टर्न ब्लॉटिंग
आरएनए निष्कर्षण
एंजाइमेटिक परख

अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर UP200ST पर VialTweeter

वायलट्वीटर 10 टेस्ट ट्यूबों के एक साथ sonication के लिए बहु नमूना तैयारी इकाई.

सी के लिए अल्ट्रासोनिक प्रोटोकॉल एलिगेंस व्यवधान और Lysis

अल्ट्रासोनिक homogenization और सी के lysis एलिगेंस और बाद में प्रोटीन और लिपिड निष्कर्षण विभिन्न homogenization और lysis बफर आदि का उपयोग कर अलग प्रक्रियाओं का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है. सभी lysis प्रोटोकॉल आम है कि नमूनों लगातार प्रोटीन गिरावट को रोकने के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए. नीचे, हम आपको उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन- या लिपिड युक्त सी एलिगेंस नमूनों की तैयारी के लिए कुछ विश्वसनीय और तेजी से अल्ट्रासोनिक लसीका और निष्कर्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

अल्ट्रासोनिक सी. एलिगेंस Lysis के लाभ

भरोसेमंद देखिए।
पुनुरुत्पादनीय
सटीक तापमान-नियंत्रित
विश्वसनीय प्रक्रिया नियंत्रण
कोमल विधि
लगाने में आसान
विश्‍वसनीय

सी से अल्ट्रासोनिक प्रोटीन निष्कर्षण एलिगेंस नमूने

अल्ट्रासोनिक lysis और सी एलिगेंस कीड़े के प्रोटीन निष्कर्षण विभिन्न प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है. नीचे हम आपको प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटीन निष्कर्षण परिणामों के लिए कुछ विश्वसनीय और तेजी से lysis प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

से साइटोसोलिक निकालने का तेजी से तैयारी सी. एलिगेंस Sonication द्वारा कीड़े

निम्नलिखित प्रोटोकॉल के साथ आप कम से कम 30 मिनट में सी एलिगेंस lysates तैयार कर सकते हैं.
सी. एलिगेंस का संग्रह
एक 1.5ml ट्यूब फॉस्फेट खारा (पीबीएस) में वांछित सी एलिगेंस कीड़े उठाओ या 1.5ml पीबीएस के साथ एक थाली से उन्हें धो लें. गोली के लिए 2000rpm पर 1min के लिए अपकेंद्रित्र। बर्फ पर हर समय नमूने रखें.
फिर, पीबीएस के साथ दो बार कीड़े धो लें.
बाद में, कीड़े ddH के साथ दो बार धो लें₂O.
होमोजेनाइजेशन बफर (एचबी) के कम से कम 500ul में कीड़े को फिर से निलंबित करें। कृमि के नमूने अब अल्ट्रासोनिक lysis के लिए तैयार हैं।
उच्च प्रोटीन निकालने की गुणवत्ता के लिए, आप पीबीएस और बाँझ, अल्ट्रा शुद्ध पानी (डीडीएच) में प्रत्येक 5min के लिए कीड़े धोने से जीवाणु संदूषण को कम करना चाहते हो सकता है₂ओ) या सुक्रोज फ्लोटेशन करते हैं। बर्फ पर लगातार कृमि के नमूने रखें.

अल्ट्रासोनिक सी. एलिगेंस Lysis प्रोटोकॉल

सुनिश्चित करें कि आप अल्ट्रासोनिकेटर अपफ्रंट तैयार करते हैं ताकि अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र उपयोग के लिए तैयार हो (जांच घुड़सवार, सोनीशन प्रोग्राम प्री-सेट)।

यदि आपका अल्ट्रासोनिकेटर स्टैंड-माउंटेड है, तो अल्ट्रासोनिक जांच के तहत अपने नमूना ट्यूबों के साथ बर्फ-स्नान रखें और अल्ट्रासोनिक जांच को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में डालें।

सी के लिए UP200St या UP200Ht के साथ एलिगेंस lysis, ultrasonication एक microtip का उपयोग कर किया जाना चाहिए (जैसे, 2mm जांच S26d2; चित्र छोड़ दिया देखें) बीच में 30sec ठहराव के साथ 1sec के लिए 40% आयाम पर. 30sec ठहराव के साथ प्रत्येक 1 सेकंड के लिए 5 sonication चक्र सी एलिगेंस lysis के लिए आदर्श हैं. यदि आप पहली बार lysis प्रदर्शन, आप एक खुर्दबीन का उपयोग कर प्रत्येक नाड़ी के बाद नमूना के छोटे aliquots में lysis प्रगति की जांच कर सकते हैं.
कीड़े बाधित होने पर लसीका सफलतापूर्वक पूरा हो जाता है। ओवर-सोनिकेशन के परिणामस्वरूप नाभिक का टूटना होता है और जब नमूना चिपचिपा या झाग हो जाता है तो यह दिखाई देता है। नमूना गिरावट को रोकने के लिए, यदि आवश्यक हो तो अधिक दालों का उपयोग करें। उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन अर्क प्राप्त करने के लिए प्रत्येक अल्ट्रासोनिक पल्स चक्र के समय में वृद्धि न करें।
4ºC पर 10min के लिए 14,000rpm पर अल्ट्रासोनिक lysed कीड़े centrifuging द्वारा स्पष्ट सेल lysate.
फिर, सतह पर तैरनेवाला एक ताजा ट्यूब के लिए स्थानांतरण और immunoprecipitation या अन्य assays के लिए तैयार.

होमोजेनाइजेशन बफर के लिए नोट: उपरोक्त अल्ट्रासोनिक लाइसिस प्रोटोकॉल के लिए होमोजेनाइजेशन बफर तैयार करें:

15 मिमी हेप्स पीएच 7.6 – 0.5 एम के 15 मिलीलीटर

10 एमएम केसीएल – 2 एम के 2.5 मिलीलीटर

1.5 मिमी MgCl2 – 01 एम के .75 मिलीलीटर

0.1 एमएम ईडीटीए – 0.5 एम का 100 उल

0.5 एमएम ईजीटीए – 0.1 एम के 2.5 मिलीलीटर

44 मिमी सुक्रोज – 50% के 14.7 मिलीलीटर

उपयोग करने से ठीक पहले जोड़ें: 1mM DTT – 1M का 1000x

प्लस एक प्रोटीज अवरोधक

यह ट्यूटोरियल बताता है कि प्रयोगशालाओं, विश्लेषण और अनुसंधान में आपके नमूना तैयारी कार्यों जैसे कि lysis, सेल व्यवधान, प्रोटीन अलगाव, डीएनए और आरएनए विखंडन के लिए किस प्रकार का सोनिकेटर सबसे अच्छा है। अपने आवेदन, नमूना मात्रा, नमूना संख्या और थ्रूपुट के लिए आदर्श सोनिकेटर प्रकार चुनें। Hielscher Ultrasonics आप के लिए आदर्श अल्ट्रासोनिक homogenizer है!

विज्ञान और विश्लेषण में सेल व्यवधान और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए सही सोनिकेटर कैसे खोजें

सी. के उच्च throughput lysis 96-वेल प्लेट्स में एलिगेंस UIP400MTP प्लेट Sonicator का उपयोग

C. एलिगेंस Lysis (वयस्क नेमाटोड)
UIP400MTP 80% आयाम, 20 चक्र (प्रत्येक सोनीशन चक्र: 30 सेकंड चालू, 30 सेकंड बंद)
लाइसिस बफर:

विकल्प 1) 4% एसडीएस, 0.1 एम ट्रिस/एचसीएल पीएच 8.0, 1 एमएम ईडीटीए
विकल्प 2) सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन (सह-आईपी) के लिए: 10 एमएम ट्रिस एचसीएल (पीएच 7.5), 150 एमएम एनएसीएल, 0.5 एमएम ईडीटीए, 0.5% एनपी -40 (पूर्ण प्रोटीनेज अवरोधक कॉकटेल)

उच्च-थ्रूपुट डीएनए विखंडन
सी एलिगेंस (वयस्क नेमाटोड) डीएनए 200-300bp: UIP400MTP प्लेट सोनिकेटर – 80% आयाम, 30 दालों सेट करें – प्रत्येक 30 सेकंड चालू, 30 सेकंड बंद

UIP400MTP उच्च throughput नमूना तैयार करने के लिए प्लेट Sonicator: UIP400MTP समान रूप से बहु अच्छी तरह से, microtiter प्लेटों और 96 अच्छी तरह से प्लेटों कोशिकाओं को बाधित, प्रोटीन निकालने, डीएनए, शाही सेना और अल्फा synuclein तंतु विखंडित में नमूनों sonicates.

UIP400MTP उच्च throughput नमूना तैयार करने के लिए प्लेट Sonicator समान रूप से बहु अच्छी तरह से, microtiter प्लेटों और 96 अच्छी तरह से प्लेटों में नमूने sonicates

सी के अल्ट्रासोनिक Lysis. मात्रात्मक आत्मीयता शुद्धि परख के लिए एलिगेंस

सी. एलिगेंस भ्रूण (∼2 मिलियन प्रति प्रतिकृति) को जैविक ट्रिप्लिकेट में युवा ग्रेविड हेर्मैफ्रोडाइट्स को ब्लीच करके और बर्फ पर सोनिकेटेड (चक्र: 0.5 एस, आयाम: 40-45%, 5 स्ट्रोक / सत्र, 5 सत्र, सत्रों के बीच अंतराल: 30 एस; UP200S अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर माइक्रो-टिप S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) के साथ lysis बफर में (कुल मात्रा: ∼600 μl; 50 मिमी Tris-HCl, पीएच 7.4, 100 मिमी KCl, 1 मिमी MgCl2, 1 मिमी EGTA, 1 मिमी DTT, 10% ग्लिसरॉल, प्रोटीज अवरोधक मिश्रण, 0.1% Nonidet P-40 विकल्प)। सोनिकेशन के बाद, नोनिडेट पी -40 सब्स्टीट्यूट को 1% तक जोड़ा गया था और लाइसेट्स को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूंछ रोटेशन पर सिर के साथ इनक्यूबेट किया गया था, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए 20,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया था। साफ़ लाइसेट को तब ऊपरी लिपिड परत को परेशान किए बिना महाप्राण किया गया था और आधे से या तो एंटी-जीएफपी एगरोज मोती या अवरुद्ध नियंत्रण मोती (40-50 μl) में विभाजित किया गया था। 60-90 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूंछ रोटेशन पर सिर के बाद, मोतियों को एक बार 0.1% नोनिडेट पी -40 विकल्प युक्त लिसिस बफर के साथ धोया गया था, इसके बाद बफर I (25 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4, 300 मिमी NaCl, 1 मिमी MgCl2) या बफर II (1 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी MgCl2) या दोनों। जीएफपी के लिए: एमबीके -2 पुल-डाउन, दो अलग-अलग प्रयोग अलग-अलग धोने की स्थिति का उपयोग करके किए गए थे। प्रोटीन कमरे के तापमान पर 6 मीटर यूरिया / 2 एम थियोरिया के 50 μl में कक्षीय मिलाते हुए eluted थे. एमबीके-1 :: जीएफपी पुल-डाउन प्रयोगों के लिए, प्रोटीन को 90 डिग्री सेल्सियस पर 8 मीटर गुआनिडिनियम क्लोराइड के 50μl में मिलाते हुए दो बार एल्यूट किया गया था, इसके बाद इथेनॉल वर्षा हुई थी। एल्यूटेड प्रोटीन के नमूनों को तब समाधान में पचाया गया था।
चेन एट अल।

सोनोट्रोड एमटीपी -24-8-96 में माइक्रोटिटर प्लेटों के कुओं के सोनिकेशन के लिए आठ अल्ट्रासोनिक जांच हैं।

अल्ट्रासोनिक कृमि Homogenization और Lysis

C.elegans lysis और प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रिया के लिए, प्रासंगिक चरण के 30,000 नेमोटोड नमूना प्रति एकत्र किए गए थे और बर्फ-ठंडे एस-बेसल में धोया गया था, जो 2 मिनट के लिए 1500 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा केंद्रित था, अवशिष्ट बैक्टीरिया को हटाने के लिए बर्फ-ठंडे एस-बेसल के साथ छह बार धोया गया था, और फिर उपयोग के लिए तैयार होने तक बर्फ पर संग्रहीत किया गया था। प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, ग्रेविड-वयस्क कीड़े को अंतिम एस-बेसल धोने के बाद एक कॉम्पैक्ट गोली बनाने की अनुमति दी गई थी। कृमि छर्रों तो बर्फ ठंड निष्कर्षण बफर के 1 मिलीलीटर में resuspended थे [20 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 7.4, 2 मिमी EDTA, 1% ट्राइटन-X-100, प्रोटीज अवरोधकों (सिग्मा P2714)] और तुरंत संसाधित.
∼30,000 ग्रेविड-वयस्क कीड़े (∼100 मिलीग्राम गीले वजन के अनुरूप), बर्फ पर एक जांच-प्रकार अल्ट्रासोनिकेटर (जैसे माइक्रोटिप एमएस 2 के साथ UP50H) का उपयोग करके बर्फ पर 3 सेकंड के 10 चक्रों के लिए 40% आयाम पर, 30 सेकंड बंद, बर्फ-ठंड निष्कर्षण बफर के 1 मिलीलीटर में। (सीएफ. बस्करन एवं अन्य 2012)

सी से अल्ट्रासोनिक लिपिड निष्कर्षण

लिपिडोमिक्स में, मेटाबोलॉमिक्स की एक शाखा, जैविक प्रणालियों के लिपिड पूरक की विशेषता और विश्लेषण किया जाता है। सी. एलिगेंस व्यापक रूप से लिपिडोमिक्स में उपयोग किया जाता है चयापचय लिपिड की बातचीत और स्वास्थ्य और जीवन काल पर उनके प्रभावों की जांच करने के लिए.
अल्ट्रासोनिक lysis और निष्कर्षण इस तरह के सी एलिगेंस भ्रूण, लार्वा और वयस्क कीड़े से स्फिंगोलिपिड्स जैसे लिपिड जारी करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अल्ट्रासोनिकेशन का उपयोग कृमि होमोजेनेट्स तैयार करने और बाद में नमूने से लिपिड निकालने के लिए किया जाता है।
सी से अल्ट्रासोनिक लिपिड निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल. एलिगेंस
पिघलना सी. बर्फ पर एलिगेंस गोली और 0.5 मिलीलीटर ultrawater के साथ फिर से निलंबित करें.  1,5mL टेस्ट ट्यूबों में सी एलिगेंस के नमूनों को सोनिकेट करें, जबकि नमूनों को लगातार बर्फ पर रखें।
Sonication इस तरह के रूप में एक जांच ultrasonicstor का उपयोग किया जा सकता है यूपी200एचटी, अल्ट्रासोनिक नमूना प्रस्तुत करने की इकाई वायलट्वीटर (10 नमूनों का एक साथ सोनिकेशन) या UIP400MTP (96-वेल प्लेट्स जैसे मल्टी-वेल प्लेट्स के सोनिकेशन के लिए)। UP200Ht के साथ अल्ट्रासोनिक lysis के लिए माइक्रो-टिप S26d2 का उपयोग करें। डिजिटल मेनू में अल्ट्रासोनिक चक्र मोड को प्री-सेट करें। प्रत्येक अल्ट्रासोनिक धड़कन फट के बीच 30 सेकंड के ठहराव के साथ 20 चक्रों के 2 सेकंड दालों के आयाम और 2 सेकंड के सोनीशन चक्र मोड को 10% और सोनीशन चक्र मोड सेट करें।
सुपरनेटेंट को स्क्रू कैप के साथ ग्लास ट्यूबों में स्थानांतरित करें।  प्रत्येक ग्लास ट्यूब में 1 मिलीलीटर अल्ट्रावाटर जोड़कर फोल्च निष्कर्षण करें, इसके बाद प्रत्येक ग्लास ट्यूब में क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल (अनुपात = 2: 1) मिश्रण के 6 मिलीलीटर जोड़कर करें।
भंवर 4 बार के लिए 30 सेकंड के लिए प्रत्येक ग्लास ट्यूब.  चरण पृथक्करण को और बढ़ाने के लिए 15 मिन (एपेंडोर्फ, 5810 आर) के लिए 1,258 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें।  एक गिलास पाश्चर विंदुक द्वारा एक साफ गिलास ट्यूब के लिए कम हाइड्रोफोबिक अंश स्थानांतरण.  नाइट्रोजन बाष्पीकरण में नाइट्रोजन प्रवाह के तहत निचले हाइड्रोफोबिक अंश को सुखाएं।  उपयोग करने तक सूखे गोली को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।

अल्ट्रासोनिक कृमि Lysates की तैयारी

कृमि lysate: L4 चरण कीड़े काटा और M9 बफर (42.26 मिमी Na) के साथ तीन बार धोया गया₂एचपीओ₄, 22.04 मिमी केएच₂डाकख़ाना₄, 85.56 मिमी NaCl, और 0.87 मिमी MgSO₄) सभी बैक्टीरिया को हटाने के लिए। एम 9 बफर के जितना संभव हो उतना हटाने के बाद, कीड़े को लाइसिस बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया: 50 एमएम एचईपीईएस, 50 एमएम केसीएल, 1एमएम ईडीटीए, 1एमएम ईजीटीए, 5 एमएम फॉस्फेट β-ग्लिसरॉल, 0.1% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100, 50 एमएम सोडियम फ्लोराइड, 1 एमएम सोडियम ऑर्थोवानाडेट, 5 एमएम सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 0.2 एमएम फेनिलमेथेनेसल्फोनीलफ्लोराइड और प्रोटीज अवरोधक। कीड़े तरल नाइट्रोजन में जमे हुए थे और तीन बार के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पिघलना था, फिर कीड़े 10 नमूना ट्यूबों की एक साथ तैयारी के लिए एक अल्ट्रासोनिक शीशी इकाई के साथ सूखी बर्फ पर sonicated थे. सोनिकेशन फटने के बीच 30 सेकंड के ठहराव के साथ 2 सेकंड के 10 चक्रों में 50% आयाम पर किया गया था। बाद में, नमूने 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 12000 आरपीएम पर centrifuged थे. सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था और -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए एक विभाज्य का उपयोग किया गया था।
कुल ग्लूटाथियोन, जीएसएच और जीएसएसजी का निर्धारण: ग्लूटाथियोन परिमाणीकरण के लिए, लाइसेट्स और निर्धारण उसी दिन किए गए थे। ग्लूकोज-फेड और नियंत्रण एल 4 लार्वा काटा गया और एम 9 बफर के साथ तीन बार धोया गया। एम 9 बफर के जितना संभव हो उतना हटाने के बाद, कीड़े को बर्फ-ठंडे मेटाफॉस्फोरिक एसिड (5% डब्ल्यू / वी) में फिर से निलंबित कर दिया गया था, फिर कीड़े को अल्ट्रासोनिक वायलट्वीटर के साथ बर्फ में 2 सेकंड के दस सोनीशन चक्रों में 50% आयाम पर सोनिकेट किया गया था। बाद में, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 12000 आरपीएम पर अपकेंद्रित्र।
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. एलिगेंस नमूना तैयारी Immunoprecipitation और पश्चिमी सोख्ता से पहले

संक्षेप में, भ्रूण के अर्क के लिए, सी. एलिगेंस L1 लार्वा वयस्कता के लिए बड़े पैमाने पर तरल एस-मध्यम संस्कृतियों में उगाए गए थे। भ्रूण मानक ब्लीच विधि का उपयोग कर एकत्र किए गए थे और lysis बफर (50 मिमी Tris, पीएच 7.5, 100 मिमी KCl, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी MgCl2, 8.7% ग्लिसरॉल, 0.05% एनपी -40, 1 protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल, और 1 बड़े पैमाने पर फॉस्फेट अवरोध करनेवाला कॉकटेल मैं और द्वितीय), जल्दी से तरल नाइट्रोजन में जमे हुए, और इस तरह के रूप में microtip के साथ एक ultrasonicator का उपयोग कर अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान lysed यूपी200एचटी 30% आयाम पर 10 एस से अधिक दालों के लिए S26d2 के साथ। यदि बड़ी संख्या में नमूने अल्ट्रासोनिक तैयार किए जाने चाहिए वायलट्वीटर या अच्छी तरह से प्लेटों के लिए मल्टीसैंपल-अल्ट्रासोनिकेटर UIP400MTP की सिफारिश की जाती है। सोनिकेशन के बाद, अर्क 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 30,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पूर्व-मंजूरी दे दी गई थी। पूर्व-साफ़ अर्क (कुल प्रोटीन का 300μg) एंटी-CDC-25.1 आत्मीयता-शुद्ध एंटीबॉडी (यह अध्ययन) प्रोटीन A-agarose से क्रॉस-लिंक्ड के 40μ��lgg के साथ इनक्यूबेट किया गया था, या नियंत्रण के रूप में, खरगोश इम्युनोग्लोबुलिन की एक समान मात्रा (Ig)G प्रोटीन A-agarose से क्रॉस-लिंक्ड का उपयोग 200μl की कुल मात्रा में किया गया था जिसमें 1% NP-40 था, जिसके समावेश ने मैट्रिक्स में प्रोटीन के निरर्थक बंधन को कम कर दिया। नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए घुमाए गए थे, मोतियों को लाइसिस बफर के साथ तीन बार धोया गया था, और ग्लाइसिन/एचसीएल के 30μl और 200 एमएम एनएसीएल, पीएच 2.2 के साथ एल्यूट किया गया था। इम्यूनोप्रिपिटेशन के बाद, एसडीएस नमूना बफर के 30μ��l में एल्यूएट्स को पतला किया गया, 4 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया, और आमतौर पर इनपुट के लिए कुल का 3% और एल्यूट्स के लिए 30% एसडीएस-पेज पर लागू किया गया था, इसके बाद एंटी-सीडीसी-25.1 (1:400), एंटी-लिन-23 (1:750), एंटी-यूबिकिटिन (1:1000), एंटी-जीएसके3 (1:500), या एंटी-एक्स-β एक्टिन (1:2000) एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता। जहां अर्क immunoprecipitation के अधीन नहीं थे, उन अर्क से व्युत्पन्न कुल प्रोटीन की एक ही राशि एसडीएस नमूना बफर में resuspended था, 95 डिग्री सेल्सियस करने के लिए गरम किया गया है, और फिर सीधे एसडीएस पृष्ठ के लिए लागू किया और पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया. (सीएफ. सेग्रेफ एट अल. 2020)

lysis के लिए प्रोब-टाइप insonifier UP200St

अल्ट्रासोनिक सेल विघटनकारी UP200St लसीका और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए माइक्रो-टिप S26d2 के साथ

अल्ट्रासोनिक Lysis Prescise तापमान नियंत्रण के तहत

जैविक नमूनों को संभालते समय सटीक और विश्वसनीय तापमान नियंत्रण महत्वपूर्ण है। उच्च तापमान नमूनों में थर्मली-प्रेरित प्रोटीन गिरावट शुरू करते हैं।
सभी यांत्रिक नमूना तैयार करने की तकनीकों के रूप में, सोनिकेशन गर्मी पैदा करता है। हालांकि, VialTweeter का उपयोग करते समय नमूनों का तापमान अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है। हम आपको विश्लेषण के लिए VialTweeter और VialPress के साथ तैयार करते समय अपने नमूनों के तापमान की निगरानी और नियंत्रण करने के लिए विभिन्न विकल्प प्रस्तुत करते हैं।

नमूना तापमान की निगरानी: अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर UP200St, जो वायलट्वीटर चलाता है, एक बुद्धिमान सॉफ्टवेयर और एक प्लग करने योग्य तापमान सेंसर से लैस है। तापमान संवेदक को UP200St में प्लग करें और नमूना ट्यूबों में से एक में तापमान संवेदक की नोक डालें। डिजिटल रंगीन टच प्रदर्शन के माध्यम से, आप अपने नमूना sonication के लिए एक विशिष्ट तापमान रेंज UP200St के मेनू में सेट कर सकते हैं. अधिकतम तापमान तक पहुंचने पर अल्ट्रासोनिकेटर स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा और तब तक रुकेगा जब तक कि नमूना तापमान निर्धारित तापमान ∆ के निचले मूल्य तक नीचे न हो जाए। फिर सोनिकेशन स्वचालित रूप से फिर से शुरू होता है। यह स्मार्ट फीचर गर्मी से प्रेरित गिरावट को रोकता है।
VialTweeter ब्लॉक को प्री-कूल्ड किया जा सकता है। टाइटेनियम ब्लॉक को पूर्व-ठंडा करने के लिए फ्रिज या फ्रीजर में वायलट्वीटर ब्लॉक (ट्रांसड्यूसर के बिना केवल सोनोट्रोड!) डालें, नमूने में तापमान वृद्धि को स्थगित करने में मदद करता है। यदि संभव हो तो, नमूना स्वयं भी पूर्व-ठंडा किया जा सकता है।
सोनिकेशन के दौरान ठंडा करने के लिए सूखी बर्फ का उपयोग करें। सूखी बर्फ से भरी उथली ट्रे का उपयोग करें और वायलट्वीटर को सूखी बर्फ पर रखें ताकि गर्मी तेजी से फैल सके।

अपने Lysis अनुप्रयोग के लिए इष्टतम अल्ट्रासोनिक सेल विघटनकर्ता खोजें

Hielscher Ultrasonics प्रयोगशालाओं, बेंच-टॉप और औद्योगिक पैमाने प्रणालियों के लिए उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक सेल विघटनकर्ताओं और homogenizers के लंबे समय से अनुभवी निर्माता है। आपके जीवाणु कोशिका संस्कृति का आकार, आपका शोध या उत्पादन लक्ष्य और प्रति घंटे या दिन प्रक्रिया करने के लिए सेल की मात्रा आपके आवेदन के लिए सही अल्ट्रासोनिक सेल विघटनकर्ता खोजने के लिए आवश्यक कारक हैं।
Hielscher Ultrasonics बहु-नमूनों (10 शीशियों तक) के साथ-साथ बड़े पैमाने पर नमूनों (यानी, माइक्रोटिटर प्लेट्स / 96-वेल प्लेट्स) के एक साथ sonication के लिए विभिन्न समाधान प्रदान करता है, क्लासिक जांच-प्रकार लैब अल्ट्रासोनिकेटर 50 से 400 वाट तक विभिन्न शक्ति स्तरों के साथ वाणिज्यिक सेल व्यवधान और बड़े उत्पादन में प्रोटीन निष्कर्षण के लिए प्रति यूनिट 16,000watts प्रति यूनिट के साथ पूरी तरह से औद्योगिक अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर के लिए। सभी Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर पूर्ण भार के तहत 24/7/365 ऑपरेशन के लिए बनाए गए हैं। मजबूती और विश्वसनीयता हमारे अल्ट्रासोनिक उपकरणों की मुख्य विशेषताएं हैं।
सभी डिजिटल अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र स्मार्ट सॉफ्टवेयर, रंगीन टच डिस्प्ले और स्वचालित डेटा प्रोटोकॉल से लैस हैं, जो अल्ट्रासोनिक डिवाइस को प्रयोगशाला और उत्पादन सुविधाओं में एक सुविधाजनक कार्य उपकरण बनाते हैं।
हमें बताएं, किस तरह की कोशिकाएं, किस मात्रा, किस आवृत्ति के साथ और किस लक्ष्य के साथ आपको अपने जैविक नमूनों को संसाधित करना है। हम आपको आपकी प्रक्रिया आवश्यकताओं के लिए सबसे उपयुक्त अल्ट्रासोनिक सेल विघटनकर्ता की सिफारिश करेंगे।

नीचे दी गई तालिका आपको वाणिज्यिक अनुप्रयोगों के लिए औद्योगिक अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर के लिए कॉम्पैक्ट हाथ से आयोजित होमोजेनाइज़र और मल्टीसैम्पल अल्ट्रासोनिकेटर से हमारे अल्ट्रासोनिक सिस्टम की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:

बैच वॉल्यूम	प्रवाह दर	अनुशंसित उपकरण
96-अच्छी तरह से / माइक्रोटिटर प्लेट्स	एन.ए.	UIP400MTP
10 शीशियों à 0.5 करने के लिए 1.5mL	एन.ए.	UP200St पर VialTweeter
0.01 से 250mL	5 से 100mL/मिनट	यूपी50एच
0.01 से 500mL	10 से 200mL/मिनट	यूपी100एच
10 से 2000mL	20 से 400mL/मिनट	यूपी200एचटी, UP400St
0.1 से 20L	0.2 से 4L/मिनट	यूआईपी2000एचडीटी
10 से 100L	2 से 10 लीटर/मिनट	यूआईपी4000एचडीटी
एन.ए.	10 से 100 लीटर/मिनट	UIP16000
एन.ए.	बड़ा	का क्लस्टर UIP16000

हमसे संपर्क करें! हमसे पूछो!

अधिक जानकारी के लिए पूछें

अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर, अनुप्रयोगों और कीमत के बारे में अतिरिक्त जानकारी का अनुरोध करने के लिए कृपया नीचे दिए गए फॉर्म का उपयोग करें। हमें आपके साथ आपकी प्रक्रिया पर चर्चा करने और आपकी आवश्यकताओं को पूरा करने वाली अल्ट्रासोनिक प्रणाली की पेशकश करने में खुशी होगी!

नाम

अतिथि

ईमेल पता (आवश्यक)

फोन संख्या

पता

शहर, राज्य, ज़िप कोड

भूक्षेत्र

सूद

कृपया ध्यान दें कि हमारा गोपनीयता नीति.

मैं गोपनीयता नीति से सहमत हूं

अल्ट्रासोनिक हाई-शीयर होमोजेनाइज़र का उपयोग लैब, बेंच-टॉप, पायलट और औद्योगिक प्रसंस्करण में किया जाता है।

Hielscher Ultrasonics प्रयोगशाला, पायलट और औद्योगिक पैमाने पर अनुप्रयोगों, फैलाव, पायसीकरण और निष्कर्षण के मिश्रण के लिए उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक homogenizers बनाती है।

साहित्य/सन्दर्भ

Chen J.-X; Cipriani P.G.; Mecenas D.; Polanowska J.; Piano F.; Gunsalus K.C.; Selbach M. (2016): In Vivo Interaction Proteomics in Caenorhabditis elegans Embryos Provides New Insights into P Granule Dynamics. Molecular & Cellular Proteomics 15.5; 2016. 1642-1657.
Jonathan Alcántar-Fernández, Rosa E. Navarro, Ana María Salazar-Martínez, Martha Elva Pérez-Andrade, Juan Miranda-Ríos (2018): Caenorhabditis elegans respond to high-glucose diets through a network of stress-responsive transcription factors. PLoS One 13(7); 2018.
Segref, A.; Cabello, J.; Clucas, C.; Schnabel, R.; Johnstone I.L. (2010): Fate Specification and Tissue-specific Cell Cycle Control of the Caenorhabditis elegans Intestine. Molecular Biology of the Cell Vol. 21, 2010. 725–738.
Henderson S.T., Bonafe M., Johnson T.E. (2006): daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2006; 61:444–60.

जानने के योग्य तथ्य

कैनोर्हैब्डाइटिस एलिगेंस

एलिगेंस लंबाई में लगभग 1 मिमी एक मुक्त-जीवित पारदर्शी नेमाटोड (राउंडवॉर्म) है, जो बैक्टीरिया (जैसे ई कोलाई) पर फ़ीड करता है और इसका अपेक्षाकृत कम जीवन चक्र होता है। 20 डिग्री सेल्सियस पर, सी एलिगेंस (एन 2) के प्रयोगशाला तनाव में लगभग 2-3 सप्ताह का औसत जीवनकाल और 3 से 4 दिनों का पीढ़ी का समय होता है। एलिगेंस बड़ी संख्या में उगाए जाते हैं, जो आसानी से ठीक नियंत्रित प्रयोगशाला स्थितियों के तहत किया जा सकता है, उन्हें आसानी से उपन्यास दवाओं के कार्य सिद्धांत के साथ-साथ मानव रोग में जटिल आणविक प्रक्रियाओं के भीतर उनके प्रभाव और बातचीत के लिए जांच की जा सकती है। लघु जीनोम, लघु जीवन चक्र और प्रयोगशाला सेटिंग्स में सरल हैंडलिंग सी एलिगेंस को जीनोमिक्स, प्रोटिओमिक्स, विकासात्मक जीव विज्ञान, रोग अनुसंधान, दवा विकास आदि जैसे अनुसंधान के लिए एक आदर्श मॉडल जीव बनाते हैं।
कैनोरहैब्डाइटिस एलिगेंस कीड़े या तो नर या हेर्मैफ्रोडाइट हो सकते हैं। हेर्मैफ्रोडाइट्स में नर और मादा दोनों प्रजनन अंग होते हैं। हालांकि, मादा कीड़े मौजूद नहीं हैं। हेर्मैफ्रोडाइट्स या तो स्व-निषेचन कर सकते हैं या नर कीड़े के साथ प्रजनन भी कर सकते हैं। C. एलिगेंस हर दिन 1,000 से अधिक अंडे का उत्पादन कर सकते हैं।
चूंकि सी. एलिगेंस एक तंत्रिका तंत्र के साथ सबसे सरल जीवों में से एक है, निमेटोड कृमि का उपयोग 1963 से अनुसंधान के लिए एक मॉडल जीव के रूप में किया जाता है। न्यूरॉन्स एक्शन पोटेंशिअल को फायर नहीं करते हैं, और किसी भी वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनल को व्यक्त नहीं करते हैं। हेर्मैफ्रोडाइट में, इस प्रणाली में 302 न्यूरॉन शामिल हैं, जिनमें से पैटर्न को व्यापक रूप से मैप किया गया है, जिसे कनेक्टोम के रूप में जाना जाता है।
सी एलिगेंस जीनोम में कई जीनों में मनुष्यों में कार्यात्मक समकक्ष होते हैं जो इसे मानव रोगों के लिए एक अत्यंत उपयोगी मॉडल बनाता है और उदाहरण के लिए विकासात्मक जीव विज्ञान, उम्र बढ़ने और दीर्घायु को प्रभावित करने वाले कारकों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। एलिगेंस म्यूटेंट न्यूरोलॉजिकल विकारों सहित कई मानव रोगों के लिए मॉडल प्रदान करते हैं (जैसे अल्जाइमर), जन्मजात हृदय रोग और गुर्दे की बीमारी.
इन कारकों ने सी. एलिगेंस को कई शोध क्षेत्रों के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान मॉडल बना दिया। एलिगेंस पहला बहुकोशिकीय जीव था जिसने अपने पूरे जीनोम को अनुक्रमित किया था। जीनोम में अनुमानित 20,470 प्रोटीन-कोडिंग जीन होते हैं। लगभग 35% सी. एलिगेंस जीन में मानव होमोलॉग होते हैं। उल्लेखनीय रूप से, मानव जीन को बार-बार उनके बदलने के लिए दिखाया गया है सी. एलिगेंस होमोलॉग जब में पेश किया गया सी. एलिगेंस. इसके विपरीत, कई सी. एलिगेंस जीन स्तनधारी जीन के समान कार्य कर सकते हैं।

एलिगेंस का जीवनकाल लगभग 3 सप्ताह है और इसमें छह जीवन चरण होते हैं: भ्रूणजनन (अंडा चरण), चार लार्वा चरण (एल 1 से एल 4), और वयस्क चरण। नेमाटोड अंडे से एल 1 लार्वा के रूप में निकलते हैं जिसमें 560 कोशिकाएं शामिल होती हैं। प्रत्येक लार्वा चरण के दौरान वृद्धि कोशिका विभाजन और कोशिका अतिवृद्धि द्वारा होती है। क्यूटिकुलर मोल्टिंग प्रत्येक लार्वा चरण को पंचर करता है। यदि कठोर पर्यावरणीय परिस्थितियां विकासशील कृमि को संकेत देती हैं कि वयस्क प्रजनन क्षमता का समर्थन करने की संभावना नहीं है, तो सी. एलिगेंस इसके विकास को बदल सकते हैं और एक वैकल्पिक एल 3 लार्वा चरण बना सकते हैं, जहां लार्वा एक डौर चरण में जाते हैं। इस अवस्था में, जानवर असाधारण रूप से तनाव-सहिष्णु और लंबे समय तक जीवित रहते हैं और तीन से नौ महीने तक जीवित रह सकते हैं। डाउर लार्वा अपने मुख और गुदा गुहाओं दोनों को सील करके, अपने आंत को सिकोड़ते हुए, और एक डीएएफ -16 / फॉक्सो-निर्भर आनुवंशिक कार्यक्रम को चालू करके प्रतिकूलता से खुद को अलग करते हैं, जो अन्य चीजों के अलावा, एक डाउर-विशिष्ट छल्ली की अभिव्यक्ति की ओर जाता है। हेंडरसन एट अल।

C. एलिगेंस डाउर लार्वा

डाउर लार्वा नेमाटोड लार्वा के लिए शब्द है, जो एक वैकल्पिक विकास चरण में प्रवेश करता है। शब्द "डाउर लार्वा" विशेष रूप से रैबडिटिड्स परिवार के कीड़े के लिए उपयोग किया जाता है, जिसमें कैनोरहैब्डाइटिस एलिगेंस भी शामिल है। शब्द "डाउर" जर्मन मूल का है और इसका अर्थ है "अवधि"” के अर्थ में “समय की अवधि"। डाउर लार्वा एक प्रकार के ठहराव में जाते हैं और कठोर परिस्थितियों में जीवित रह सकते हैं। यदि और जब एक लार्वा डाउर चरण में प्रवेश करता है तो पर्यावरणीय परिस्थितियों पर निर्भर होता है। जीव विज्ञान में डाउर लार्वा का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया जाता है क्योंकि लार्वा कठोर वातावरण से बचने और विस्तारित अवधि के लिए जीवित रहने की असाधारण क्षमता दिखाते हैं। उदाहरण के लिए, सी. एलिगेंस डाउर लार्वा चार महीने तक जीवित रह सकते हैं, सामान्य प्रजनन विकास के दौरान लगभग तीन सप्ताह के अपने औसत जीवनकाल से बहुत अधिक समय तक।

सी एलिगेंस जीवन चक्र पर अवलोकन

C. अनुकूल वातावरण में एलिगेंस विकास:
एलिगेंस) अनुकूल और प्रतिकूल पर्यावरणीय परिस्थितियों में विभिन्न विकासात्मक प्रगति दिखाते हैं।

C. अनुकूल परिस्थितियों के लिए एलिगेंस प्रतिक्रिया:
अनुकूल परिस्थितियों में, सूक्ष्म राउंडवॉर्म कैनोराहैब्डाइटिस एलिगेंस (सी. एलिगेंस) एक अच्छी तरह से परिभाषित विकास पथ का अनुसरण करता है। निमेटोड आमतौर पर अपने जीवन चक्र से काफी तेजी से गुजरता है जब पर्यावरण की स्थिति इष्टतम होती है, आमतौर पर 15 डिग्री सेल्सियस से 20 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान पर।

प्रजनन विकास: C. एलिगेंस एक भ्रूण के रूप में अपने जीवन चक्र शुरू होता है. इसके बाद यह चार अलग-अलग लार्वा चरणों के माध्यम से आगे बढ़ता है, जिसे L1 से L4 के रूप में संक्षिप्त किया जाता है।
वयस्क अवस्था: चार लार्वा चरणों को पूरा करने के बाद, सी. एलिगेंस केवल 3 से 5 दिनों में वयस्क अवस्था में पहुंच जाता है। इस चरण में, वे प्रजनन करने में सक्षम हैं और पर्यावरणीय कारकों के आधार पर 2 से 3 सप्ताह तक जीवित रहते हैं।

C. प्रतिकूल परिस्थितियों के लिए एलिगेंस प्रतिक्रिया:

हालांकि, सी. एलिगेंस एक लचीला जीव है और डाउर गठन नामक प्रक्रिया के माध्यम से प्रतिकूल परिस्थितियों के अनुकूल हो सकता है।

डाउर गठन: जब पर्यावरण की स्थिति प्रतिकूल हो जाती है, जैसे कि भीड़भाड़, सीमित खाद्य आपूर्ति, या उच्च तापमान, सी. एलिगेंस एक असाधारण तीसरे लार्वा चरण में प्रवेश कर सकते हैं जिसे कहा जाता है “डाउर,” L3d के रूप में संक्षिप्त।
Dauer उत्तरजीविता: डाउर लार्वा को विशेष रूप से कठोर परिस्थितियों में जीवित रहने के लिए अनुकूलित किया जाता है। वे इस चरण में कई महीनों तक रह सकते हैं, ऊर्जा का संरक्षण कर सकते हैं और चुनौतीपूर्ण वातावरण का सामना कर सकते हैं।

अनुकूल वातावरण में रिकवरी:
एलिगेंस का उल्लेखनीय पहलू परिस्थितियों में सुधार होने पर सामान्य जीवन चक्र में वापस आने की क्षमता है।

अनुकूल परिस्थितियों में वापसी: जब सी. एलिगेंस डाउर लार्वा फिर से अनुकूल परिस्थितियों का सामना करते हैं, जैसे कि पर्याप्त भोजन, कम जनसंख्या घनत्व और उपयुक्त तापमान, तो वे पर्यावरण में बदलाव को महसूस करते हैं।
पुनर्प्राप्ति और प्रजनन: इन बेहतर स्थितियों के जवाब में, डाउर लार्वा नामक एक प्रक्रिया से गुजरते हैं “वसूली।” वसूली के दौरान, वे लार्वा चरणों में वापस संक्रमण करते हैं और अंततः सामान्य जीवनकाल के साथ प्रजनन वयस्क बन जाते हैं।

पर्यावरणीय परिस्थितियों के जवाब में विकास के चरणों के बीच स्विच करने की यह क्षमता सी एलिगेंस जीव विज्ञान का एक विशेष पहलू है। यह उन्हें परिस्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रभावी ढंग से जीवित रहने और प्रजनन करने की अनुमति देता है, जिससे उन्हें वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव बना दिया जाता है, विशेष रूप से विकास, आनुवंशिकी और उम्र बढ़ने के अध्ययन में।

सी की अल्ट्रासोनिक तैयारी एलिगेंस नमूने