• डीएनए और आरएनए कतरनी के दौरान डीएनए अणुओं को छोटे टुकड़ों में तोड़ दिया जाता है । डीएनए/आरएनए विखंडन अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) के लिए पुस्तकालयों बनाने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण नमूना प्रस्तुत करने के चरणों में से एक है ।
• अल्ट्रासोनिक डीएनए बाल काटना ध्वनिक गुहिकायन की ताकतों का उपयोग करता डीएनए या 100 के टुकड़ों में शाही सेना को तोड़ने के लिए – 5kb बीपी।
• अल्ट्रासोनिक बाल काटना सटीक डीएनए विखंडन और वांछित डीएनए लंबाई करने के लिए रूपांतरण के लिए अनुमति देता है।

अल्ट्रासोनिकेशन का उपयोग करके डीएनए कतरन

Hielscher Ultrasonics डीएनए, आरएनए और क्रोमेटिन बाल काटना के लिए विभिन्न अल्ट्रासाउंड आधारित समाधान प्रदान करता है। एक microtip का उपयोग कर एक जांच-प्रकार ultrasonicators (जैसे UP100H) प्रत्यक्ष sonication के लिए के बीच चुनें, या VialTweeeter या एक साथ विभिन्न नमूनों की अप्रत्यक्ष डीएनए तैयार करने के लिए अल्ट्रासोनिक cuphorn का उपयोग करें। Hielscher आदर्श उपकरण अपनी आवश्यकताओं पर विचार प्रदान करता है: मौसम तुम 1 या 10 के लिए नमूने, माइक्रोलीटर से लीटर मात्रा को मात्रा है – Hielscher अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर सही लंबाई में डीएनए, आरएनए और chromatin टुकड़े तैयार करने के लिए अपनी आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए उपलब्ध हैं। Reproducibility, आसान संचालन और सटीक नियंत्रण अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए एक विश्वसनीय पुस्तकालय के लिए अनुमति देते हैं।
एंजाइमी डीएनए विखंडन के विपरीत, अल्ट्रासोनिक बाल काटना किसी भी रसायनों को जोड़े बिना शुद्ध यांत्रिक कतरनी बलों लागू होता है। प्रक्रिया मापदंडों की सटीक सेटिंग करके, अल्ट्रासोनिक कर्तन उच्च आणविक भार डीएनए टुकड़े (प्लाज्मिड और जीनोमिक डीएनए) पैदा करता है।
शुद्ध न्यूक्लिक एसिड करने के लिए या एक विखंडन चरण के बाद पहले परिलक्षित किया जा सकता है।
Sonication मानकों (बिजली, नाड़ी चक्र / फटने, समय और तापमान) सॉफ्टवेयर सेटिंग के माध्यम से सुरक्षित रूप से नियंत्रित किया जा सकता।

अल्ट्रासोनिक डीएनए बाल काटना के लिए प्रोटोकॉल

Chromatin immunoprecipitation परख के लिए

संक्षेप में, कोशिकाओं को 60 मिमी-व्यास व्यंजन (400,000 प्रति पकवान) में चढ़ाया गया था और RhoA siRNA (जैसा वर्णन किया गया है) से संक्रमित किया गया था; 72 एच के बाद, वे फॉर्मूल्डहाइड (अंतिम एकाग्रता, 1%) से 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए को प्रोटीन से जोड़ने के लिए सेते थे। क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया 1.25 मिलीग्राम / एल ग्लाइसीन की दसवीं मात्रा के अतिरिक्त, 125 मिमीोल / एल अंतिम एकाग्रता प्रदान करके बुझ गई थी। कोशिकाओं को बर्फ-ठंड पीबीएस के साथ दो बार धोया गया था, रेडियोिमम्यूनोप्रेयरे परख बफर [150 एमएमओएल / एल नाक, 1% एनपी 40, 0.5% डीओक्सिकोलेट, 0.1% एसडीएस, 5 एमएमओएल / एल ईडीटीए, 50 एमएमओएल / एल ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.0) में पुन: )] 1 मिमीोल / एल फेनिलमेथिलसल्फोनील फ्लोराइड, 1 एजी / एमएल एप्रोटिनिन, और 1 एजी / एमएल पेप्स्टैटिन ए युक्त है, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखा जाता है। फिर, सेल lysates बर्फ पर एक के साथ sonicated थे हिल्सचर UP200S अल्ट्रासाउंड sonicator (3 x 40 रों, आयाम 40%, चक्र 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) पार से जुड़े chromatins तक 200 और 1000 बीपी के बीच डीएनए टुकड़े उपज के लिए sheared रहे थे। पूरे lysate का दसवां विभिन्न नमूनों में डीएनए की मात्रा quantitate करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और के रूप में माना “कुल इनपुट डीएनए”। Supernatants सामन शुक्राणु डीएनए / प्रोटीन agarose-50% घोल के साथ इनक्यूबेट गया अविशिष्ट पृष्ठभूमि को कम। प्रतिरक्षक अवक्षेपण तो विरोधी एनएफ-NB p65 के 5 एजी (अपस्टेट) या एंटीबॉडी के बिना (नकारात्मक नियंत्रण) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में किया गया था। ये supernatants 5 मोल / एल सोडियम क्लोराइड के साथ पूरक और प्रोटीन डीएनए क्रॉस-लिंक वापस लौटने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्म कर रहे थे। immunocomplexes आगे DNase- और RNase मुक्त proteinase कश्मीर के साथ इलाज किया गया था, और डीएनए फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और इथेनॉल वर्षा से शुद्ध किया गया था। पीसीआर विशिष्ट प्राइमरों मानव INOS जीन के प्रवर्तक क्षेत्र के भीतर एक दृश्य के लिए इसी के साथ किया गया (p1 प्राइमर: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 प्राइमर: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶)। (Doublier एट अल।, 2008)

EGFP-अभिव्यक्ति पढ़ाई

अभिव्यक्ति के अध्ययन, पुनः संयोजक तनाव एल tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (जेना बायोसाइंस, जर्मनी) EGFP (बढ़ी ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के लिए जीन के साथ के लिए, गुणसूत्र के रूप में पहले से वर्णित एकीकृत SSU, विभिन्न मीडिया में खेती की गई थी और इसके साथ ही 100 मिलीग्राम एल के साथ पूरक^-1 Nourseothricin (जेना बायोसाइंस, जर्मनी)। खेती के दौरान, 1 मिलीलीटर नमूने ले जाया गया, centrifuged (2000 × छ, 20 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) और 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ धोया। गोली बफर (20 मिमी HEPES, 5 मिमी EDTA, 2 मिमी डीटीटी) में resuspended और अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर के साथ sonification द्वारा विघटित किया गया था UP400S (ऊर्जा के आवेदन ~ 400 Ws)। 12.5% ​​polyacralamide जैल साथ Laemmli की विधि (1970) के अनुसार कम करने की शर्तों के तहत पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) - सेल मलबे centrifugation (6000 × छ, 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट) द्वारा हटा दिया और सोडियम dodecyl सल्फेट द्वारा विश्लेषण किया गया । EGFP-अभिव्यक्ति उत्तेजित संस्कृति में जांच की गई। (Fritsche एट अल। 2007)

क्रोमेटिन प्रतिरक्षक अवक्षेपण

क्रोमेटिन प्रतिरक्षक अवक्षेपण परख चिप आईटी का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था^टीएम एक्सप्रेस (सक्रिय मोटिफ, Carlsbad, सीए, यूएसए) कुछ संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार। संक्षेप में, विभेदित मानव podocytes पार से जुड़े थे कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1% formaldehyde के साथ। कोशिकाओं ठंडा पीबीएस के साथ बह गए और स्थिरीकरण प्रतिक्रिया कमरे के तापमान पर 0.125 एम 5 के लिए ग्लाइसिन मिनट जोड़कर रोक दिया गया। कोशिकाओं ठंडा पीबीएस के साथ फिर से धोया और पकवान से स्क्रेप किया गया। कोशिकाओं centrifugation द्वारा pelleted और lysis बफर में resuspended थे। centrifugation के बाद, pelleted नाभिक, बाल काटना बफर में resuspended थे 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट और क्रोमेटिन sonication, उदा sheared गया था UP100H (Hielscher Ultrasonics जीएमबीएच, टेल्टो, जर्मनी) 25% शक्ति पर 20 सेकंड प्रत्येक दालें बर्फ पर लगभग 200-600 बीपी के टुकड़ों में बर्फ पर। कतरनी क्रोमैटिन तब केन्द्रित किया गया था और सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था। Immunoprecipitations के लिए, क्रोमैटिन के 60 μl एस 1 (सांता क्रूज़ जैव प्रौद्योगिकी, सांता क्रूज़, सीए, यूएसए), एनएफ-κB पी 65 (एबैक, कैम्ब्रिज, यूके) या एनएफ-κB पी 50 (एबैक) एंटीबॉडी या खरगोश के साथ 1 μg के साथ सेते थे आईजीजी (ज़ीमेड लेबोरेटरीज, साउथ सैन फ्रांसिस्को, सीए, यूएसए), एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल रोटेशन के साथ। चुंबकीय मोतियों से बंधे इम्यूनोकॉम्प्लेक्स को चुंबकीय स्टैंड का उपयोग करके एकत्र किया गया था, जो बड़े पैमाने पर धोया गया था, और प्रोटीन / डीएनए क्रॉसलिंक्स को उलट दिया गया था और डीएनए रीयल-टाइम पीसीआर विश्लेषण के लिए eluted। (रिस्टोला एट अल। 200 9)

चिप सरणी विश्लेषण के लिए EHEC डीएनए तैयारी

सेल lysates और निकाले DNAs की व्यवस्था
बैक्टीरियल वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में निलंबित कर दिया छर्रों के साथ इलाज किया गया अल्ट्रासाउंड disruptor UP100H (Hielscher जीएमबीएच, जर्मनी) एक microtip एमएस 1 (व्यास में 1 मिमी) से लैस है। ऑपरेटिंग आवृत्ति 30 किलोहर्ट्ज़ थी और प्रभावी आउटपुट पावर 100 डब्ल्यू थी। ऑपरेशन के दौरान, बर्फ के पानी के स्नान, मिश्रित और केंद्रीकृत में नमूनों को ठंडा कर दिया गया था। नमूनों का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री अध्ययनों के लिए किया जाता था, जबकि बाद में हैंडलिंग के लिए, नमूने को गर्मी उपचार (95 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट) के अधीन किया गया था। क्रूड सेल lysates फिनोल के मिश्रण के साथ संसाधित किया गया था: क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब (25: 24: 1)। इस मिश्रण की एक समान मात्रा को लेटेट नमूने में जोड़ा गया था, समाधान को 15 डिग्री के लिए जोरदार रूप से भंवर किया गया था और कमरे के तापमान (आरटी) के आसपास 22 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 15,000 xg पर केंद्रित किया गया था। जीनोमिक डीएनए युक्त शीर्ष जलीय चरण सावधानी से अलग किया गया था और एक नई बाँझ Eppendorf ट्यूब में एकत्र किया गया था।
इसके बाद, नमूने डीएनए को टुकड़े करने के लिए sonicated थे। उपरोक्त वर्णित शर्तों में sonication कदम महसूस किया गया था। जीनोमिक डीएनए पर विखंडन प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, एग्रोस जील इलेक्ट्रोफोरोसिस का उपयोग करके नमूने का विश्लेषण किया गया था।
(…) 2.5 मिनट के लिए पहले sonicated नमूने गर्मी उपचार और centrifugation के बाद एक निष्कर्षण कदम के अधीन थे। जारी डीएनए को फिनोल के साथ दो बार निकाला गया था: क्लोरोफॉर्म: आईसोमाइल अल्कोहल मिश्रण, और बाद में 0 - 15 मिनट के लिए दूसरे sonication के अधीन। Agarose जेल electrophoresis का उपयोग पोस्ट निष्कर्षण अल्ट्रासोनिक विखंडन (शीर्ष दाएं तरफ अंजीर) के अधीन डीएनए के आकार वितरण निर्धारित करने के लिए किया गया था। अत्यधिक खंडित डीएनए उच्च-आणविक भार बैंड के बजाय डीएनए स्मीयर की उपस्थिति से स्पष्ट था जो कि 2.5 मिनट या उससे अधिक समय के लिए नमूने वाले नमूनों से हटा दिया गया था। लंबे समय तक sonication धीरे-धीरे टुकड़े की लंबाई को लगभग 150 - 600 बीपी तक कम कर देता है, और 15 मिनट के लिए sonication ने इन टुकड़ों को और गिरा दिया, जैसा ज्यादातर ज्यादातर धुंध के ऊपरी भाग से देखा जा सकता है। इस प्रकार, औसत डीएनए टुकड़ा आकार धीरे-धीरे अल्ट्रासोनिकेशन समय के साथ अस्वीकार कर दिया गया और 5 मिनट के उपचार को चिप सरणी assays के लिए सबसे उपयुक्त डीएनए टुकड़े के आकार प्राप्त करने की अनुमति दी। अंत में, डीएनए विश्लेषक तैयारी प्रक्रिया जिसमें अल्ट्रासोनिक उपचार, डीएनए निष्कर्षण (2 ×), और बाद के 5 मिनट के sonication के पहले 2 मिनट शामिल थे, की स्थापना की गई थी। (बेससेट एट अल। 2008)

Chromatin immunoprecipitation (चिप)

HEK293 कोशिकाओं को ऊपर वर्णित अनुसार सुधारा गया था और कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए 2 एमएम डिस्क्सीनिमिडिल-ग्लूटार्ट के साथ तय किया गया था। इसके बाद, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार धोया गया। क्रोमैटिन कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1% (वी / वी) फॉर्मल्डेहाइड का उपयोग करके क्रॉस-लिंक्ड किया गया था और बर्फ-ठंड पीबीएस के साथ दो बार धोया गया था। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.125 एम की अंतिम एकाग्रता पर ग्लिसिन के साथ ऊष्मायन द्वारा क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया रोक दी गई थी। ट्राप्सिन के साथ ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को सेल संस्कृति पकवान से हटा दिया गया और पीबीएस के साथ दो बार धोया गया। कोशिका गोली को लीस बफर (5 एमएम पाइप्स, पीएच 8.0, 85 एमएम केसीएल, और 0.5% (वी / वी) नॉनिडेट पी -40) में दोहराया गया था, 10 मिनट के लिए बर्फ पर उगाया गया था, और एक डाउंस होमोजेनाइज़र के साथ homogenized। इसके बाद, नाभिक को सेंट्रीफ्यूगेशन (3500 xg, 5 min, 4 डिग्री सेल्सियस) द्वारा पिलेट किया गया और नाभिक बफर (50 मिमी ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8.1, 10 मिमी ईडीटीए, और 1% (डब्ल्यू / वी) एसडीएस में पुन: प्रस्तुत किया गया। न्यूक्लियस में तीन 20-दालों के साथ sonication द्वारा बाधित किया गया था UP50H sonicator चक्र 0.5 की एक सेटिंग में (Hielscher ULTRASCHALL प्रौद्योगिकी) और 30% आयाम, 200 का एक थोक आकार के साथ जीनोमिक डीएनए टुकड़े उपज - 1000 बीपी। चिप के लिए, डीएनए के 50 ग्राम प्रतिरक्षक अवक्षेपण बफर (में 4 गुना पतला था 16.7 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8.1, 167 मिमी NaCl, 1.2 मिमी EDTA, 1.1% (v / v) ट्राइटन X-100, और 0.01% (w / v) एसडीएस)। (Weiske एट अल। 2006)

क्रोमेटिन प्रतिरक्षक अवक्षेपण द्वारा हिस्टोन संशोधन विश्लेषण (चिप)

संक्षेप में, 6 x 10⁶ कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार धोया गया था और 0.5% फॉर्मल्डेहाइड की उपस्थिति में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए संस्कृति प्लेट पर क्रॉस-लिंक्ड किया गया था। 0.125 एम ग्लाइसीन जोड़कर क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया रोक दी गई थी। सभी बाद के कदम 48 डिग्री सेल्सियस पर किए गए थे। सभी बफर पूर्व-ठंडा थे और प्रोटीज़ इनहिबिटर (पूर्ण मिनी, रोश) थे। कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार धोया गया था और फिर स्क्रैप किया गया था। एकत्रित छर्रों को 1 मिलीलीटर लीस बफर (1% एसडीएस, 5 एमएम ईडीटीए, 50 एमएम ट्राइस पीएच 8) में भंग कर दिया गया था और 10 चक्रों के लिए 100% आयाम पर ठंडा इथेनॉल स्नान में sonicated किया गया था UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, जर्मनी)। क्रोमेटिन विखंडन 1% agarose जेल में कल्पना की गई थी। प्राप्त टुकड़े 200-500pb रेंज में थे। घुलनशील क्रोमेटिन 48 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 14,000g पर sonicated नमूने centrifuging द्वारा प्राप्त हुई थी। घुलनशील अंश कमजोर पड़ने बफर में 1/10 पतला था (1% ट्राइटन X-100, 2 मिमी EDTA, 20 मिमी Tris पीएच 8, 150 मिमी NaCl) तो aliquoted और प्रयोग से पहले तक 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। (रोड्रिगेज एट अल। 2008)