ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर नमूनों का अल्ट्रासोनिक Lysis
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का व्यापक रूप से प्रयोगशालाओं में मॉडल जीव के रूप में उपयोग किया जाता है। इसलिए, ऐसे lysis, सेल व्यवधान, प्रोटीन निष्कर्षण और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर नमूने के डीएनए कतरनी के रूप में पूर्व विश्लेषणात्मक तैयारी कदम अक्सर बाहर किया जाना चाहिए. अल्ट्रासोनिक डिमेब्रेटर विश्वसनीय और कुशल हैं और केवल अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों को समायोजित करके आसानी से लाइसिस, प्रोटीन निष्कर्षण या डीएनए विखंडन जैसे विभिन्न कार्यों को करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। अल्ट्रासोनिक homogenizers इस प्रकार अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ लचीला उपकरण हैं।
अल्ट्रासोनिक Lysis और प्रोटीन निष्कर्षण
Lysis, सेल घुलनशीलता, ऊतक homogenization और प्रोटीन निष्कर्षण जैविक प्रयोगशालाओं में अल्ट्रासोनिक dismembrators के लिए विशिष्ट कार्य कर रहे हैं। अल्ट्रासोनिक डिमेब्रेटर और सेल डिसरप्टर जानवरों के ऊतकों, कीड़ों (जैसे, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, सी एलिगेंस) या पौधों के नमूनों को समरूप बनाने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। अल्ट्रासोनिकेशन के बाद के अनुप्रयोग सेल निलंबन और छर्रों के साथ-साथ इंट्रासेल्युलर प्रोटीन के निष्कर्षण के लसीका हैं।
अल्ट्रासोनिक लसीका और प्रोटीन निष्कर्षण अत्यधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रक्रियाएं हैं, जो स्थापित प्रोटोकॉल के आधार पर की जा सकती हैं। चूंकि अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया तीव्रता को आयाम, चक्र / पल्स मोड, तापमान और नमूना मात्रा जैसे सोनीशन मापदंडों के माध्यम से बिल्कुल समायोजित किया जा सकता है, एक बार सिद्ध प्रोटोकॉल को एक ही परिणाम के साथ दोहराया जा सकता है।
- अत्यधिक कुशल
- विशिष्ट नमूना सामग्री के लिए समायोज्य
- किसी भी मात्रा के लिए उपयुक्त
- गैर-थर्मल उपचार
- प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम
- सरल और सुरक्षित
अल्ट्रासोनिक डीएनए और आरएनए विखंडन
सेल लसीका और प्रोटीन निष्कर्षण के बाद, नमूना तैयार करने में एक सामान्य आवश्यक कदम डीएनए, आरएनए और क्रोमैटिन का कतरनी और विखंडन है, उदाहरण के लिए क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन (सीएचआईपी) से पहले। डीएनए और आरएनए विखंडन को भौतिक बलों द्वारा डीएनए को एक साथ रखने वाले सहसंयोजक बंधनों को तोड़कर मज़बूती से प्राप्त किया जा सकता है। सोनिकेशन जैसे भौतिक कतरनी का उपयोग करते हुए, पहले डीएनए किस्में टूट जाती हैं, फिर डीएनए को छोटे टुकड़ों में विभाजित किया जाता है।
अल्ट्रासोनिक डीएनए विखंडन एक लक्षित लंबाई के लिए डीएनए कतरनी में विश्वसनीय और कुशल है, उदाहरण के लिए 500bp (आधार जोड़े)। अल्ट्रासोनिक डीएनए विखंडन के प्रमुख लाभों में अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों और तीव्रता का सटीक नियंत्रण शामिल है। अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों को सोनीशन तीव्रता, चक्र और समय को ठीक से ट्यून करके समायोजित किया जा सकता है। इससे वांछित डीएनए आकार बनाना संभव हो जाता है और लक्षित डीएनए लंबाई को मज़बूती से उत्पादित किया जा सकता है और साथ ही पुन: पेश किया जा सकता है। अल्ट्रासोनिक डीएनए बाल काटना भी उच्च आणविक भार डीएनए टुकड़े बनाने के लिए आदर्श है।

अल्ट्रासोनिकेटर यूपी200एचटी ड्रोसोफिला नमूनों के sonication के लिए 2 मिमी माइक्रोटिप S26d2 के साथ
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के अल्ट्रासोनिक लसीका के लिए प्रोटोकॉल
नीचे आप अल्ट्रासोनिक रूप से सहायता प्राप्त lysis, प्रोटीन निष्कर्षण, और डीएनए या ड्रोसोफिला नमूनों के क्रोमैटिन विखंडन के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल पा सकते हैं।
क्रॉस-लिंकिंग इम्यूनोप्रिपिटेशन (CLIP) परख के लिए अल्ट्रासोनिक Lysis
सीएलआईपी परख प्रदर्शन किया गया था के रूप में पहले कुछ संशोधनों के साथ रिपोर्ट. 0- से 1-दिन पुरानी जंगली प्रकार की महिलाओं से लगभग 20 मिलीग्राम अंडाशय यूवी क्रॉसलिंक (3 × 2000 μJ/cm2) थे, 1 एमएल आरसीबी बफर (50 मिमी HEPES पीएच 7.4, 200 मिमी NaCl, 2.5 मिमी MgCl2, 0.1% ट्राइटन X-100, 250 मिमी सुक्रोज, 1 मिमी डीटीटी, 1× EDTA मुक्त पूर्ण प्रोटीज अवरोधक, 1 मिमी PMSF) 300 यू RNAseOUT के साथ पूरक और 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखा गया। होमोजेनेट को बर्फ पर 80% शक्ति पर, 20 एस फटने में पांच बार Hielscher अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर का उपयोग करके 60 s आराम के साथ sonicated किया गया था UP100H (100 W, 30 kHz) और अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16000 × ग्राम)। घुलनशील निकालने 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20 माइक्रोन प्रोटीन-जी डायनाबीड्स के साथ पूर्वस्वीकृत किया गया था। इम्यूनोब्लोटिंग और आरएनए इनपुट (1%) की मात्रा का ठहराव के लिए नमूनों को हटाने के बाद, एचपी 1 को 50 माइक्रोन प्रोटीन-जी डायनाबीड्स के साथ 4 घंटे के लिए इनक्यूबेशन द्वारा 450 माइक्रोन प्रीक्लियर एक्सट्रैक्ट से एंटी-एचपी 1 9 ए 9 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोप्रिसिपिटेट किया गया था। आरसीबी के साथ इम्यूनोप्रेसिपिटेट्स को 4 बार धोया गया था। इम्यूनोप्रेसिपिटेड आरएनए को एल्यूट करने के लिए, गोली वाले मोतियों को 5 मिन के लिए अल्ट्राप्योर डीईपीसी उपचारित पानी के 100 माइक्रोन में उबाला गया था। आरएनए शुद्ध निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार oligo डीटी, यादृच्छिक hexamers और SuperScript रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस III का उपयोग कर सीडीएनए संश्लेषित करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
(कैसले एट अल 2019)
क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन परख के लिए अल्ट्रासोनिक Lysis
क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन को मामूली संशोधनों के साथ मेनेट द्वारा वर्णित विधि के अनुसार किया गया था। 0- से 1-दिन पुरानी जंगली प्रकार की महिलाओं से लगभग 20 मिलीग्राम अंडाशय एनईबी बफर के 1 एमएल में समरूप थे (पीएच 8.0 पर 10 एमएम एचईपीईएस-एनए, पीएच 8 पर 0.1 एमएम ईजीटीए-एनए, पीएच 8 पर 0.5 एमएम ईडीटीए-एनए, 1 एमएम डीटीटी, 0.5% एनपी -40, 0.5 एमएम स्पर्मिडाइन, 0.15 एमएम स्पर्मिडीन, 1× ईडीटीए-फ्री कम्प्लीट प्रोटीज इनहिबिटर) एक होमोजेनाइज़र / विसर्जन फैलाने वाले 1 मिनट (3000 आरपीएम पर)। होमोजेनेट को पूर्व-ठंडा ग्लास उछाल में स्थानांतरित कर दिया गया था और एक तंग मूसल के साथ 15 पूर्ण स्ट्रोक लगाए गए थे। नि: शुल्क नाभिक तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6000xg पर centrifuged थे. नाभिक युक्त छर्रों एनईबी के 1 एमएल में resuspended और सुक्रोज ढाल पर 20 मिनट के लिए 20000 × ग्राम पर centrifuged (एनईबी में 1.6 एम sucrose के 0.65 एमएल, एनईबी में 0.8 एम sucrose के 0.35 एमएल). गोली एनईबी के 1 एमएल और फॉर्मलाडेहाइड में 1% की अंतिम एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित कर दिया गया था। नाभिक कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पार जुड़े हुए थे और 1.375 एम ग्लाइसिन के 1/10 खंड जोड़कर बुझाया गया था। नाभिक 5 मिनट के लिए 6000 × ग्राम पर centrifugation द्वारा एकत्र किए गए थे. नाभिक एनईबी के 1 एमएल में दो बार धोया गया और लाइसिस बफर के 1 एमएल (पीएच 7.6, 140 एमएम एनएसीएल, 0.5 एमएम ईजीटीए, पीएच 8 पर 1 एमएम ईडीटीए, 1% ट्राइटन एक्स-100, 0.5 एमएम डीटीटी, 0.1% ना डीऑक्सीकोलेट, 0.1% एसडीएस, 0.5% एन-लॉरॉयलसारकोसिन और 1× ईडीटीए-मुक्त पूर्ण प्रोटीज अवरोधक) के 1 एमएल में फिर से निलंबित कर दिया गया। नाभिक एक Hielscher अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर का उपयोग sonicated थे UP100H (100 W, 30 kHz) बर्फ पर 20 एस और 1 मिनट के लिए छह बार। सोनिकेटेड नाभिक 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिन के लिए 13000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किए गए थे। सोनिकेटेड क्रोमैटिन का अधिकांश हिस्सा लंबाई में 500 से 1000 बेस जोड़े (बीपी) था। प्रत्येक इम्यूनोप्रिपिटेशन के लिए, क्रोमैटिन के 15 माइक्रोग्राम को एचपी 1 9 ए 9 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एक घूर्णन पहिया में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे) के 10 माइक्रोग्राम की उपस्थिति में इनक्यूबेट किया गया था। फिर, डायनाबीड्स प्रोटीन जी के 50 माइक्रोन को जोड़ा गया और इनक्यूबेशन को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जारी रखा गया। सतह पर तैरनेवाला त्याग दिया गया था और नमूने Lysis बफर (प्रत्येक धोने 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट) और ते बफर में दो बार (1 मिमी EDTA, पीएच 8 पर 10 मिमी TrisHCl) में दो बार धोया गया. क्रोमैटिन को दो चरणों में मोतियों से निकाला गया था; एल्यूशन बफर 1 (10 एमएम ईडीटीए, 1% एसडीएस, पीएच 8 पर 50 एमएम ट्रिसएचसीएल) के 100 माइक्रोन में पहले 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर, इसके बाद सेंट्रीफ्यूजेशन और सुपरनेटेंट की वसूली। मोती सामग्री को टीई + 0.67% एसडीएस के 100 माइक्रोन में फिर से निकाला गया था। संयुक्त एल्यूएट (200 माइक्रोन) को क्रॉस-लिंक को रिवर्स करने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात इनक्यूबेट किया गया था और 65 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए 50 माइक्रोग्राम/एमएल आरएनएएसईए द्वारा और 65 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए 500 माइक्रोग्राम/एमएल प्रोटीनेज के द्वारा इलाज किया गया था। नमूने फिनोल-क्लोरोफॉर्म निकाले गए और इथेनॉल अवक्षेपित किया गया। डीएनए पानी के 25 μl में resuspended किया गया था. डीएनए immunoprecipitated के साथ आणविक विश्लेषण को अधिकतम करने के लिए, उम्मीदवार जीन एक ही प्रतिक्रिया में समान पिघलने तापमान वाले प्राइमरों के दो अलग अलग सेटों का उपयोग करके एक अनुकूलित डुप्लेक्स-पीसीआर प्रोटोकॉल के माध्यम से जोड़े में प्रवर्धित थे.
(कैसले एट अल 2019)

UP200St TD_CupHorn डीएनए और क्रोमैटिन बाल काटना जैसे नमूनों के अप्रत्यक्ष sonication के लिए
जैविक नमूनों के लिए उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान
Hielscher Ultrasonics अपने लंबे समय से अनुभवी साथी है जब यह सेल व्यवधान, lysis, प्रोटीन निष्कर्षण, डीएनए, आरएनए, और क्रोमैटिन विखंडन के साथ ही अन्य पूर्व विश्लेषणात्मक नमूना तैयारी कदम के लिए उच्च प्रदर्शन ultrasonicators के लिए आता है। अल्ट्रासोनिक लैब होमोजेनाइज़र और नमूना तैयारी इकाइयों के व्यापक पोर्टफोलियो की पेशकश करते हुए, Hielscher में आपके जैविक अनुप्रयोग और आवश्यकताओं के लिए आदर्श अल्ट्रासोनिक डिवाइस है।
माइक्रो-टिप के साथ क्लासिक प्रोब-टाइप अल्ट्रासोनिकेटर जैसे यूपी200सेंट (200W; चित्र बाईं ओर देखें) या अल्ट्रासोनिक नमूना तैयार करने वाली इकाइयों में से एक वायलट्वीटर नहीं तो UP200St_TD_CupHorn VialHolder के साथ अनुसंधान और विश्लेषणात्मक प्रयोगशालाओं में पसंदीदा मॉडल हैं। क्लासिक अल्ट्रासोनिक जांच आदर्श है, जब कम नमूने तैयार किए जाते हैं तो उन्हें lysed, निकाला या खंडित किया जाना चाहिए। नमूना तैयार करने वाली इकाइयाँ VialTweeter और UP200St_TD_CupHorn क्रमशः 10 या 5 शीशियों तक के एक साथ sonication की अनुमति देती हैं।
यदि उच्च नमूना संख्या (जैसे 96-अच्छी प्लेट, माइक्रोटिटर प्लेट आदि) को संसाधित किया जाना चाहिए, तो UIP400MTP आदर्श सोनीशन सेटअप है। UIP400MTP एक बड़े कपहॉर्न की तरह काम करता है, जो पानी से भरा होता है और इसमें माइक्रो-वेल प्लेटों को रखने के लिए पर्याप्त जगह होती है। 400 वाट शक्तिशाली अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर द्वारा संचालित, UIP400MTP कोशिकाओं, लाइज़ नमूनों, घुलनशील छर्रों को भंग करने, प्रोटीन निकालने या कतरनी डीएनए को बाधित करने के लिए बहु-अच्छी प्लेटों का एक बहुत ही समान और तीव्र सोनिकेशन प्रदान करता है।
स्मार्ट सॉफ्टवेयर के माध्यम से सटीक नियंत्रण
200 वाट से ऊपर के सभी Hielscher sonication समाधान एक डिजिटल रंग टच-स्क्रीन और एक बुद्धिमान सॉफ्टवेयर से लैस हैं। स्मार्ट डेटा प्रोटोकॉल के माध्यम से सभी अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया पैरामीटर स्वचालित रूप से एक अंतर्निहित एसडी-कार्ड पर सीएसवी फ़ाइल के रूप में सहेजे जाते हैं जैसे ही अल्ट्रासोनिकेटर शुरू होता है। यह अनुसंधान और प्रोटोकॉल को और अधिक सुविधाजनक बनाता है। सोनीशन परीक्षण या नमूना तैयार करने के बाद, आप बस प्रत्येक सोनीशन रन के सोनीशन मापदंडों की समीक्षा कर सकते हैं और उनकी तुलना कर सकते हैं।
सहज ज्ञान युक्त मेनू के माध्यम से, कई पैरामीटर sonication से पहले पूर्व निर्धारित किया जा सकता है: उदाहरण के लिए, नमूने में तापमान को नियंत्रित करने के लिए और इसके थर्मल क्षरण को रोकने के लिए, नमूना तापमान की एक ऊपरी सीमा निर्धारित की जा सकती है। एक प्लग करने योग्य तापमान सेंसर, जो अल्ट्रासोनिक इकाई के साथ आता है, वास्तविक सोनीशन तापमान पर अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर प्रतिक्रिया देता है। जब ऊपरी तापमान सीमा तक पहुंच जाता है, तो अल्ट्रासोनिक डिवाइस तब तक रुकता है जब तक कि सेट ∆टी की निचली सीमा तक नहीं पहुंच जाती है और फिर स्वचालित रूप से फिर से सोनिकेटिंग शुरू हो जाती है।
यदि एक विशिष्ट ऊर्जा इनपुट के साथ सोनीशन की आवश्यकता होती है, तो आप सोनीशन रन की अंतिम अल्ट्रासोनिक ऊर्जा को पूर्व निर्धारित कर सकते हैं। बेशक, अल्ट्रासोनिक धड़कन और चक्र मोड को व्यक्तिगत रूप से भी सेट किया जा सकता है।
अपने सबसे सफल सोनीशन मापदंडों का पुन: उपयोग करने के लिए, आप पूर्व-निर्धारित मोड के रूप में विभिन्न सोनीशन मोड (जैसे सोनिकेशन समय, तीव्रता, चक्र मोड आदि) को बचा सकते हैं, ताकि वे आसान और तेजी से फिर से शुरू हो सकें।
अधिक परिचालन सुविधा के लिए, सभी डिजिटल अल्ट्रासोनिक इकाइयों को किसी भी सामान्य ब्राउज़र (जैसे, इंटरनेट एक्सप्लोरर, सफारी, क्रोम आदि) में ब्राउज़र रिमोट कंट्रोल के माध्यम से संचालित किया जा सकता है। लैन कनेक्शन एक साधारण प्लग-एन-प्ले सेटअप है और इसके लिए किसी अतिरिक्त सॉफ़्टवेयर इंस्टॉलेशन की आवश्यकता नहीं है।
हम Hielscher में जानते हैं कि जैविक नमूनों के सफल sonication सटीकता और repeatability की आवश्यकता है. इसलिए, हमने अपने अल्ट्रासोनिकेटर को सभी विशेषताओं के साथ स्मार्ट उपकरणों के रूप में डिज़ाइन किया है जो एक कुशल, विश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सुविधाजनक नमूना तैयार करने में सक्षम हैं।
नीचे दी गई तालिका आपको अल्ट्रासोनिक माइक्रो-टिप्स और क्लासिक अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र से मल्टीसैम्पल अल्ट्रासोनिकेटर तक कई नमूनों की सुविधाजनक, विश्वसनीय तैयारी के लिए हमारे अल्ट्रासोनिक सिस्टम की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:
बैच वॉल्यूम | प्रवाह दर | अनुशंसित उपकरण |
---|---|---|
96-अच्छी तरह से / माइक्रोटिटर प्लेट्स | एन.ए. | UIP400MTP |
10 शीशियों à 0.5 करने के लिए 1.5mL | एन.ए. | UP200St पर VialTweeter |
अप्रत्यक्ष sonication के लिए CupHorn, उदाहरण के लिए 5 शीशियों तक | एन.ए. | UP200St_TD_CupHorn |
0.01 से 250mL | 5 से 100mL/मिनट | यूपी50एच |
0.01 से 500mL | 10 से 200mL/मिनट | यूपी100एच |
0.02 से 1L | 20 से 400mL/मिनट | यूपी200एचटी / यूपी200सेंट |
10 से 2000mL | 20 से 400mL/मिनट | यूपी200एचटी, UP400St |
0.25 से 5L | 0.05 से 1L/मिनट | यूआईपी500एचडीटी |
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अल्ट्रासोनिक बहु-नमूना तैयारी इकाई वायलट्वीटर अप करने के लिए 10 शीशियों के एक साथ sonication के लिए अनुमति देता है. क्लैंप-ऑन डिवाइस वायलप्रेस के साथ, तीव्र सोनीशन के लिए 4 अतिरिक्त ट्यूबों को सामने की ओर दबाया जा सकता है।
जानने के योग्य तथ्य
मेटाबोलॉमिक्स
मेटाबोलॉमिक्स छोटे अणुओं का अध्ययन है, जिन्हें मेटाबोलाइट्स के रूप में जाना जाता है, जो कोशिकाओं, बायोफ्लुइड, ऊतकों या जीवों के भीतर मौजूद होते हैं। इन छोटे अणुओं और एक जैविक प्रणाली के भीतर उनकी बातचीत को छतरी शब्द "मेटाबोलोम" के तहत संक्षेपित किया जाता है और अनुसंधान क्षेत्र को मेटाबोलॉमिक्स कहा जाता है। मेटाबोलोम अनुसंधान सटीक चिकित्सा के तेजी से उभरते क्षेत्र के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है। मेटाबोलोम की समझ और विभिन्न रोगों के साथ इसके संबंध में पर्यावरण, जीवन शैली, आनुवंशिकी और आणविक फेनोटाइप में व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के दौरान रोग की रोकथाम और नैदानिक देखभाल रणनीतियों को विकसित करने में मदद मिलती है। कोशिकाओं से मेटाबोलाइट अणुओं को मुक्त करने के लिए, अल्ट्रासोनिकेशन का उपयोग अक्सर जैविक प्रयोगशालाओं में पूर्व-विश्लेषणात्मक नमूना तैयार करने जैसे सेल व्यवधान, लसीका और प्रोटीन, लिपिड और अन्य अणुओं के निष्कर्षण के लिए किया जाता है।
साहित्य/सन्दर्भ
- Casale, A.M.; Cappucci, U.; Fanti, L.; Piacentini, L. (2019): Heterochromatin protein 1 (HP1) is intrinsically required for post-transcriptional regulation of Drosophila Germline Stem Cell (GSC) maintenance. Sci Rep 9, 4372 (2019).
- Ristola, M.; Arpiainen, S., Saleem, M.A.; Mathieson, P.W.; Welsh, G.I.; Lehtonen, S.; Holthöfer, H.(2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biol 10, 83 (2009).
- Kharchenko, P.V: et al. (2011): Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila. Nature. 2011 Mar 24; 471(7339): 480–485.