ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर नमूनों के अल्ट्रासोनिक लाइसिस
ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टर का व्यापक रूप से प्रयोगशालाओं में मॉडल जीव के रूप में उपयोग किया जाता है। इसलिए, लाइसिस, सेल व्यवधान, प्रोटीन निष्कर्षण और ड्रोसोफिला मेलानोगस्टर नमूनों के डीएनए बाल दर्द जैसे पूर्व-विश्लेषणात्मक तैयारी कदम अक्सर किए जाने चाहिए। अल्ट्रासोनिक डिसिमेब्रेटर विश्वसनीय और कुशल होते हैं और केवल अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों को समायोजित करके विभिन्न कार्यों जैसे लाइसिस, प्रोटीन निष्कर्षण या डीएनए विखंडन को आसानी से करने के लिए उपयोग किए जा सकते हैं। अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइजर इस प्रकार अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ लचीले उपकरण हैं।
अल्ट्रासोनिक लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण
लाइसिस, सेल घुलनशीलता, ऊतक समरूपता और प्रोटीन निष्कर्षण जैविक प्रयोगशालाओं में अल्ट्रासोनिक डिमेब्रेटर्स के लिए विशिष्ट कार्य हैं। अल्ट्रासोनिक डिसिमेम्ब्रेटर्स और सेल बाधित जानवरों के ऊतकों, कीड़ों (जैसे, ड्रोसोफिला मेलानोगेस्टर, सी एलिगेंस) या पौधों के नमूनों को समरूप बनाने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। अल्ट्रासोनिकेशन के बाद के अनुप्रयोगों सेल निलंबन और छर्रों के साथ ही इंट्रासेलुलर प्रोटीन की निकासी के lysis हैं।
अल्ट्रासोनिक लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण अत्यधिक विश्वसनीय और प्रजनन योग्य प्रक्रियाएं हैं, जो स्थापित प्रोटोकॉल के आधार पर की जा सकती हैं। चूंकि अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया तीव्रता को बिल्कुल आयाम, चक्र/पल्स मोड, तापमान और नमूना मात्रा जैसे सोनीशन मापदंडों के माध्यम से समायोजित किया जा सकता है, एक बार सिद्ध प्रोटोकॉल को एक ही परिणाम के साथ दोहराया जा सकता है।
- अत्यधिक कुशल
- विशिष्ट नमूना सामग्री के लिए समायोज्य
- किसी भी मात्रा के लिए उपयुक्त
- गैर-थर्मल उपचार
- प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम
- सरल और सुरक्षित
अल्ट्रासोनिक डीएनए और आरएनए विखंडन
सेल लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण के बाद, नमूना तैयार करने में एक आम आवश्यक कदम डीएनए, आरएनए और क्रोमेटिन का कतरन और विखंडन है, उदाहरण के लिए क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन (ChIP) से पहले। डीएनए और आरएनए विखंडन को शारीरिक ताकतों द्वारा डीएनए को एक साथ रखने वाले सहसंयोजक बंधनों को तोड़कर मज़बूती से हासिल किया जा सकता है । इस तरह के sonication के रूप में शारीरिक बाल काट का उपयोग करना, पहले डीएनए किस्में टूट रहे हैं, तो डीएनए छोटे टुकड़ों में खंडित है ।
अल्ट्रासोनिक डीएनए विखंडन एक लक्षित लंबाई के लिए डीएनए कतरनी में विश्वसनीय और कुशल है, जैसे 500bp (आधार जोड़े) । अल्ट्रासोनिक डीएनए विखंडन के प्रमुख फायदों में अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों और तीव्रता का सटीक नियंत्रण शामिल है। अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों को ट्यूनिंग सोनीशन तीव्रता, चक्र और समय ठीक से समायोजित किया जा सकता है। यह वांछित डीएनए आकार बनाना संभव बनाता है और लक्षित डीएनए लंबाई मज़बूती से उत्पादित होने के साथ-साथ पुन: उत्पन्न की जा सकती है। अल्ट्रासोनिक डीएनए कतरन भी उच्च आणविक वजन डीएनए टुकड़े बनाने के लिए आदर्श है।

ultrasonicator UP200Ht ड्रोसोफिला नमूनों के सोनिकेशन के लिए 2 मिमी माइक्रोटिप S26d2 के साथ
ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टर के अल्ट्रासोनिक लाइसिस के लिए प्रोटोकॉल
नीचे आप ड्रोसोफिला नमूनों के अल्ट्रासोनिक रूप से सहायता प्राप्त लाइसिस, प्रोटीन निष्कर्षण, और डीएनए या क्रोमेटिन विखंडन के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल पा सकते हैं।
क्रॉस-लिंकिंग इम्यूनोप्रिपिटेशन (क्लिप) परख के लिए अल्ट्रासोनिक लाइसिस
क्लिप परख के रूप में पहले कुछ संशोधनों के साथ रिपोर्ट किया गया था । 0 से 1 दिन पुरानी जंगली प्रकार की महिलाओं से लगभग 20 मिलीग्राम अंडाशय यूवी क्रॉसलिंक्ड (3 × 2000 μJ/cm2), 1 एमएल आरसीबी बफर (50 mM HEPES पीएच 7.4, में बर्फ पर समरूप थे 200 mM NaCl, 2.5 m M MgCl2, 0.1% ट्राइटन एक्स-100, 250 mm सुक्रोज, 1 mM DTT, 1× EDTA मुक्त पूर्ण प्रोटीज अवरोधक, 1 m M PMSF) 300 यू RNASEOUT के साथ पूरक और 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखा गया। समरूप बर्फ पर sonicated था, ८०% बिजली पर, 20 एस फटने में पांच बार एक ६० एस आराम के साथ Hielscher अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर का उपयोग कर UP100H (100 डब्ल्यू, 30 किलोहर्ट्ज) और अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16000 × ग्राम)। घुलनशील अर्क को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20 माइक्रोन प्रोटीन-जी डायनाबीच के साथ प्रीक्लियर किया गया था। आरएनए इनपुट (1%) के इम्यूनोब्लोटिंग और क्वांटिटेशन के नमूनों को हटाने के बाद, एचपी1 को एंटी-एचपी1 9ए9 एंटीबॉडी के साथ 450 माइक्रोन प्रीक्लियर्ड एक्सट्रूप इनक्यूबेशन से 40 माइक्रोन प्रोटीन-जी डायनाबीड्स के साथ 4 घंटे के लिए 4 घंटे के लिए इम्यूनोप्रिपिट किया गया था। इम्यूनोप्रिपिट्स को आरसीबी के साथ 4 बार धोया गया । इम्यूनोप्रिपिटेटेड आरएनए को स्पष्ट करने के लिए, छर्रे मोतियों को अल्ट्रापुरे डीईपीसी-उपचारित पानी के 100 माइक्रोन में 5 मिनट के लिए उबाला गया था। 900 माइक्रोन क्यूज़ोल रिएजेंट को आरएनए तैयारी के लिए बरामद सुपरनैंट में जोड़ा गया था। आरएनए शुद्ध का उपयोग निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ओलिगो डीटी, यादृच्छिक हेक्सामर्स और सुपरस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस III का उपयोग करके सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में किया गया था।
(कैसले एट अल 2019)
क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिपिटेशन परख के लिए अल्ट्रासोनिक लाइसिस
क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिपिटेशन मामूली संशोधनों के साथ मेनेट द्वारा वर्णित विधि के अनुसार किया गया था। 0 से 1 दिन पुरानी जंगली प्रकार की महिलाओं से लगभग 20 मिलीग्राम अंडाशय एनईबी बफर के 1 एमसीएल (पीएच 8.0 में 10 mm HEPES-Na, 0.1 m M EGTA-Na पीएच 8 में, समरूप थे, 0.5 m EDTA-Na पर पीएच 8, 1 m M DTT, 0.5% एनपी-40, 0.5 mM शुक्राणु, 0.15 m M शुक्राणु, 1× EDTA-मुक्त पूर्ण प्रोटीज अवरोधक) एक समरूप/ समरूप को पूर्व-ठंडा ग्लास डोउंस में स्थानांतरित कर दिया गया था और एक तंग मूसल के साथ 15 पूर्ण स्ट्रोक लागू किए गए थे। इसके बाद फ्री न्यूक्लियी को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6000xg पर सेंट्रलाइज्ड किया गया । नाभिक युक्त छर्रों एनईबी के 1 मिलील में फिर से निलंबित कर दिया गया और २०००० × जी पर सुक्रोज ग्रेडिएंट (एनईबी में १.६ एम सुक्रोज के ०.६५ एमएल, एनईबी में ०.३५ ml ऑफ ०.८ एम सुक्रोज) पर २०००० × जी पर अपकेंद्रित्र किया गया । गोली एनईबी के 1 एमसीएल में फिर से निलंबित कर दिया गया था और फॉर्मलडिहाइड को 1% की अंतिम एकाग्रता के लिए। नाभिक कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पार से जुड़े थे और १.३७५ एम ग्लाइसिन के 1/10 vol जोड़कर बुझा । नाभिक को 5 मिनट के लिए 6000 × जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा एकत्र किया गया था। एनईबी के 1 एमसीएल में नाभिक को दो बार धोया गया और लाइसिस बफर के 1 एमएल में पुनः निलंबित किया गया (पीएच 7.6, 140 mM NaCl में 15 m M HEPES-Na, 0.5 m EGTA, पीएच 8 में 1 m EDTA, 1% ट्राइटन एक्स-100, 0.5 एमएम डीटीटी, 0.1% ना डेऑक्सीकोटेल, 0.1% एसडीएस, 0.5% एन-लॉरॉयलसरकोसिन और 1× ईएफटीए-कंप्लीट फ्री प्रोटेस इनकेटर्स)। नाभिक एक Hielscher अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर का उपयोग कर ध्वनियुक्त थे UP100H (100 डब्ल्यू, 30 किलोहर्ट्ज) 20 एस पर और बर्फ पर 1 मिनट के लिए छह बार । सोनिकेटेड नाभिक को 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 13000 × जी पर अपकेंद्री किया गया था। सोनिकेटेड क्रोमेटिन का अधिकांश लंबाई में 500 से 1000 बेस जोड़े (बीपी) था। प्रत्येक इम्यूनोप्रिपिशन के लिए, एचपी1 9ए 9 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (घूर्णन पहिया में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे) के 10 माइक्रोग्राम की उपस्थिति में क्रोमेटिन के 15 माइक्रोन को इनक्यूबेटेड किया गया था। फिर, 50 μl dynabeads प्रोटीन जी जोड़ा गया था और इनक्यूबेशन 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जारी रखा गया था। सुपरनेटेंट को छोड़ दिया गया और नमूनों को लाइसिस बफर (प्रत्येक वॉश 15 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर) और दो बार ते बफर (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl पीएच 8 में) में दो बार धोया गया । क्रोमेटिन को दो चरणों में मोतियों से निकाला गया था; एल्यूटेशन बफर 1 (10 एमएम ईडीटीए, 1% एसडीएस, पीएच 8 पर 50 एमएम ट्रिशसीएल) के 100 माइक्रोन में पहला, 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर, इसके बाद अपकेंद्रित्र और सुपरनिटेंट की वसूली। मोतियों की सामग्री को 100 माइक्रोन में टीई + 0.67% एसडीएस में फिर से निकाला गया। संयुक्त एल्यूएट (200 माइक्रोन) को क्रॉस-लिंक रिवर्स करने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट किया गया था और 65 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 50 माइक्रोन/एमएल RNaseA द्वारा और 500 माइक्रोन/एमएल प्रोटीनेज कश्मीर द्वारा 65 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए इलाज किया गया था। नमूने फिनॉल-क्लोरोफॉर्म निकाले गए और इथेनॉल उपजी । डीएनए को 25 माइक्रोन पानी में फिर से निलंबित कर दिया गया । डीएनए इम्यूनोप्रिपिशिटेटेड के साथ आणविक विश्लेषण को अधिकतम करने के लिए, उम्मीदवार जीन को एक ही प्रतिक्रिया में समान पिघलने वाले प्राइमर के दो अलग-अलग सेटों का उपयोग करके एक अनुकूलित डुप्लेक्स-पीसीआर प्रोटोकॉल के माध्यम से जोड़े में परिलक्षित किया गया था।
(कैसले एट अल 2019)

UP200St TD_CupHorn डीएनए और क्रोमेटिन कतरनी जैसे नमूनों के अप्रत्यक्ष रूप से सोनीटेशन के लिए
जैविक नमूनों के लिए उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक सेल बाधित
सेल व्यवधान, लाइसिस, प्रोटीन निष्कर्षण, डीएनए, आरएनए और क्रोमेटिन विखंडन के साथ-साथ अन्य पूर्व-विश्लेषणात्मक नमूना तैयारी चरणों के लिए उच्च प्रदर्शन वाले अल्ट्रासोनिक्स की बात आती है तो हिल्स्चर अल्ट्रासोनिक्स आपका लंबे अनुभवी साथी है। अल्ट्रासोनिक लैब होमोजेनाइजर और नमूना तैयारी इकाइयों के एक व्यापक पोर्टफोलियो की पेशकश करते हुए, Hielscher अपने जैविक आवेदन और आवश्यकताओं के लिए आदर्श अल्ट्रासोनिक डिवाइस है।
माइक्रो-टिप जैसे क्लासिक प्रोब-टाइप अल्ट्रासोनिकेटर UP200St (200W; देखें चित्र बाएं) या अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी इकाइयों में से एक VialTweeter या UP200ST_TD_CupHorn VialHolder के साथ अनुसंधान और विश्लेषणात्मक प्रयोगशालाओं में पसंदीदा मॉडल हैं। क्लासिक अल्ट्रासोनिक जांच आदर्श है, जब कम नमूने तैयार lysed, निकाला या खंडित किया जाना चाहिए । नमूना तैयारी इकाइयां VialTweeter और UP200St_TD_CupHorn क्रमशः 10 या 5 शीशियों तक के एक साथ सोनीफिकेशन के लिए अनुमति देती हैं।
यदि उच्च नमूना संख्या (जैसे 96-अच्छी प्लेटें, माइक्रोटिटर प्लेटें आदि) को संसाधित किया जाना चाहिए, यूआईपी400एमटीपी आदर्श सोनीशन सेटअप है। UIP400MTP एक बड़ा कपहॉर्न की तरह कार्य करता है, जो पानी से भरा हुआ है और माइक्रो-वेल प्लेटों को पकड़ने के लिए पर्याप्त स्थान है। एक 400 वाट शक्तिशाली अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर द्वारा संचालित, UIP400MTP कोशिकाओं को बाधित करने के लिए बहु-अच्छी प्लेटों का एक बहुत ही समान और तीव्र सोनीसेशन बचाता है, नमूने, पैलेटिंग छर्रों, निकालने प्रोटीन या कतरनी डीएनए।
स्मार्ट सॉफ्टवेयर के माध्यम से सटीक नियंत्रण
200 वाट ऊपर की ओर से सभी Hielscher sonication समाधान एक डिजिटल रंग टच स्क्रीन और एक बुद्धिमान सॉफ्टवेयर से सुसज्जित हैं। स्मार्ट डेटा प्रोटोकॉलिंग के माध्यम से सभी अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों को स्वचालित रूप से सेव कर दिया जाता है क्योंकि अल्ट्रासोनिकेटर शुरू होते ही बिल्ट-इन एसडी-कार्ड पर सीएसवी फ़ाइल होती है। यह अनुसंधान और प्रोटोकॉलिंग को इतना अधिक सुविधाजनक बनाता है। सोनीशन परीक्षण या नमूना तैयारी के बाद, आप बस प्रत्येक सोनीशन रन के सोनीशन मापदंडों की समीक्षा कर सकते हैं और उनकी तुलना कर सकते हैं।
सहज मेनू के माध्यम से, कई पैरामीटर को सोनीशन से पहले पूर्व निर्धारित किया जा सकता है: उदाहरण के लिए, नमूने में तापमान को नियंत्रित करने और इसके थर्मल क्षरण को रोकने के लिए, नमूना तापमान की एक ऊपरी सीमा निर्धारित की जा सकती है। एक प्लग करने योग्य तापमान सेंसर, जो अल्ट्रासोनिक इकाई के साथ आता है, वास्तविक सोनीशन तापमान पर अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर प्रतिक्रिया देता है। जब ऊपरी तापमान सीमा तक पहुंच जाता है, तो अल्ट्रासोनिक डिवाइस सेट की निचली सीमा तक रोकता है ∆एक तक नहीं पहुंच जाता है और फिर स्वचालित रूप से फिर से ध्वनिक शुरू हो जाता है।
यदि एक विशिष्ट ऊर्जा इनपुट के साथ सोनीशन की आवश्यकता है, तो आप सोनीशन रन की अंतिम अल्ट्रासोनिक ऊर्जा को पूर्व निर्धारित कर सकते हैं। बेशक, अल्ट्रासोनिक स्पंदन और चक्र मोड व्यक्तिगत रूप से भी सेट किया जा सकता है।
अपने सबसे सफल सोनीशन मापदंडों का फिर से उपयोग करने के लिए, आप विभिन्न सोनीशन मोड (जैसे सोनीशन समय, तीव्रता, चक्र मोड आदि) को पूर्व-सेट मोड के रूप में बचा सकते हैं, ताकि वे आसान और तेजी से फिर से शुरू हो सकें।
अधिक परिचालन सुविधा के लिए, सभी डिजिटल अल्ट्रासोनिक इकाइयों को किसी भी आम ब्राउज़र (जैसे, InternetExplorer, सफारी, क्रोम आदि) में ब्राउज़र रिमोट कंट्रोल के माध्यम से संचालित किया जा सकता है। लैन कनेक्शन एक साधारण प्लग-एन-प्ले सेटअप है और इसके लिए कोई अतिरिक्त सॉफ्टवेयर इंस्टॉलेशन की आवश्यकता नहीं है।
हम Hielscher में पता है कि जैविक नमूनों के सफल सोनीशन सटीक और पुनरावृत्ति की आवश्यकता है । इसलिए, हमने अपने अल्ट्रासोनिकेटर को सभी सुविधाओं के साथ स्मार्ट उपकरणों के रूप में डिजाइन किया है जो एक कुशल, विश्वसनीय, प्रजनन योग्य और सुविधाजनक नमूना तैयारी को सक्षम करते हैं।
नीचे दी गई तालिका आपको कई नमूनों की सुविधाजनक, विश्वसनीय तैयारी के लिए अल्ट्रासोनिक माइक्रो-टिप्स और क्लासिक अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइजर्स से मल्टीसैंपल अल्ट्रासोनिकेटर्स तक हमारे अल्ट्रासोनिक सिस्टम की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:
बैच वॉल्यूम | प्रवाह की दर | अनुशंसित उपकरणों |
---|---|---|
96-अच्छी तरह से/ | एन.ए. | यूआईपी400एमटीपी |
10 शीशियां à 0.5 से 1.5mL | एन.ए. | UP200St पर VialTweeter |
अप्रत्यक्ष सोनीफिकेशन के लिए क्यूहॉर्न, उदाहरण के लिए 5 शीशियों तक | एन.ए. | UP200ST_TD_CupHorn |
0.01 से 250mL | 5 से 100mL/मिनट | UP50H |
0.01 से 500mL | 10 से 200 मील / मिनट | UP100H |
0.02 से 1L | 20 से 400 एमएल / मिनट | UP200Ht / UP200St |
10 से 2000 मील | 20 से 400 एमएल / मिनट | UP200Ht, UP400St |
0.25 से 5L | 0.05 से 1L/मिनट | UIP500hdT |
हमसे संपर्क करें! / हमसे पूछें!

अल्ट्रासोनिक मल्टी-सैंपल तैयारी इकाई VialTweeter 10 शीशियों तक के एक साथ सोनीकेशन के लिए अनुमति देता है। क्लैंप-ऑन डिवाइस VialPress के साथ, तीव्र सोनीफिकेशन के लिए सामने 4 अतिरिक्त ट्यूबों को दबाया जा सकता है।
जानने के योग्य तथ्य
मेटाबोलोमिक्स
मेटाबोलोमिक्स छोटे अणुओं का अध्ययन है, जिसे मेटाबोलाइट्स के रूप में जाना जाता है, जो कोशिकाओं, बायोफ्लुइड, ऊतकों या जीवों के भीतर मौजूद हैं। इन छोटे अणुओं और जैविक प्रणाली के भीतर उनकी बातचीत को छाता शब्द "मेटाबोलोम" के तहत संक्षेप में प्रस्तुत किया जाता है और अनुसंधान क्षेत्र को मेटाबोलोमिक्स कहा जाता है। मेटाबोलोम अनुसंधान सटीक चिकित्सा के तेजी से उभरते क्षेत्र के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है। मेटाबोलोम की समझ और विभिन्न रोगों के साथ इसके संबंध पर्यावरण, जीवन शैली, आनुवंशिकी और आणविक फेनोटाइप में व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के दौरान रोग की रोकथाम और नैदानिक देखभाल रणनीतियों को विकसित करने में मदद करता है। कोशिकाओं से मेटाबोलाइट अणुओं को छोड़ने के लिए, सेल व्यवधान, लाइसिस और प्रोटीन, लिपिड और अन्य अणुओं की निकासी जैसे पूर्व-विश्लेषणात्मक नमूना तैयारी के लिए जैविक प्रयोगशालाओं में अल्ट्रासोनिकेशन का अक्सर उपयोग किया जाता है।
साहित्य/संदर्भ
- Casale, A.M.; Cappucci, U.; Fanti, L.; Piacentini, L. (2019): Heterochromatin protein 1 (HP1) is intrinsically required for post-transcriptional regulation of Drosophila Germline Stem Cell (GSC) maintenance. Sci Rep 9, 4372 (2019).
- Ristola, M.; Arpiainen, S., Saleem, M.A.; Mathieson, P.W.; Welsh, G.I.; Lehtonen, S.; Holthöfer, H.(2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biol 10, 83 (2009).
- Kharchenko, P.V: et al. (2011): Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila. Nature. 2011 Mar 24; 471(7339): 480–485.