Drosophila Melanogaster नमूनों का अल्ट्रासोनिक लिसिस

प्रयोगशालाओं में Drosophila melanogaster का व्यापक रूप से मॉडल जीव के रूप में उपयोग किया जाता है। इसलिए, Drosophila melanogaster नमूनों के लिसिस, कोशिका विघटन, प्रोटीन निष्कर्षण और DNA शीयरिंग जैसे विश्लेषण-पूर्व तैयारी चरणों को बार-बार पूरा करना पड़ता है। अल्ट्रासोनिक डिसमेम्ब्रेटर विश्वसनीय और कुशल होते हैं तथा केवल अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों को समायोजित करके लिसिस, प्रोटीन निष्कर्षण या DNA खंडन जैसे विभिन्न कार्य आसानी से करने के लिए उपयोग किए जा सकते हैं। इस प्रकार, अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र व्यापक अनुप्रयोगों वाले लचीले उपकरण हैं।

अल्ट्रासोनिक लिसिस और प्रोटीन निष्कर्षण

जैविक प्रयोगशालाओं में लिसिस, कोशिकाओं का विलेयीकरण, ऊतक समांगीकरण और प्रोटीन निष्कर्षण अल्ट्रासोनिक डिसमेम्ब्रेटर के सामान्य कार्य हैं। अल्ट्रासोनिक डिसमेम्ब्रेटर और कोशिका विघटन उपकरण पशु ऊतकों, कीटों (जैसे, Drosophila melanogaster, C. elegans) या पादप नमूनों के समांगीकरण के लिए अत्यंत उपयुक्त हैं। अल्ट्रासोनिकेशन के आगे के अनुप्रयोगों में कोशिका निलंबनों और पेलेट का लिसिस तथा अंतःकोशिकीय प्रोटीनों का निष्कर्षण शामिल हैं।
अल्ट्रासोनिक लिसिस और प्रोटीन निष्कर्षण अत्यंत विश्वसनीय और पुनरुत्पादनीय प्रक्रियाएँ हैं, जिन्हें स्थापित प्रोटोकॉल के आधार पर किया जा सकता है। चूँकि आयाम, चक्र / पल्स मोड, तापमान और नमूने के आयतन जैसे सोनिकेशन मापदंडों के माध्यम से अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया की तीव्रता को सटीक रूप से समायोजित किया जा सकता है, इसलिए एक बार प्रमाणित हो जाने पर प्रोटोकॉल को बार-बार दोहराकर समान परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।

अल्ट्रासोनिक DNA और RNA खंडन

कोशिका लिसिस और प्रोटीन निष्कर्षण के बाद, नमूना तैयारी में सामान्यतः आवश्यक एक चरण DNA, RNA और क्रोमैटिन की शीयरिंग और खंडन है, उदाहरण के लिए क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (ChIP) से पहले। भौतिक बलों द्वारा DNA को एक साथ जोड़े रखने वाले सहसंयोजक बंधों को तोड़कर DNA और RNA का खंडन विश्वसनीय रूप से किया जा सकता है। सोनिकेशन जैसी भौतिक शीयरिंग का उपयोग करने पर पहले DNA के तंतु टूटते हैं, फिर DNA छोटे टुकड़ों में खंडित हो जाता है।
अल्ट्रासोनिक DNA खंडन, DNA की शीयरिंग करके उसे लक्षित लंबाई, जैसे 500bp (क्षारक युग्म), तक लाने में विश्वसनीय और कुशल है। अल्ट्रासोनिक DNA खंडन के प्रमुख लाभों में अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों और तीव्रता का सटीक नियंत्रण शामिल है। सोनिकेशन की तीव्रता, चक्रों और समय को सटीक रूप से निर्धारित करके अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों को समायोजित किया जा सकता है। इससे वांछित आकार के DNA बनाना संभव होता है और लक्षित DNA लंबाई को विश्वसनीय रूप से प्राप्त करने के साथ-साथ बार-बार पुनः प्राप्त भी किया जा सकता है। उच्च आणविक भार वाले DNA खंड बनाने के लिए भी अल्ट्रासोनिक DNA शीयरिंग आदर्श है।

Drosophila melanogaster के अल्ट्रासोनिक लिसिस के प्रोटोकॉल

नीचे Drosophila नमूनों के अल्ट्रासोनिक सहायता प्राप्त लिसिस, प्रोटीन निष्कर्षण तथा DNA या क्रोमैटिन खंडन के विभिन्न प्रोटोकॉल दिए गए हैं।

क्रॉस-लिंकिंग इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (CLIP) परख के लिए अल्ट्रासोनिक लिसिस

CLIP परख कुछ संशोधनों के साथ पहले वर्णित विधि के अनुसार की गई। 0 से 1 दिन की आयु वाली वन्य-प्रकार की मादाओं से प्राप्त लगभग 20 mg अंडाशयों को UV द्वारा क्रॉस-लिंक किया गया (3 × 2000 μJ/cm2), 300 U RNAseOUT मिलाए गए 1 mL RCB बफर (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM सुक्रोज़, 1 mM DTT, 1× EDTA-मुक्त Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) में बर्फ पर समांगीकृत किया गया और 30 min तक बर्फ पर रखा गया। होमोजेनेट का बर्फ पर, 80% शक्ति पर, 20 s के बर्स्ट में पाँच बार सोनिकेशन किया गया, प्रत्येक बर्स्ट के बीच 60 s का विश्राम दिया गया और इसके लिए प्रयुक्त उपकरण था Hielscher अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर UP100H (100 W, 30 kHz) और होमोजेनेट को अपकेंद्रित किया गया (4°C पर 5 min के लिए 16,000 × g)। घुलनशील अर्क को 20 μl Protein-G dynabeads के साथ 4°C पर 20 min तक प्रीक्लियर किया गया। इम्यूनोब्लॉटिंग और इनपुट RNA (1%) के परिमाण-निर्धारण के लिए नमूने निकालने के बाद, 450 μl प्रीक्लियर किए गए अर्क से anti-HP1 9A9 एंटीबॉडी की सहायता से, 50 μl Protein-G dynabeads के साथ 4 h तक ऊष्मायन करके HP1 का इम्यूनोप्रेसिपिटेशन किया गया। इम्यूनोप्रेसिपिटेट को RCB से 4 बार धोया गया। इम्यूनोप्रेसिपिटेशन द्वारा अवक्षेपित RNA के एल्यूशन के लिए, पेलेट के रूप में एकत्र बीड्स को 100 μL UltraPure DEPC-treated Water में 5 min तक उबाला गया। RNA तैयार करने के लिए प्राप्त अधिप्लवी में 900 μL Qiazol Reagent मिलाया गया। शुद्ध किए गए RNA का उपयोग निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार oligo dT, रैंडम हेक्सामर और SuperScript रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ III की सहायता से cDNA संश्लेषित करने के लिए टेम्पलेट के रूप में किया गया।
(Cassale et al. 2019)

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन परीक्षण के लिए अल्ट्रासोनिक लयन

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन, Menet द्वारा वर्णित विधि के अनुसार मामूली संशोधनों के साथ किया गया। 0 से 1 दिन की आयु वाली वाइल्ड-टाइप मादाओं से प्राप्त लगभग 20 mg अंडाशयों को 1 mL NEB बफ़र (pH 8.0 पर 10 mM HEPES-Na, 10 mM NaCl, pH 8 पर 0.1 mM EGTA-Na, pH 8 पर 0.5 mM EDTA-Na, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM स्पर्मिडीन, 0.15 mM स्पर्मीन, 1× EDTA-मुक्त Complete Protease Inhibitors) में होमोजेनाइज़र / इमर्शन डिस्पर्सर की सहायता से 1 min तक (3000 rpm पर) समांगीकृत किया गया। होमोजेनेट को पहले से ठंडे किए गए काँच के डाउंस होमोजेनाइज़र में स्थानांतरित किया गया और कसकर फिट होने वाले मूसल से 15 पूर्ण स्ट्रोक लगाए गए। इसके बाद मुक्त केंद्रकों को 4°C पर 10 min के लिए 6000xg पर अपकेंद्रित किया गया। केंद्रक-युक्त पेलेट को 1 mL NEB में पुनः निलंबित किया गया और सुक्रोज़ प्रवणता (NEB में 1.6 M सुक्रोज़ का 0.65 mL, NEB में 0.8 M सुक्रोज़ का 0.35 mL) पर 20 min के लिए 20,000 × g पर अपकेंद्रित किया गया। पेलेट को 1 mL NEB में पुनः निलंबित किया गया और फ़ॉर्मैल्डिहाइड मिलाकर उसकी अंतिम सांद्रता 1% की गई। केंद्रकों को कमरे के तापमान पर 10 min तक क्रॉस-लिंक किया गया और 1.375 M ग्लाइसिन का 1/10 आयतन मिलाकर अभिक्रिया रोकी गई। केंद्रकों को 6000 × g पर 5 min तक अपकेंद्रण करके एकत्र किया गया। केंद्रकों को 1 mL NEB में दो बार धोया गया और 1 mL लयन बफ़र (pH 7.6 पर 15 mM HEPES-Na, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, pH 8 पर 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% Na डीऑक्सीकोलेट, 0.1% SDS, 0.5% N-लॉरॉयलसार्कोसिन और 1× EDTA-मुक्त Complete Protease Inhibitors) में पुनः निलंबित किया गया। केंद्रकों का सोनिकेशन Hielscher अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर UP100H (100 W, 30 kHz) का उपयोग करके छह बार किया गया, जिसमें प्रत्येक बार 20 s तक सोनिकेशन किया गया और 1 min तक बर्फ पर रखा गया। सोनिकेशन किए गए केंद्रकों को 4°C पर 4 min के लिए 13,000 × g पर अपकेंद्रित किया गया। सोनिकेशन किए गए अधिकांश क्रोमैटिन की लंबाई 500 से 1000 बेस पेयर (bp) थी। प्रत्येक इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के लिए, 15 μg क्रोमैटिन को 10 μg HP1 9A9 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की उपस्थिति में ऊष्मायित किया गया (घूर्णन चक्र पर 4°C पर 3 h)। फिर, 50 μl dynabeads protein G मिलाया गया और 4°C पर रात भर ऊष्मायन जारी रखा गया। अधिप्लवी को हटा दिया गया और नमूनों को लयन बफ़र में दो बार (प्रत्येक धुलाई 4 °C पर 15 min तक) तथा TE बफ़र (1 mM EDTA, pH 8 पर 10 mM TrisHCl) में दो बार धोया गया। बीड्स से क्रोमैटिन का एल्यूशन दो चरणों में किया गया; पहले 100 μl एल्यूशन बफ़र 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, pH 8 पर 50 mM TrisHCl) में 65°C पर 15 min तक, जिसके बाद अपकेंद्रण करके अधिप्लवी प्राप्त किया गया। बीड्स की सामग्री का 100 μl TE + 0.67% SDS में पुनः निष्कर्षण किया गया। संयुक्त एल्यूएट (200 μl) को क्रॉस-लिंक हटाने के लिए 65°C पर रात भर ऊष्मायित किया गया और 50 μg/ml RNaseA से 65°C पर 15 min तक तथा 500 μg/ml Proteinase K से 65°C पर 3 h तक उपचारित किया गया। नमूनों का फ़िनॉल–क्लोरोफ़ॉर्म से निष्कर्षण किया गया और एथेनॉल से अवक्षेपण किया गया। DNA को 25 μl पानी में पुनः निलंबित किया गया। इम्यूनोप्रेसिपिटेशन द्वारा प्राप्त DNA से अधिकतम आणविक विश्लेषण करने के लिए, एक ही अभिक्रिया में समान गलन तापमान वाले प्राइमरों के दो अलग-अलग सेट का उपयोग करके एक अनुकूलित डुप्लेक्स-PCR प्रोटोकॉल के माध्यम से संभावित जीनों का जोड़ों में प्रवर्धन किया गया।
(Casale et al. 2019)
 

जैविक नमूनों के लिए उच्च-प्रदर्शन वाले अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटक

कोशिका विघटन, लयन, प्रोटीन निष्कर्षण, DNA, RNA और क्रोमैटिन के खंडीकरण तथा विश्लेषण से पहले नमूना तैयारी के अन्य चरणों के लिए उच्च-प्रदर्शन वाले अल्ट्रासोनिकेटर के मामले में Hielscher Ultrasonics आपका लंबे अनुभव वाला साझेदार है। अल्ट्रासोनिक प्रयोगशाला होमोजेनाइज़र और नमूना तैयारी इकाइयों की व्यापक श्रृंखला के साथ, Hielscher के पास आपके जैविक अनुप्रयोग और आवश्यकताओं के लिए आदर्श अल्ट्रासोनिक उपकरण है।
माइक्रो-टिप वाला पारंपरिक प्रोब-प्रकार का अल्ट्रासोनिकेटर, जैसे UP200St (200W; बाईं ओर चित्र देखें), या अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी इकाइयों में से कोई एक, जैसे VialTweeter या UP200ST_TD_CupHorn VialHolder के साथ, अनुसंधान और विश्लेषणात्मक प्रयोगशालाओं में पसंदीदा मॉडल हैं। पारंपरिक अल्ट्रासोनिक प्रोब तब आदर्श होता है, जब कम संख्या में नमूनों का लयन, निष्कर्षण या खंडीकरण करना हो। नमूना तैयारी इकाइयाँ VialTweeter और UP200St_TD_CupHorn क्रमशः 10 या 5 वायल तक का एक साथ सोनिकेशन करने की सुविधा देती हैं।
यदि बड़ी संख्या में नमूनों (जैसे 96-वेल प्लेट, माइक्रोटाइटर प्लेट आदि) को संसाधित करना हो, तो UIP400MTP आदर्श सोनिकेशन व्यवस्था है। UIP400MTP एक बड़े cuphorn की तरह काम करता है, जो पानी से भरा होता है और जिसमें माइक्रो-वेल प्लेट रखने के लिए पर्याप्त जगह होती है। 400 watts के शक्तिशाली अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर से संचालित UIP400MTP मल्टी-वेल प्लेटों का बहुत एकसमान और तीव्र सोनिकेशन करता है, ताकि कोशिकाओं का विघटन, नमूनों का लयन, पेलेट का विलेयीकरण, प्रोटीन का निष्कर्षण या अपरूपण द्वारा DNA का खंडीकरण किया जा सके।

स्मार्ट सॉफ़्टवेयर के माध्यम से सटीक नियंत्रण

200 वाट और उससे अधिक क्षमता वाले Hielscher के सभी सोनिकेशन समाधान डिजिटल रंगीन टच-स्क्रीन और बुद्धिमान सॉफ़्टवेयर से सुसज्जित हैं। स्मार्ट डेटा अभिलेखन के माध्यम से, अल्ट्रासोनिकेटर शुरू होते ही सभी अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंड अंतर्निर्मित SD-कार्ड पर CSV फ़ाइल के रूप में स्वतः सहेज लिए जाते हैं। इससे अनुसंधान और अभिलेखन बहुत अधिक सुविधाजनक हो जाते हैं। सोनिकेशन परीक्षणों या नमूना तैयारी के बाद, आप प्रत्येक सोनिकेशन रन के सोनिकेशन मापदंडों की आसानी से समीक्षा और तुलना कर सकते हैं।
सहज मेनू के माध्यम से सोनिकेशन से पहले अनेक मापदंड निर्धारित किए जा सकते हैं: उदाहरण के लिए, नमूने का तापमान नियंत्रित करने और उसके तापीय अपघटन को रोकने के लिए नमूने के तापमान की ऊपरी सीमा निर्धारित की जा सकती है। अल्ट्रासोनिक इकाई के साथ मिलने वाला, प्लग लगाकर जोड़ा जा सकने वाला तापमान सेंसर अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर को वास्तविक सोनिकेशन तापमान की जानकारी देता है। ऊपरी तापमान सीमा तक पहुँचने पर अल्ट्रासोनिक उपकरण तब तक रुक जाता है, जब तक निर्धारित ∆T की निचली सीमा तक तापमान नहीं पहुँच जाता, और फिर स्वतः दोबारा सोनिकेशन शुरू कर देता है।
यदि किसी विशिष्ट ऊर्जा निवेश के साथ सोनिकेशन आवश्यक हो, तो आप सोनिकेशन रन की अंतिम अल्ट्रासोनिक ऊर्जा पहले से निर्धारित कर सकते हैं। बेशक, अल्ट्रासोनिक स्पंदन और चक्र मोड भी अलग-अलग निर्धारित किए जा सकते हैं।
अपने सबसे सफल सोनिकेशन मापदंडों का दोबारा उपयोग करने के लिए, आप विभिन्न सोनिकेशन मोड (जैसे सोनिकेशन समय, तीव्रता, चक्र मोड आदि) को पूर्वनिर्धारित मोड के रूप में सहेज सकते हैं, ताकि उन्हें आसानी से और जल्दी दोबारा शुरू किया जा सके।
संचालन को अधिक सुविधाजनक बनाने के लिए, सभी डिजिटल अल्ट्रासोनिक इकाइयों को किसी भी प्रचलित ब्राउज़र (जैसे InternetExplorer, Safari, Chrome आदि) में ब्राउज़र रिमोट कंट्रोल के माध्यम से संचालित किया जा सकता है। LAN कनेक्शन एक सरल प्लग-एन-प्ले व्यवस्था है और इसके लिए किसी अतिरिक्त सॉफ़्टवेयर को इंस्टॉल करने की आवश्यकता नहीं होती।
Hielscher में हम जानते हैं कि जैविक नमूनों के सफल सोनिकेशन के लिए सटीकता और पुनरावर्तनीयता आवश्यक हैं। इसलिए हमने अपने अल्ट्रासोनिकेटर को ऐसे स्मार्ट उपकरणों के रूप में डिज़ाइन किया है, जिनमें कुशल, विश्वसनीय, पुनरुत्पादनीय और सुविधाजनक नमूना तैयारी संभव बनाने वाली सभी सुविधाएँ हैं।

नीचे दी गई तालिका अनेक नमूनों की सुविधाजनक और विश्वसनीय तैयारी के लिए हमारी अल्ट्रासोनिक प्रणालियों की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है, जिनमें अल्ट्रासोनिक माइक्रो-टिप और पारंपरिक अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र से लेकर MultiSample अल्ट्रासोनिकेटर तक शामिल हैं: