सी एलिगेंस नमूनों की अल्ट्रासोनिक तैयारी

सी एलिगेंस, एक सूत्रकृमि कीड़ा, जीव विज्ञान में एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला मॉडल जीव है। विश्लेषण से पहले नमूना तैयारी के लिए लाइसिस, प्रोटीन और लिपिड निष्कर्षण के साथ-साथ आरएनए विखंडन की आवश्यकता होती है, जिसे सोनीशन के माध्यम से मज़बूती से किया जा सकता है। अल्ट्रासोनिक सेल बाधित सी एलिगेंस नमूनों की तेजी से तैयारी के लिए विश्वसनीय, परिष्कृत और उपयोग में आसान उपकरण हैं।

सी एलिगेंस नमूनों की अल्ट्रासोनिक तैयारी

सी एलिगेंस गोल कृमि हैं, जिनका व्यापक रूप से जीनोमिक्स, विकासात्मक जीव विज्ञान और बीमारियों की जांच के लिए अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है। सी एलिगेंस के जीनोम में कई जीन मनुष्यों में कार्यात्मक समकक्ष हैं। इस प्रकार, सूत्रकृमि कीड़ा मानव रोगों के लिए एक अत्यंत उपयोगी मॉडल है। सी एलिगेंस के व्यापक उपयोग के लिए अन्य फायदे बैक्टीरिया (जैसे, ई. कोलाई), इसकी पारदर्शिता, सुविधाजनक हैंडलिंग, साथ ही लंबी अवधि के लिए कीड़े को फ्रीज करने और स्टोर करने की संभावना वाली प्लेटों पर इसकी आसान और सस्ती खेती है।
प्रोटीन और लिपिड विश्लेषण प्रयोगशालाओं में नियमित प्रक्रियाएं हैं और अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी हर विकासात्मक चरण (यानी भ्रूण, लार्वा एल 1-एल 4, वयस्कों) में सी एलिगेंस नेमाटोड को लाइसे करने के लिए स्थापित विधि है। चूंकि सी एलिगेंस का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली के रूप में लक्षित प्रोटीन को अधिक व्यक्त करने के लिए भी किया जाता है, इसलिए एक विश्वसनीय, प्रजनन योग्य लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण विधि, जो उच्च प्रोटीन पैदावार देती है, की आवश्यकता होती है। अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान और निष्कर्षण प्रणाली जांच-प्रकार समरूपता के रूप में और बहु-नमूना अल्ट्रासोनिकेटर के रूप में उपलब्ध हैं। सुविधाजनक नमूना तैयारी और सभी प्रकार के नमूना आकार संख्याओं के लिए खानपान, Hielscher अल्ट्रासोनिक्स में आपकी प्रयोगशाला प्रक्रिया के लिए आदर्श अल्ट्रासोनिक सेल बाधित है।

अल्ट्रासोनिक सी एलिगेंस लाइसिस के लिए

कृमि समरूपता की तैयारी
प्रोटीन निष्कर्षण
लिपिड निष्कर्षण
प्रोटीन मात्राकरण
इम्यूनोप्रिपिटेशन
पश्चिमी सोख्ता
आरएनए निष्कर्षण
एंजाइमेटिक परख

सोनोट्रोड एमटीपी-24-8-96 में माइक्रोटिटर प्लेटों के कुओं के सोनिकेशन के लिए आठ अल्ट्रासोनिक जांच की गई है ।

सी एलिगेंस व्यवधान और लाइसिस के लिए अल्ट्रासोनिक प्रोटोकॉल

अल्ट्रासोनिक समरूपता और सी एलिगेंस के लाइसिस और बाद में प्रोटीन और लिपिड निष्कर्षण विभिन्न समरूपता और लाइसिस बफ़र्स आदि का उपयोग करके अलग-अलग प्रक्रियाओं का उपयोग करके किया जा सकता है। सभी लाइसिस प्रोटोकॉल आम में है कि नमूनों को प्रोटीन क्षरण को रोकने के लिए लगातार बर्फ पर रखा जाना चाहिए । नीचे, हम आपको उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन या लिपिड युक्त सी एलिगेंस नमूनों की तैयारी के लिए कुछ विश्वसनीय और तेजी से अल्ट्रासोनिक लाइसिस और निष्कर्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

अल्ट्रासोनिक सी एलिगेंस लाइसिस के फायदे

विश्वसनीय
प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य
ठीक-ठीक तापमान नियंत्रित
विश्वसनीय प्रक्रिया नियंत्रण
कोमल विधि
आवेदन करना आसान
सुरक्षित

सी एलिगेंस नमूनों से अल्ट्रासोनिक प्रोटीन निष्कर्षण

सी एलिगेंस कीड़े के अल्ट्रासोनिक लाइसिस और प्रोटीन निकासी को विभिन्न प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया जा सकता है। नीचे हम आपको प्रजनन योग्य प्रोटीन निष्कर्षण परिणामों के लिए कुछ विश्वसनीय और तेजी से लाइसिस प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

सोनीशन द्वारा सी एलिगेंस वर्म्स से साइटोसोलिक एक्सट्रैक्ट का तेजी से तैयारी

निम्नलिखित प्रोटोकॉल के साथ आप 30 मिनट से भी कम समय में सी एलिगेंस lysates तैयार कर सकते हैं।
सी एलिगेंस का संग्रह
वांछित सी एलिगेंस कीड़े को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) में चुनें या उन्हें 1.5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ प्लेट से धोएं। 2000rpm पर 1min के लिए पर सेंट्रीफ्यूज गोली के लिए । नमूनों को हर समय बर्फ पर रखें।
इसके बाद पीबीएस से दो बार कीड़े धोएं।
बाद में, डीडीएच के साथ दो बार कीड़े धोएं₂ओ.
समरूपता बफर (एचबी) के कम से कम 500ul में कीड़े को फिर से खर्च करें। कीड़े के नमूने अब अल्ट्रासोनिक लाइसिस के लिए तैयार हैं।
उच्च प्रोटीन निकालने की गुणवत्ता के लिए, आप पीबीएस और बाँझ, अल्ट्रा-शुद्ध पानी (डीडीएच) में प्रत्येक के लिए कीड़े को धोकर बैक्टीरियल संदूषण को कम करना चाह सकते हैं₂हे) या सुक्रोज फ्लोटेशन करते हैं। कीड़े के नमूने लगातार बर्फ पर रखें।

अल्ट्रासोनिक सी एलिगेंस लाइसिस प्रोटोकॉल

सुनिश्चित करें कि आप अल्ट्रासोनिकर अग्रिम तैयार करें ताकि अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइजर उपयोग के लिए तैयार हो (प्रोब माउंटेड, सोनीशन प्रोग्राम प्री-सेट)।

यदि आपका अल्ट्रासोनिकेटर स्टैंड-माउंटेड है, तो अपने नमूना ट्यूबों के साथ आइस-बाथ को अल्ट्रासोनिक जांच के तहत रखें और 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में अल्ट्रासोनिक जांच डालें।

यूपी200St या UP200Ht के साथ सी एलिगेंस लाइसिस के लिए, अल्ट्रासोनिकेशन को माइक्रोटिप (जैसे, 2 मिमी प्रोब S26d2; देखें पिक्चर लेफ्ट) का उपयोग करके 1सेकंड के लिए 40% आयाम पर 30 सेकंड के ठहराव के साथ बीच में किया जाना चाहिए। 30सेकंड ठहराव के साथ प्रत्येक 1 सेकंड के लिए 5 सोनीशन चक्र सी एलिगेंस लाइसिस के लिए आदर्श हैं। यदि आप पहली बार लाइसिस करते हैं, तो आप माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रत्येक पल्स के बाद नमूने के छोटे एलिकोट्स में लाइसिस प्रगति की जांच कर सकते हैं।
कीड़े बाधित होने पर लाइसिस सफलतापूर्वक पूरा हो जाता है। अधिक सोनीशन के परिणामस्वरूप नाभिक का टूटना होता है और जब नमूना चिपचिपा या फोम हो जाता है तो दिखाई देता है। नमूना क्षरण को रोकने के लिए, यदि आवश्यक हो तो अधिक दालों का उपयोग करें। उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन अर्क प्राप्त करने के लिए प्रत्येक अल्ट्रासोनिक पल्स चक्र का समय न बढ़ाएं।
4ºC पर 10मिनट के लिए 14,000rpm पर अल्ट्रासोनिक रूप से lysed कीड़े को अपकेंद्री करके स्पष्ट सेल lysate।
फिर, सुपरनेट को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और इम्यूनोप्रिपिटेशन या अन्य परख के लिए तैयार करें।

समरूपता बफर के लिए नोट करें: इस प्रकार ऊपर अल्ट्रासोनिक लाइसिस प्रोटोकॉल के लिए समरूपता बफर तैयार करें:

15 m Hepes पीएच 7.6 – 0.5 मीटर के 15 मिलीलीटर

10 एमएमएम केसीएल – 2.5 मिलीलीटर 2 एम

1.5 एमएमएम एमजीसीएल 2 – 0.75 मिलीलीटर 1 मीटर

0.1 m EDTA – 0.5 एम के 100 उल

0.5 m EGTA – 2.5 मिलीलीटर 0.1 मीटर

44 एमएम सुक्रोज – 14.7 मिलीलीटर 50%

उपयोग से ठीक पहले जोड़ें: 1mM DTT – 1M के 1000x

इसके अलावा एक प्रोटीज़ अवरोधक

मात्रात्मक आत्मीयता शुद्धिकरण परख के लिए सी एलिगेंस के अल्ट्रासोनिक लाइसिस

सी एलिगेंस भ्रूण (∼२,०००,००० प्रति दोहराने) को जैविक ट्रिपलीकेट में युवा ग्रेविड हर्मेफ्रोडाइट्स ब्लीचिंग और बर्फ पर ध्वनियुक्त (चक्र: 0.5 एस, आयाम: 40-45%, 5 स्ट्रोक/सत्र, 5 सत्र, सत्रों के बीच अंतराल: 30 एस; UP200S अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर लाइसिस बफर (कुल मात्रा: ∼600 माइक्रोन) में माइक्रो-टिप S26d2 (Hielscher अल्ट्रासोनिक्स जीएमबीएच)) के साथ; 50 मिमी ट्राइस-एचसीएल, पीएच 7.4, 100 मिमी केसीएल, 1 मिमी एमजीसीएल2, 1 मिमी ईजीटीए, 1 मिमी डीटीटी, 10% ग्लाइसरोल, प्रोटीज़ अवरोधक मिश्रण, 0.1% नॉनडिट पी-40 विकल्प)। सोनीफिकेशन के बाद, नॉनिडेट पी-40 विकल्प को 1% तक जोड़ा गया और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूंछ रोटेशन पर सिर के साथ lysates को इनक्यूबेटेड किया गया, इसके बाद 20,000 × जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,000 पर अपकेंद्रित्र किया गया। इसके बाद ऊपरी लिपिड परत को परेशान किए बिना मंजूरी दे दी गई और आधे से विभाजित होकर एंटी-जीएफपी एगर उठे मोतियों या अवरुद्ध नियंत्रण मोतियों (40-50 माइक्रोन) में विभाजित कर दिया गया । 60-90 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूंछ रोटेशन पर सिर के बाद, मोतियों को एक बार लाइसिस बफर के साथ धोया गया था जिसमें 0.1% नॉनइडेट पी-40 विकल्प होता है, इसके बाद बफर I (25 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 7.4, 300 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल2) या बफर II (1 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 7.4, 150 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल2) या दोनों में धुलाई के दो बार। GFP के लिए: MBK-2 पुल-चढ़ाव, दो अलग अलग अलग धोने की स्थिति का उपयोग कर प्रयोग किया गया । कमरे के तापमान पर 6 मीटर यूरिया/2 एम थिओरिया के ५० माइक्रोल में कक्षीय झटकों से प्रोटीन को eluted किया गया । MBK-1:: GFP पुल-डाउन प्रयोगों के लिए, प्रोटीन को 90 डिग्री सेल्सियस पर 8 मीटर ग्वानिनियम क्लोराइड के 50μl में मिलाते हुए दो बार eluted किया गया, इसके बाद इथेनॉल वर्षा हुई । एल्यूटेड प्रोटीन के नमूनों को तब इन-सॉल्यूशन में पचाया गया था।
(cf. चेन एट अल., २०१६)

VialTweeter at the ultrasonic processor UP200ST

VialTweeter 10 टेस्ट ट्यूबों के एक साथ सोनीशन के लिए मल्टी-सैंपल तैयार करने वाली इकाई।

अल्ट्रासोनिक वर्म होमोजेनाइजेशन और लाइसिस

C.elegans lysis और प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रिया के लिए, प्रासंगिक चरण के ३०,००० nemotodes प्रति नमूना एकत्र किए गए और बर्फ में धोया-ठंड एस बेसल, 2 मिनट के लिए १५०० आरपीएम पर अपकेंद्रित्र द्वारा केंद्रित है, बर्फ के साथ छह बार धोया-ठंड एस बेसल अवशिष्ट बैक्टीरिया को दूर करने के लिए, और फिर उपयोग के लिए तैयार होने तक बर्फ पर संग्रहीत । प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, ग्रेविड-वयस्क कीड़े को पिछले एस-बेसल वॉश के बाद एक कॉम्पैक्ट गोली बनाने की अनुमति दी गई थी। वर्म छर्रों को तब 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंड निष्कर्षण बफर [20 m पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 7.4, 2mM EDTA, 1% ट्राइटन-एक्स-100, प्रोटीज अवरोधक (सिग्मा P2714)] में फिर से निलंबित कर दिया गया था और तुरंत संसाधित किया गया था।
∼30,000 ग्रेविड-वयस्क कीड़े (∼100 मिलीग्राम गीले वजन के अनुरूप), बर्फ पर एक जांच-प्रकार अल्ट्रासोनिकेटर (जैसे माइक्रोटिप एमएस2 के साथ यूपी 50एच) का उपयोग करके 40% आयाम पर 3 सेकंड के 10 चक्रों के लिए, 30 सेकंड बंद, 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे बफर में। (cf. बखरन एट अल 2012)

सी एलिगेंस से अल्ट्रासोनिक लिपिड निष्कर्षण

लिपिडोमिक्स में, मेटाबोलोमिक्स की एक शाखा, जैविक प्रणालियों के लिपिड पूरक की विशेषता और विश्लेषण किया जाता है। सी एलिगेंस का व्यापक रूप से मेटाबॉलिक लिपिड की बातचीत और स्वास्थ्य और उम्र पर उनके प्रभावों की जांच करने के लिए लिपिडोमिक्स में उपयोग किया जाता है।
अल्ट्रासोनिक लाइसिस और निष्कर्षण का उपयोग सी एलिगेंस भ्रूण, लार्वा और वयस्क कीड़े से स्फिंगोलिपिड जैसे लिपिड जारी करने के लिए किया जाता है। अल्ट्रासोनिकेशन का उपयोग कृमि समरूपता तैयार करने और बाद में नमूने से लिपिड निकालने के लिए किया जाता है।
सी एलिगेंस से अल्ट्रासोनिक लिपिड निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल
बर्फ पर सी एलिगेंस गोली को पिघलाएं और 0.5 मिलीलीटर अल्ट्रावॉटर के साथ रीसुस्पेंड करें।  1,5mL टेस्ट ट्यूबों में सी एलिगेंस नमूनों को सोनिकेट करें, जबकि नमूनों को लगातार बर्फ पर रखते हुए।
सोनीशन को जांच-अल्ट्रासोनिक्स्टर जैसे जांच-अल्ट्रासोनिक्स्टर का उपयोग करके किया जा सकता है UP200Ht, अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी इकाई VialTweeter (10 नमूनों का एक साथ सोनीकरण) या यूआईपी400एमटीपी (96-वेल प्लेट्स जैसी मल्टी-वेल प्लेट्स के सोनीसिएशन के लिए) UP200Ht के साथ अल्ट्रासोनिक लाइसिस के लिए माइक्रो-टिप S26d2 का इस्तेमाल करें। डिजिटल मेन्यू में अल्ट्रासोनिक साइकिल मोड को प्री-सेट करें । प्रत्येक अल्ट्रासोनिक स्पंदन फटने के बीच 30 सेकंड के ठहराव के साथ 20 चक्रों की 2 सेकंड दालों के आयाम और 2 सेकंड दालों के सोनिकेशन चक्र मोड को सेट करें।
सुपरनेटेंट को स्क्रू कैप के साथ ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित करें।  प्रत्येक ग्लास ट्यूब में 1 मिलीलीटर अल्ट्रावॉटर जोड़कर फोल्च निष्कर्षण करें, इसके बाद प्रत्येक ग्लास ट्यूब में 6 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल (अनुपात = 2:1) मिश्रण जोड़कर।
भंवर 4 बार के लिए 30 सेकंड के लिए प्रत्येक ग्लास ट्यूब।  चरण पृथक्करण को और बढ़ाने के लिए 15 मिनट (एपेंडोर्फ, 5810 आर) के लिए 1,258 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।  एक ग्लास पाश्चर पिपेट द्वारा एक साफ ग्लास ट्यूब में निचले हाइड्रोफोबिक अंश को स्थानांतरित करें।  नाइट्रोजन वाष्पीकरण में नाइट्रोजन प्रवाह के तहत निचले हाइड्रोफोबिक अंश को सुखाएं।  उपयोग होने तक सूखे गोली को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।

कृमि Lysates की अल्ट्रासोनिक तैयारी

कीड़ा lysate: L4 चरण कीड़े काटा और M9 बफर (४२.२६ mM ना) के साथ तीन बार धोया गया₂एचपीओ₄, 22.04 एमएमएम केएच₂पीओ₄, 85.56 एमएमएम एनएसीएल, और 0.87 mM MgSO₄) आदेश में सभी बैक्टीरिया को दूर करने के लिए। M9 बफर के जितना संभव हो हटाने के बाद, लाइसिस बफर में कीड़े को फिर से निलंबित कर दिया गया: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 m फॉस्फेट β-ग्लाइसेरोल, ०.१% (v/v) ट्राइटन एक्स-१००, ५० एमएम सोडियम फ्लोराइड, 1 एमएम सोडियम ऑर्थोवनानेट, 5 एमएम सोडियम पायरोफोस्फेट, ०.२ एमएम फिनाइलमेसिसुलफॉल्फाइड और प्रोटीजक । कीड़े तरल नाइट्रोजन में जमे हुए थे और तीन बार के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गल रहे थे, तो कीड़े 10 नमूना ट्यूबों की एक साथ तैयारी के लिए एक अल्ट्रासोनिक VialTweeter इकाई के साथ सूखी बर्फ पर सोनिक किया गया । सोनीशन फटने के बीच 30 सेकंड के ठहराव के साथ 2 सेकंड के 10 चक्रों में 50% आयाम पर किया गया था। बाद में, नमूनों को 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 12000 आरपीएम पर अपकेंद्री किया गया। सुपरनैंट को एकत्र किया गया था और -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्रोटीन क्वांटिफिकेशन के लिए एक एलिकोट का इस्तेमाल किया गया था ।
कुल ग्लूटाथिएक, जीएसएच और जीएसएसजी का निर्धारण: ग्लूटाथिएक क्वांटिफिकेशन के लिए एक ही दिन ग्लूट और दृढ़ संकल्प किया गया था । ग्लूकोज से खिलाया और नियंत्रण L4 लार्वा काटा और M9 बफर के साथ तीन बार धोया गया । M9 बफर के जितना संभव हो हटाने के बाद, कीड़े बर्फ में पुनर्उत्कारित किया गया-ठंडा मेटाफोस्फोरिक एसिड (5% w/v), तो कीड़े एक अल्ट्रासोनिक VialTweeter के साथ बर्फ में 2 सेकंड के दस sonication चक्र में ५०% आयाम पर ध्वनिित किया गया । 30 सेकंड के साथ प्रत्येक चक्र के बीच ठहराव । बाद में, 15 मिनट के लिए 4 ̊C पर १२००० आरपीएम पर अपकेंद्रित्र ।
(cf. Alcántar-फर्नांडीज एट अल., 2018)

सी एलिगेंस नमूना तैयारी से पहले इम्यूनोप्रिपिपिटेशन और वेस्टर्न ब्लॉटिंग

संक्षेप में, भ्रूणीय अर्क के लिए, सी एलिगेंस एल 1 लार्वा बड़े पैमाने पर तरल एस-मध्यम संस्कृतियों में वयस्कता के लिए उगाए गए थे। भ्रूण मानक ब्लीच विधि का उपयोग कर एकत्र किए गए थे और लाइसिस बफर (50 mM Tris, पीएच 7.5, 100 mm KCl, में निलंबित कर दिया गया था, 1 एमएमएम ईडीटीए, 1 एमएमएम एमजीसीएल2, 8.7% ग्लाइसेरोल, 0.05% एनपी-40, 1􏰅 प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल, और 1􏰅 फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल आई और II), तरल नाइट्रोजन में जल्दी से जमे हुए, और माइक्रोसिप के साथ अल्ट्रासोनिकेटर का उपयोग करके अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान द्वारा lysed UP200Ht 30% आयाम पर 10 एस से अधिक 10 दालों के लिए S26d2 के साथ। यदि बड़ी संख्या में नमूने अल्ट्रासोनिक तैयार किए जाने चाहिए VialTweeter या अच्छी तरह से प्लेटों के लिए मल्टीसैंपल-अल्ट्रासोनिक यूआईपी 400MTP की सिफारिश की जाती है। सोनीशन के बाद, अर्क को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 30,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा पूर्व-निकासी किया गया था। पूर्व-स्वीकृत अर्क (कुल प्रोटीन का 300μg) एंटी-सीडीसी-25.1 आत्मीयता-शुद्ध एंटीबॉडी (यह अध्ययन) प्रोटीन ए-एगर उठे से क्रॉस-लिंक्ड के 40μ􏰂g के साथ इनक्यूबेटेड था, या नियंत्रण के रूप में, प्रोटीन ए-एग्रिज से जुड़े खरगोश इम्यूनोग्लोबुलिन (आईजी) जी क्रॉस-लिंक्ड की एक समान मात्रा का उपयोग 1% एनपी-40 वाले लाइसिस बफर के 200μl की कुल मात्रा में किया गया था, जिसमें शामिल किया गया था, जिसमें मैट्रिक्स के लिए प्रोटीन की गैर-विशिष्ट बाध्यकारी कम हो गई थी। नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए घुमाया गया, मोतियों को लाइसिस बफर के साथ तीन बार धोया गया, और ग्लाइसिन/एचसीएल और 200 एमएम एनएसीएल, पीएच 2.2 के 30μl के साथ eluted किया गया। इम्यूनोप्रिपिटेशन के बाद, एसडीएस नमूना बफर के 30μ􏰂l में eluates पतला किया गया था, जो 4 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म था, और आम तौर पर इनपुट के लिए कुल का 3% और eluates के लिए 30% एसडीएस-पेज पर लागू किया गया था जिसके बाद एंटी-सीडीसी-25.1 (1:400), एंटी-लिन-23 (1) के साथ पश्चिमी ब्लॉटिंग :750), एंटी-सर्वव्यापकता (1:1000), एंटी-जीएसके 3􏰁 (1:500), या एंटी-􏰁β-ऐक्टिन (1:2000) एंटीबॉडी। जहां अर्क इम्यूनोप्रिपिपिटेशन के अधीन नहीं थे, उन अर्क से प्राप्त कुल प्रोटीन की एक ही राशि एसडीएस नमूना बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया था, 95 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म है, और फिर सीधे SDS-पृष्ठ पर लागू किया और पश्चिमी दाग द्वारा विश्लेषण किया । (cf. Segref एट अल 2020)

lysis के लिए जांच-प्रकार UP200St insonifier

अल्ट्रासोनिक सेल बाधित UP200St लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए माइक्रो-टिप S26d2 के साथ

पूर्वतक तापमान नियंत्रण के तहत अल्ट्रासोनिक लाइसिस

जैविक नमूनों को संभालते समय सटीक और विश्वसनीय तापमान नियंत्रण महत्वपूर्ण है। उच्च तापमान नमूनों में थर्मल-प्रेरित प्रोटीन क्षरण शुरू करते हैं।
सभी यांत्रिक नमूना तैयारी तकनीकों के रूप में, सोनीशन गर्मी पैदा करता है। हालांकि, VialTweeter का उपयोग करते समय नमूनों के तापमान को अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है। हम आपको विश्लेषण के लिए VialTweeter और VialPress के साथ तैयार करते हुए अपने नमूनों के तापमान की निगरानी और नियंत्रण के लिए विभिन्न विकल्प प्रस्तुत करते हैं।

नमूना तापमान की निगरानी: अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर UP200St, जो VialTweeter ड्राइव, एक बुद्धिमान सॉफ्टवेयर और एक खामियों को दूर करने योग्य तापमान सेंसर से सुसज्जित है । UP200St में तापमान सेंसर प्लग और नमूना ट्यूबों में से एक में तापमान सेंसर की नोक डालें। डिजिटल रंगीन टच-डिस्प्ले के माध्यम से, आप अपने नमूने के लिए एक विशिष्ट तापमान सीमा UP200St के मेनू में सेट कर सकते हैं। अधिकतम तापमान पहुंचने और तब तक रुकने पर अल्ट्रासोनिकेटर स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा जब तक कि नमूना तापमान ∆ सेट तापमान के कम मूल्य तक नहीं नीचे हो जाता है। इसके बाद सोनिकेशन अपने आप फिर से शुरू हो जाता है। यह स्मार्ट फीचर हीट-प्रेरित दुर्गति को रोकता है।
VialTweeter ब्लॉक पूर्व ठंडा किया जा सकता है। वियलट्वीटर ब्लॉक (केवल ट्रांसड्यूसर के बिना सोनोट्रोड!) फ्रिज या फ्रीजर में टाइटेनियम ब्लॉक को प्री-कूल करने के लिए लें, नमूने में तापमान वृद्धि को स्थगित करने में मदद करता है। यदि संभव हो, तो नमूना खुद को प्री-कूल भी किया जा सकता है।
सोनीशन के दौरान ठंडा करने के लिए सूखी बर्फ का प्रयोग करें। सूखी बर्फ से भरी उथली ट्रे का इस्तेमाल करें और छठी को सूखी बर्फ पर रखें ताकि गर्मी तेजी से नष्ट हो सके।

अपने Lysis आवेदन के लिए इष्टतम अल्ट्रासोनिक सेल बाधित का पता लगाएं

Hielscher Ultrasonics प्रयोगशालाओं, बेंच-टॉप और औद्योगिक पैमाने पर प्रणालियों के लिए उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक सेल बाधित और समरूपता के लंबे समय से अनुभवी निर्माता है। आपका बैक्टीरियल सेल संस्कृति का आकार, आपका शोध या उत्पादन लक्ष्य और प्रति घंटे या दिन प्रक्रिया करने के लिए सेल की मात्रा आपके आवेदन के लिए सही अल्ट्रासोनिक सेल बाधित खोजने के लिए आवश्यक कारक हैं।
Hielscher Ultrasonics बहु नमूनों (10 शीशियों तक) के साथ-साथ बड़े पैमाने पर नमूनों (यानी, के एक साथ सोनीशन के लिए विभिन्न समाधान प्रदान करता है, माइक्रोटिटर प्लेटें/९६-वेल प्लेटें), क्लासिक प्रोब-टाइप लैब अल्ट्रासोनिकेटर ५० से ४०० वाट तक विभिन्न बिजली के स्तर के साथ वाणिज्यिक सेल व्यवधान और बड़े उत्पादन में प्रोटीन निष्कर्षण के लिए 16,000वाट प्रति इकाई तक के साथ पूरी तरह से औद्योगिक अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर के लिए । सभी Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर पूर्ण भार के तहत 24/7/365 आपरेशन के लिए बनाया गया है । मजबूती और विश्वसनीयता हमारे अल्ट्रासोनिक उपकरणों की मुख्य विशेषताएं हैं।
सभी डिजिटल अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइजर स्मार्ट सॉफ्टवेयर, रंगीन टच डिस्प्ले और ऑटोमैटिक डेटा प्रोटोकॉललिंग से लैस हैं, जो अल्ट्रासोनिक डिवाइस को लैब और उत्पादन सुविधाओं में एक सुविधाजनक काम उपकरण बनाते हैं ।
आइए जानते हैं, किस तरह की कोशिकाएं, किस मात्रा में, किस आवृत्ति के साथ और किस लक्ष्य के साथ आपको अपने जैविक नमूनों को संसाधित करना है। हम आपको अपनी प्रक्रिया आवश्यकताओं के लिए सबसे उपयुक्त अल्ट्रासोनिक सेल बाधित करने की सलाह देंगे।

नीचे दी गई तालिका आपको वाणिज्यिक अनुप्रयोगों के लिए औद्योगिक अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर के लिए कॉम्पैक्ट हैंड-हेल्ड होमोजेनाइजर्स और मल्टीसैंपल अल्ट्रासोनिकेटर से हमारे अल्ट्रासोनिक सिस्टम की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:

बैच वॉल्यूम	प्रवाह की दर	अनुशंसित उपकरणों
96-अच्छी तरह से/	एन.ए.	यूआईपी400एमटीपी
10 शीशियां à 0.5 से 1.5mL	एन.ए.	UP200St पर VialTweeter
0.01 से 250mL	5 से 100mL/मिनट	UP50H
0.01 से 500mL	10 से 200 मील / मिनट	UP100H
10 से 2000 मील	20 से 400 एमएल / मिनट	UP200Ht, UP400St
0.1 से 20 एल	0.2 से 4 एल / मिनट	UIP2000hdT
10 से 100 एल	2 से 10 एल / मिनट	UIP4000hdT
एन.ए.	10 से 100 एल / मिनट	UIP16000
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Hielscher Ultrasonics प्रयोगशाला, पायलट और औद्योगिक पैमाने पर अनुप्रयोगों, फैलाव, पायसीकरण और निष्कर्षण मिश्रण के लिए उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक समरूपता का निर्माण करता है ।

साहित्य/संदर्भ

Chen J.-X; Cipriani P.G.; Mecenas D.; Polanowska J.; Piano F.; Gunsalus K.C.; Selbach M. (2016): In Vivo Interaction Proteomics in Caenorhabditis elegans Embryos Provides New Insights into P Granule Dynamics. Molecular & Cellular Proteomics 15.5; 2016. 1642-1657.
Jonathan Alcántar-Fernández, Rosa E. Navarro, Ana María Salazar-Martínez, Martha Elva Pérez-Andrade, Juan Miranda-Ríos (2018): Caenorhabditis elegans respond to high-glucose diets through a network of stress-responsive transcription factors. PLoS One 13(7); 2018.
Segref, A.; Cabello, J.; Clucas, C.; Schnabel, R.; Johnstone I.L. (2010): Fate Specification and Tissue-specific Cell Cycle Control of the Caenorhabditis elegans Intestine. Molecular Biology of the Cell Vol. 21, 2010. 725–738.
Henderson S.T., Bonafe M., Johnson T.E. (2006): daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2006; 61:444–60.

जानने के योग्य तथ्य

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस

सी एलिगेंस लंबाई में 1 मिमी के बारे में एक मुक्त रहने वाले पारदर्शी सूत्रकृमि (गोल कृमि) है, जो बैक्टीरिया (जैसे ई कोलाई) पर फ़ीड करता है और इसमें अपेक्षाकृत कम जीवन चक्र होता है। 20 डिग्री सेल्सियस पर, सी एलिगेंस (एन2) की प्रयोगशाला में औसत उम्र 2-3 सप्ताह और 3 से 4 दिनों की पीढ़ी का समय होता है। जब सी elegans बड़ी संख्या में बड़े हो रहे हैं, जो आसानी से ठीक नियंत्रित प्रयोगशाला शर्तों के तहत किया जा सकता है, वे आसानी से उपंयास दवाओं के काम सिद्धांत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उनके प्रभाव और मानव रोग में जटिल आणविक प्रक्रियाओं के भीतर बातचीत के लिए जांच की जा सकती है । प्रयोगशाला सेटिंग्स में लघु जीनोम, लघु जीवन चक्र और सरल हैंडलिंग सी एलिगेंस को जीनोमिक्स, प्रोटेओमिक्स, विकासात्मक जीव विज्ञान, रोग अनुसंधान, दवा विकास आदि जैसे अनुसंधान के लिए एक आदर्श मॉडल जीव बनाते हैं।
कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस कीड़े या तो पुरुष या हर्मेफ्रोडिट हो सकते हैं। हर्मेफ्रोडाइट्स में पुरुष और महिला दोनों प्रजनन अंग होते हैं। हालांकि, मादा कीड़े मौजूद नहीं हैं। हर्मेफ्रोडाइट्स या तो आत्म-निषेचित कर सकते हैं या पुरुष कीड़े के साथ भी प्रजनन कर सकते हैं। सी एलिगेंस हर दिन 1,000 से अधिक अंडे का उत्पादन कर सकते हैं।
चूंकि सी एलिगेंस तंत्रिका तंत्र वाले सबसे सरल जीवों में से एक है, इसलिए 1 9 63 से अनुसंधान के लिए एक मॉडल जीव के रूप में सूत्रकृमि का उपयोग किया जाता है। न्यूरॉन्स कार्रवाई क्षमता आग नहीं है, और किसी भी वोल्टेज gated सोडियम चैनलों व्यक्त नहीं करते। हर्मेफ्रोडिट में, इस प्रणाली में 302 न्यूरॉन शामिल हैं, जिसके पैटर्न को व्यापक रूप से मैप किया गया है, जिसे कनेक्टोम के रूप में जाना जाता है।
सी elegans जीनोम में जीन के कई मनुष्यों में कार्यात्मक समकक्षों जो यह मानव रोगों के लिए एक अत्यंत उपयोगी मॉडल बनाता है और उदाहरण के लिए विकासात्मक जीव विज्ञान, बुढ़ापे और दीर्घायु को प्रभावित कारकों का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इसके अलावा, सी एलिगेंस म्यूटेंट न्यूरोलॉजिकल विकारों (जैसे अल्जाइमर), जन्मजात हृदय रोग और गुर्दे की बीमारी सहित कई मानव रोगों के लिए मॉडल प्रदान करते हैं।
इन कारकों ने सी एलिगेंस को कई शोध क्षेत्रों के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान मॉडल बनाया। नतीजतन, सी एलिगेंस पहला बहुकोशिकीय जीव था जिसने अपने पूरे जीनोम अनुक्रमित किया था। जीनोम में अनुमानित २०,४७० प्रोटीन कोडिंग जीन होते हैं । सी एलिगेंस जीन के बारे में 35% मानव समरूप होते हैं। उल्लेखनीय है, मानव जीन बार-बार अपने सी elegans समरूपता की जगह जब सी elegans में पेश किया गया है दिखाया गया है । इसके विपरीत, कई सी एलिगेंस जीन स्तनधारी जीन के समान कार्य कर सकते हैं।

सी एलिगेंस की उम्र लगभग 3 सप्ताह है और इसमें छह जीवन चरण होते हैं: भ्रूणजेनेसिस (अंडा चरण), चार लार्वा चरण (एल 1 से एल 4), और वयस्क चरण। नेमाटोड अंडे से निकलते हैं क्योंकि एल 1 लार्वा में 560 कोशिकाएं शामिल होती हैं। प्रत्येक लार्वा चरण के दौरान विकास सेल डिवीजन और सेल हाइपरट्रॉफी द्वारा होता है। क्यूटिकुलर पिघलने से प्रत्येक लार्वा चरण को विराम देता है। यदि कठोर पर्यावरणीय स्थितियां विकासशील कीड़े को संकेत देती हैं कि स्थितियां वयस्क प्रजनन क्षमता का समर्थन करने की संभावना नहीं हैं, तो सी एलिगेंस इसके विकास को बदल सकते हैं और एक वैकल्पिक एल 3 लार्वा चरण बना सकते हैं, जहां लार्वा एक दाऊ चरण में जाते हैं। इस राज्य में, जानवर असाधारण रूप से तनाव-सहिष्णु और लंबे समय तक रहते हैं और तीन से नौ महीने जीवित रह सकते हैं। Dauer लार्वा अपने दोनों बुक्कल और गुदा गुहाओं को सील करके विपरीत परिस्थितियों से खुद को अलग करते हैं, उनके पेट को सिकुड़ते हैं, और एक डीएएफ-16/फॉक्सओ-निर्भर आनुवंशिक कार्यक्रम को चालू करते हैं, जो अन्य बातों के अलावा, एक दाऊर-विशिष्ट क्यूटिकल की अभिव्यक्ति की ओर जाता है। (cf. हेंडरसन एट अल., 2006)

C. एलिगेंस दाउर लार्वा

दाऊर लार्वा नेमाटोड लार्वा के लिए शब्द है, जो एक वैकल्पिक विकासात्मक चरण में प्रवेश करता है। थेर शब्द "दाएर लार्वा" का उपयोग विशेष रूप से कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस सहित रैबडिटिड्स परिवार के कीड़े के लिए किया जाता है। शब्द "Dauer" जर्मन मूल का है और "अवधि का मतलब है” के अर्थ में “समय की अवधि "। दाऊर लार्वा एक प्रकार के स्टेसिस में जाते हैं और कठोर परिस्थितियों से बच सकते हैं। यदि और जब एक लार्वा दाऊर चरण में प्रवेश करता है तो पर्यावरणीय स्थितियों पर निर्भर है। दाऊर लार्वा का जीव विज्ञान में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया जाता है क्योंकि लारवे कठोर वातावरण में जीवित रहने और समय की विस्तारित अवधि के लिए जीने की असाधारण क्षमता दिखाते हैं। उदाहरण के लिए, सी एलिगेंस दाउयर लार्वा चार महीने तक जीवित रह सकता है, जो सामान्य प्रजनन विकास के दौरान लगभग तीन सप्ताह की अपनी औसत उम्र से कहीं अधिक है।

सी एलिगेंस नमूनों की अल्ट्रासोनिक तैयारी