C. Elegans नमूनों की अल्ट्रासोनिक तैयारी

C. elegans, एक सूत्रकृमि, जीवविज्ञान में व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला मॉडल जीव है। विश्लेषण से पहले नमूना तैयार करने के लिए लाइसिस, प्रोटीन और लिपिड निष्कर्षण तथा RNA खंडन आवश्यक होते हैं, जिन्हें सोनिकेशन द्वारा विश्वसनीय रूप से किया जा सकता है। अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटक, C. elegans नमूनों की त्वरित तैयारी के लिए विश्वसनीय, परिष्कृत और उपयोग में आसान उपकरण हैं।

C. elegans नमूनों की अल्ट्रासोनिक तैयारी

C. elegans गोलकृमि हैं, जिनका उपयोग अनुसंधान प्रयोगशालाओं में जीनोमिक्स, विकासात्मक जीवविज्ञान और रोगों का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है। C. elegans के जीनोम में मौजूद कई जीनों के कार्यात्मक समकक्ष मनुष्यों में भी पाए जाते हैं। इसलिए यह सूत्रकृमि मानव रोगों के लिए एक अत्यंत उपयोगी मॉडल है। C. elegans के व्यापक उपयोग के अन्य लाभों में जीवाणुओं (जैसे, E. coli) वाली प्लेटों पर इसका आसान और सस्ता संवर्धन, इसकी पारदर्शिता, इसे संभालने की सुविधा, तथा कृमियों को जमाकर लंबे समय तक संग्रहीत करने की संभावना शामिल हैं।
प्रोटीन और लिपिड विश्लेषण प्रयोगशालाओं में नियमित प्रक्रियाएँ हैं और अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी, विकास की प्रत्येक अवस्था (अर्थात भ्रूण, L1–L4 लार्वा, वयस्क) में C. elegans सूत्रकृमियों का लाइसिस करने की स्थापित विधि है। चूँकि लक्षित प्रोटीनों की अतिअभिव्यक्ति के लिए C. elegans का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली के रूप में भी किया जाता है, इसलिए उच्च प्रोटीन प्राप्ति देने वाली एक विश्वसनीय, पुनरुत्पादनीय लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण विधि आवश्यक है। अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटन और निष्कर्षण प्रणालियाँ प्रोब-प्रकार के होमोजेनाइज़र और बहु-नमूना अल्ट्रासोनिकेटर के रूप में उपलब्ध हैं। सुविधाजनक नमूना तैयारी तथा हर प्रकार के नमूना आकार और संख्या की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, Hielscher Ultrasonics के पास आपकी प्रयोगशाला प्रक्रिया के लिए आदर्श अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटक है।

C. Elegans के विघटन और लाइसिस के लिए अल्ट्रासोनिक प्रोटोकॉल

C. elegans का अल्ट्रासोनिक समांगीकरण और लाइसिस तथा उसके बाद प्रोटीन और लिपिड निष्कर्षण, विभिन्न समांगीकरण और लाइसिस बफ़र आदि का उपयोग करके अलग-अलग प्रक्रियाओं से किए जा सकते हैं। सभी लाइसिस प्रोटोकॉल में एक बात समान है कि प्रोटीन के अपघटन को रोकने के लिए नमूनों को लगातार बर्फ पर रखना आवश्यक है। नीचे हम उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन- या लिपिड-युक्त C. elegans नमूनों की तैयारी के लिए कुछ विश्वसनीय और त्वरित अल्ट्रासोनिक लाइसिस और निष्कर्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

अल्ट्रासोनिक C. elegans लाइसिस के लाभ

• विश्वसनीय
• पुनरुत्पादनीय
• सटीक तापमान नियंत्रण
• विश्वसनीय प्रक्रिया नियंत्रण
• सौम्य विधि
• प्रयोग में आसान
• सुरक्षित

C. elegans नमूनों से अल्ट्रासोनिक प्रोटीन निष्कर्षण

C. elegans कृमियों का अल्ट्रासोनिक लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण विभिन्न प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया जा सकता है। नीचे हम प्रोटीन निष्कर्षण के पुनरुत्पादनीय परिणामों के लिए कुछ विश्वसनीय और त्वरित लाइसिस प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

सोनिकेशन द्वारा C. elegans कृमियों से साइटोसोलिक अर्क की त्वरित तैयारी

निम्नलिखित प्रोटोकॉल से आप 30 मिनट से कम समय में C. elegans लाइसेट तैयार कर सकते हैं।
C. elegans का संग्रह
वांछित C. elegans कृमियों को फॉस्फेट-बफ़रयुक्त लवणीय विलयन (PBS) वाली 1.5ml नलिका में चुनकर डालें या उन्हें प्लेट से 1.5ml PBS से धोकर एकत्र करें। पेलेट बनाने के लिए 2000rpm पर 1min तक अपकेंद्रित करें। नमूनों को हर समय बर्फ पर रखें।
फिर कृमियों को PBS से दो बार धोएँ।
इसके बाद, कृमियों को ddH₂O से दो बार धोएँ।
कृमियों को कम से कम 500ul समांगीकरण बफ़र (HB) में पुनः निलंबित करें। कृमि नमूने अब अल्ट्रासोनिक लाइसिस के लिए तैयार हैं।
प्रोटीन अर्क की बेहतर गुणवत्ता के लिए, आप जीवाणु संदूषण को कम करने हेतु कृमियों को प्रत्येक में 5min तक धो सकते हैं, पहले PBS में और फिर निर्जीवित, अति-शुद्ध जल (ddH₂O) में, या सुक्रोज़ फ्लोटेशन कर सकते हैं। कृमि नमूनों को लगातार बर्फ पर रखें।

अल्ट्रासोनिक C. elegans लाइसिस प्रोटोकॉल

• सुनिश्चित करें कि आप अल्ट्रासोनिकेटर को पहले से तैयार कर लें, ताकि अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र उपयोग के लिए तैयार हो (प्रोब लगा हो, सोनिकेशन प्रोग्राम पहले से सेट हो)। 

यदि आपका अल्ट्रासोनिकेटर स्टैंड पर लगा है, तो अपने नमूना ट्यूबों वाले बर्फ-स्नान को अल्ट्रासोनिक प्रोब के नीचे रखें और अल्ट्रासोनिक प्रोब को 1.5ml ट्यूब में डालें।

• UP200St या UP200Ht से C. elegans के लयन के लिए, माइक्रोटिप (जैसे, 2mm प्रोब S26d2; बाईं ओर चित्र देखें) का उपयोग करके 40% आयाम पर 1sec तक अल्ट्रासोनिकेशन किया जाना चाहिए और बीच में 30sec के विराम होने चाहिए। C. elegans के लयन के लिए प्रत्येक 1 सेकंड के 5 सोनिकेशन चक्र, जिनके बीच 30sec के विराम हों, आदर्श हैं। यदि आप पहली बार लयन कर रहे हैं, तो प्रत्येक स्पंद के बाद नमूने के छोटे अंशों में सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके लयन की प्रगति जाँच सकते हैं।
• कृमियों के विघटित होने पर लयन सफलतापूर्वक पूरा हो जाता है। अत्यधिक सोनिकेशन से केंद्रक टूट जाते हैं और यह तब दिखाई देता है जब नमूना चिपचिपा हो जाता है या उसमें झाग बनने लगता है। नमूने के क्षरण को रोकने के लिए, आवश्यकता होने पर अधिक स्पंदों का उपयोग करें। उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन अर्क प्राप्त करने के लिए प्रत्येक अल्ट्रासोनिक स्पंद चक्र की अवधि न बढ़ाएँ।
• अल्ट्रासोनिक रूप से लयित कृमियों को 4ºC पर 14,000rpm पर 10min तक अपकेंद्रित करके कोशिका लयित को साफ करें।
• फिर, अधिप्लावी को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और इम्यूनोप्रेसिपिटेशन या अन्य परखों के लिए तैयार करें।

समांगीकरण बफर के लिए टिप्पणी: ऊपर दिए गए अल्ट्रासोनिक लयन प्रोटोकॉल के लिए समांगीकरण बफर निम्नानुसार तैयार करें:

UIP400MTP प्लेट सोनिकेटर का उपयोग करके 96-वेल प्लेटों में C. elegans का उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाला लयन

C. elegans का लयन (वयस्क सूत्रकृमि)
UIP400MTP 80% आयाम, 20 चक्र (प्रत्येक सोनिकेशन चक्र: 30 sec चालू, 30 sec बंद)
लयन बफर:

• विकल्प 1) 4% SDS, 0.1 M Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA
• विकल्प 2) सह-इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (co-IP) के लिए: 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.5 % NP-40 (संपूर्ण प्रोटीनेज़ अवरोधक मिश्रण)

उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाला DNA खंडन
C. elegans (वयस्क सूत्रकृमि) DNA 200–300bp: UIP400MTP प्लेट सोनिकेटर – 80% आयाम, 30 स्पंद निर्धारित करें – प्रत्येक में 30sec चालू, 30sec बंद

उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाली नमूना तैयारी के लिए UIP400MTP प्लेट सोनिकेटर मल्टी-वेल, माइक्रोटाइटर प्लेटों और 96-वेल प्लेटों में नमूनों का एकसमान सोनिकेशन करता है

मात्रात्मक बंधुता शुद्धिकरण परखों के लिए C. elegans का अल्ट्रासोनिक लयन

युवा अंडयुक्त उभयलिंगी कृमियों का ब्लीच उपचार करके C. elegans भ्रूणों (प्रति प्रतिकृति ∼2 मिलियन) को तीन जैविक प्रतिकृतियों में ताज़ा एकत्र किया गया और बर्फ पर (चक्र: 0.5 s, आयाम: 40–45%, 5 स्पंद/सत्र, 5 सत्र, सत्रों के बीच अंतराल: 30 s; UP200S अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर , माइक्रो-टिप S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH) के साथ) लयन बफर (कुल आयतन: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% ग्लिसरॉल, प्रोटीएज़ अवरोधक मिश्रण, 0.1% Nonidet P-40 Substitute) में उनका सोनिकेशन किया गया। सोनिकेशन के बाद, Nonidet P-40 Substitute को 1% तक मिलाया गया और लयितों को 4°C पर 30 min तक सिरा-दर-सिरा घुमाते हुए ऊष्मायित किया गया, जिसके बाद 4°C पर 20,000 × g पर 20 min तक अपकेंद्रण किया गया। इसके बाद ऊपरी लिपिड परत को छेड़े बिना साफ किए गए लयित को चूषण द्वारा निकाला गया और आधा-आधा बाँटकर anti-GFP एगरोज़ बीड्स या ब्लॉक किए गए नियंत्रण बीड्स (40–50 μl) में डाला गया। 4°C पर 60–90 min तक सिरा-दर-सिरा घुमाने के बाद, बीड्स को 0.1% Nonidet P-40 Substitute वाले लयन बफर से एक बार धोया गया, जिसके बाद बफर I (25 mm Tris-HCl, pH 7.4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) या बफर II (1 mm Tris-HCl, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) या दोनों में दो बार धोया गया। GFP:MBK-2 पुल-डाउन के लिए, धुलाई की अलग-अलग परिस्थितियों का उपयोग करके दो अलग प्रयोग किए गए। कमरे के तापमान पर 6 m यूरिया/2 M थायोयूरिया के 50 μl में कक्षीय दोलन द्वारा प्रोटीनों का निक्षालन किया गया। MBK-1::GFP पुल-डाउन प्रयोगों के लिए, 90°C पर 8 m ग्वानिडिनियम क्लोराइड के 50μl में हिलाकर प्रोटीनों का दो बार निक्षालन किया गया, जिसके बाद एथेनॉल द्वारा अवक्षेपण किया गया। इसके बाद निक्षालित प्रोटीन नमूनों का विलयन में पाचन किया गया।
(cf. Chen et al., 2016)

कृमियों का अल्ट्रासोनिक समांगीकरण और लयन

C.elegans के लयन और प्रोटीन निष्कर्षण की प्रक्रिया के लिए, प्रत्येक नमूने में संबंधित चरण के 30,000 नेमाटोड एकत्र किए गए और बर्फ जैसे ठंडे S-basal से धोए गए, 1500 rpm पर 2 min. तक अपकेंद्रण करके सांद्रित किए गए, अवशिष्ट जीवाणुओं को हटाने के लिए बर्फ जैसे ठंडे S-basal से छह बार धोए गए, और फिर उपयोग के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखे गए। प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, अंडों से भरे वयस्क कृमियों को अंतिम S-basal धुलाई के बाद एक सघन पेलेट बनाने दिया गया। इसके बाद कृमियों के पेलेट को 1 ml बर्फ जैसे ठंडे निष्कर्षण बफ़र [20 mM पोटैशियम फॉस्फेट, pH 7.4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, प्रोटीएज़ अवरोधक (Sigma P2714)] में पुनः निलंबित किया गया और तुरंत प्रसंस्कृत किया गया।
अंडों से भरे ∼30,000 वयस्क कृमियों (∼100 mg गीले भार के समतुल्य) का 1 ml बर्फ जैसे ठंडे निष्कर्षण बफ़र में, प्रोब-प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर (जैसे माइक्रोटिप MS2 के साथ UP50H) का उपयोग करके, बर्फ पर 40% आयाम पर 10 चक्रों तक सोनिकेशन किया गया, जिसमें प्रत्येक चक्र में 3 sec चालू और 30 sec बंद रखा गया। (देखें Baskharan et al. 2012)

C. elegans से अल्ट्रासोनिक लिपिड निष्कर्षण

मेटाबोलोमिक्स की एक शाखा, लिपिडोमिक्स में, जैविक प्रणालियों में मौजूद समस्त लिपिडों का अभिलक्षणन और विश्लेषण किया जाता है। चयापचय संबंधी लिपिडों की पारस्परिक क्रिया तथा स्वास्थ्य और जीवनकाल पर उनके प्रभावों की जाँच के लिए लिपिडोमिक्स में C. elegans का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।
C. elegans के भ्रूणों, लार्वा और वयस्क कृमियों से स्फिंगोलिपिड जैसे लिपिड मुक्त करने के लिए अल्ट्रासोनिक लयन और निष्कर्षण का उपयोग किया जाता है। कृमियों के होमोजेनेट तैयार करने और उसके बाद नमूने से लिपिड निकालने के लिए अल्ट्रासोनिकेशन का उपयोग किया जाता है।
C. elegans से अल्ट्रासोनिक लिपिड निष्कर्षण का प्रोटोकॉल
C. elegans के पेलेट को बर्फ पर पिघलाएँ और 0.5 ml ultrawater में पुनः निलंबित करें। 
नमूनों को लगातार बर्फ पर रखते हुए, 1.5mL टेस्ट ट्यूबों में C. elegans के नमूनों का सोनिकेशन करें।
सोनिकेशन के लिए प्रोब-प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर जैसे UP200Ht, अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी इकाई VialTweeter (10 नमूनों का एक साथ सोनिकेशन) या UIP400MTP (96-वेल प्लेटों जैसी मल्टी-वेल प्लेटों के सोनिकेशन के लिए) का उपयोग किया जा सकता है।
UP200Ht के साथ अल्ट्रासोनिक लयन के लिए माइक्रोटिप S26d2 का उपयोग करें। डिजिटल मेनू में अल्ट्रासोनिक चक्र मोड पहले से सेट करें। आयाम को 10% पर और सोनिकेशन चक्र मोड को 2 sec की पल्सों के 20 चक्रों पर सेट करें, जिसमें प्रत्येक अल्ट्रासोनिक पल्स बर्स्ट के बीच 30 sec. का विराम हो।
अधिप्लवों को स्क्रू-कैप वाली काँच की ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 
प्रत्येक काँच की ट्यूब में 1 ml ultrawater डालकर, और उसके बाद प्रत्येक काँच की ट्यूब में 6 ml क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल मिश्रण (अनुपात = 2:1) डालकर Folch निष्कर्षण करें।
प्रत्येक काँच की ट्यूब को 30 sec तक 4 बार वॉर्टेक्स करें। 
प्रावस्था पृथक्करण को और बेहतर बनाने के लिए ट्यूबों को 1,258 x g पर 15 min तक अपकेंद्रित करें (Eppendorf, 5810 R)। 
काँच की पाश्चर पिपेट से निचले जलविरागी अंश को एक साफ़ काँच की ट्यूब में स्थानांतरित करें। 
नाइट्रोजन वाष्पित्र में नाइट्रोजन प्रवाह के अंतर्गत निचले जलविरागी अंश को सुखाएँ। 
सूखे पेलेट को उपयोग होने तक -80 °C के फ़्रीज़र में रखें। 


कृमि लाइसेटों की अल्ट्रासोनिक तैयारी

कृमि लाइसेट: L4 चरण के कृमियों को एकत्र किया गया और M9 बफ़र (42.26 mM Na₂HPO₄, 22.04 mM KH₂PO₄, 85.56 mM NaCl, और 0.87 mM MgSO₄) से तीन बार धोया गया, ताकि सभी बैक्टीरिया हट जाएँ। M9 बफर को यथासंभव हटाने के बाद, कृमियों को लाइसिस बफर में पुनः निलंबित किया गया: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM फॉस्फेट β-ग्लिसरॉल, 0.1% (v/v) Triton X-100, 50 mM सोडियम फ्लोराइड, 1 mM सोडियम ऑर्थोवैनाडेट, 5 mM सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 0.2 mM फेनिलमेथेनसल्फोनिलफ्लोराइड और प्रोटीएज़ अवरोधक। कृमियों को तरल नाइट्रोजन में जमाने और 37°C पर पिघलाने की प्रक्रिया तीन बार की गई, फिर 10 नमूना ट्यूबों की एक साथ तैयारी के लिए एक अल्ट्रासोनिक VialTweeter इकाई से सूखी बर्फ पर कृमियों का सोनिकेशन किया गया। सोनिकेशन 50% आयाम पर 2 sec. के 10 चक्रों में किया गया, जिसमें सोनिकेशन स्पंद-समूहों के बीच 30 sec का विराम रखा गया। इसके बाद, नमूनों को 4°C पर 12,000 rpm पर 15 min तक अपकेंद्रित किया गया। अधिप्लावी को एकत्र करके -70°C पर भंडारित किया गया। एक अंश का उपयोग ब्रैडफोर्ड परीक्षण द्वारा प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया।
कुल ग्लूटाथियोन, GSH और GSSG का निर्धारण: ग्लूटाथियोन की मात्रा निर्धारित करने के लिए लाइसेट तैयार करने और मात्रा निर्धारण का कार्य एक ही दिन किया गया। ग्लूकोज़ खिलाए गए और नियंत्रण L4 लार्वा को एकत्र करके M9 बफर से तीन बार धोया गया। M9 बफर को यथासंभव हटाने के बाद, कृमियों को बर्फ जैसे ठंडे मेटाफॉस्फोरिक अम्ल (5% w/v) में पुनः निलंबित किया गया, फिर अल्ट्रासोनिक VialTweeter से बर्फ में कृमियों का सोनिकेशन 50% आयाम पर 2 sec. के दस सोनिकेशन चक्रों में किया गया, जिसमें प्रत्येक चक्र के बीच 30 sec. का विराम रखा गया। इसके बाद, 4 ̊C पर 12,000 rpm पर 15 min तक अपकेंद्रित किया गया।
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

इम्यूनोप्रेसिपिटेशन और वेस्टर्न ब्लॉटिंग से पहले C. elegans नमूनों की तैयारी

संक्षेप में, भ्रूणीय अर्क प्राप्त करने के लिए, C. elegans के L1 लार्वा को बड़े पैमाने के तरल S-माध्यम संवर्धनों में वयस्क अवस्था तक उगाया गया। भ्रूणों को मानक ब्लीच विधि से एकत्र करके लाइसिस बफर (50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8.7% ग्लिसरॉल, 0.05% NP-40, 1􏰅 प्रोटीएज़ अवरोधक कॉकटेल और 1􏰅 फॉस्फेटेज़ अवरोधक कॉकटेल I और II) में निलंबित किया गया और तुरंत तरल नाइट्रोजन में जमाया गया। इसके बाद, अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटन द्वारा उनका लाइसिस करने के लिए माइक्रोटिप वाले अल्ट्रासोनिकेटर, जैसे UP200Ht का S26d2 के साथ 30% आयाम पर 10 s के दौरान 10 स्पंदों के लिए उपयोग किया गया। यदि अधिक संख्या में नमूने तैयार करने हों, तो अल्ट्रासोनिक VialTweeter या वेल-प्लेटों के लिए MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP की अनुशंसा की जाती है। सोनिकेशन के बाद, अर्कों को 30,000g पर 20 min तक 4°C पर अपकेंद्रित करके प्रारंभिक रूप से साफ़ किया गया। प्रारंभिक रूप से साफ़ किए गए अर्क (कुल प्रोटीन का 300µg) को 40µ􏰂g अफ़िनिटी-शुद्ध anti-CDC-25.1 एंटीबॉडी (इस अध्ययन) के साथ ऊष्मायित किया गया, जिसे प्रोटीन A-अगारोज़ से क्रॉस-लिंक किया गया था; या नियंत्रण के रूप में प्रोटीन A-अगारोज़ से क्रॉस-लिंक किए गए खरगोश इम्युनोग्लोबुलिन (Ig)G की समान मात्रा का उपयोग किया गया। यह प्रक्रिया कुल 200µl लाइसिस बफ़र में की गई, जिसमें 1% NP-40 था; इसे शामिल करने से प्रोटीनों का मैट्रिक्स से गैर-विशिष्ट बंधन कम हुआ। नमूनों को 1 h तक 4°C पर घुमाया गया, बीड्स को लाइसिस बफ़र से तीन बार धोया गया और 30µl ग्लाइसिन/HCl तथा 200 mM NaCl, pH 2.2 से एल्यूट किया गया। इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के बाद, एल्यूएटों को 30µ􏰂l SDS नमूना बफ़र में तनु किया गया, 95°C पर 4 min तक गर्म किया गया और सामान्यतः इनपुट के लिए कुल मात्रा का 3% तथा एल्यूएटों के लिए 30% SDS-PAGE पर लोड किया गया। इसके बाद anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) या anti-􏰁β-actin (1:2000) एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लॉटिंग की गई। जिन अर्कों का इम्यूनोप्रेसिपिटेशन नहीं किया गया, उनसे प्राप्त कुल प्रोटीन की समान मात्रा को SDS नमूना बफ़र में पुनः निलंबित किया गया, 95°C तक गर्म किया गया और फिर सीधे SDS-PAGE पर लोड करके वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा विश्लेषित किया गया। (cf. Segref et al. 2020)

सटीक तापमान नियंत्रण में अल्ट्रासोनिक लाइसिस

जैविक नमूनों को संभालते समय सटीक और विश्वसनीय तापमान नियंत्रण अत्यंत आवश्यक है। उच्च तापमान नमूनों में ऊष्मा-प्रेरित प्रोटीन अपघटन शुरू कर देता है।
सभी यांत्रिक नमूना तैयारी तकनीकों की तरह, सोनिकेशन से भी ऊष्मा उत्पन्न होती है। हालांकि, VialTweeter का उपयोग करते समय नमूनों के तापमान को अच्छी तरह नियंत्रित किया जा सकता है। विश्लेषण के लिए VialTweeter और VialPress से नमूने तैयार करते समय उनके तापमान की निगरानी और नियंत्रण के लिए हम आपके सामने विभिन्न विकल्प प्रस्तुत करते हैं।

1. नमूने के तापमान की निगरानी: VialTweeter को संचालित करने वाला अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर UP200St बुद्धिमान सॉफ़्टवेयर और प्लग से जोड़े जा सकने वाले तापमान सेंसर से सुसज्जित है। तापमान सेंसर को UP200St में प्लग करें और सेंसर की नोक को किसी एक नमूना ट्यूब में डालें। डिजिटल रंगीन टच डिस्प्ले के माध्यम से आप UP200St के मेनू में अपने नमूने के सोनिकेशन के लिए एक विशिष्ट तापमान सीमा निर्धारित कर सकते हैं। अधिकतम तापमान तक पहुंचने पर अल्ट्रासोनिकेटर अपने आप बंद हो जाएगा और तब तक रुका रहेगा, जब तक नमूने का तापमान निर्धारित तापमान अंतर ∆ के निचले मान तक नहीं आ जाता। इसके बाद सोनिकेशन अपने आप फिर से शुरू हो जाता है। यह स्मार्ट सुविधा ऊष्मा-प्रेरित अपघटन को रोकती है।
2. VialTweeter ब्लॉक को पहले से ठंडा किया जा सकता है। टाइटेनियम ब्लॉक को पहले से ठंडा करने के लिए VialTweeter ब्लॉक (केवल सोनोट्रोड, ट्रांसड्यूसर के बिना!) को फ्रिज या फ्रीज़र में रखें। इससे नमूने में तापमान बढ़ने में देरी होती है। यदि संभव हो, तो नमूने को भी पहले से ठंडा किया जा सकता है।
3. सोनिकेशन के दौरान ठंडा करने के लिए शुष्क बर्फ का उपयोग करें। शुष्क बर्फ से भरी एक उथली ट्रे लें और VialTweeter को शुष्क बर्फ पर रखें, ताकि ऊष्मा तेजी से निकल सके।

अपने लायसिस अनुप्रयोग के लिए सर्वोत्तम अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटक खोजें

Hielscher Ultrasonics प्रयोगशालाओं, बेंच-टॉप और औद्योगिक पैमाने की प्रणालियों के लिए उच्च प्रदर्शन वाले अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटकों और होमोजेनाइज़रों का लंबे अनुभव वाला निर्माता है। आपके अनुप्रयोग के लिए सही अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटक चुनने में आपके जीवाणु कोशिका संवर्धन का आकार, आपके अनुसंधान या उत्पादन का लक्ष्य और प्रति घंटे या दिन संसाधित की जाने वाली कोशिकाओं का आयतन आवश्यक कारक हैं।
Hielscher Ultrasonics कई नमूनों (10 वायल तक) के साथ-साथ बड़ी संख्या में नमूनों (अर्थात माइक्रोटाइटर प्लेटें / 96-वेल प्लेटें) के एक साथ सोनिकेशन के लिए विभिन्न समाधान प्रदान करता है। इनमें 50 से 400 watts तक के विभिन्न शक्ति स्तरों वाले पारंपरिक प्रोब-प्रकार के प्रयोगशाला अल्ट्रासोनिकेटर से लेकर बड़े पैमाने के उत्पादन में व्यावसायिक कोशिका विघटन और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए प्रति इकाई 16,000watts तक की शक्ति वाले पूरी तरह औद्योगिक अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर शामिल हैं। सभी Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर पूर्ण भार पर 24/7/365 संचालन के लिए बनाए गए हैं। मजबूती और विश्वसनीयता हमारे अल्ट्रासोनिक उपकरणों की मुख्य विशेषताएं हैं।
सभी डिजिटल अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र स्मार्ट सॉफ़्टवेयर, रंगीन टच डिस्प्ले और स्वचालित डेटा अभिलेखन से सुसज्जित हैं, जो अल्ट्रासोनिक उपकरण को प्रयोगशाला और उत्पादन सुविधाओं में काम के लिए एक सुविधाजनक साधन बनाते हैं।
हमें बताएं कि आपको अपने जैविक नमूनों में किस प्रकार की कोशिकाओं को, कितने आयतन में, कितनी बार और किस उद्देश्य से संसाधित करना है। हम आपकी प्रक्रिया की आवश्यकताओं के लिए सबसे उपयुक्त अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटक की अनुशंसा करेंगे।

नीचे दी गई तालिका आपको हमारी अल्ट्रासोनिक प्रणालियों की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है। इनमें कॉम्पैक्ट हस्तचालित होमोजेनाइज़र और बहु-नमूना अल्ट्रासोनिकेटर से लेकर व्यावसायिक अनुप्रयोगों के लिए औद्योगिक अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर तक शामिल हैं: