अल्ट्रासोनिक DNA शीयरिंग

DNA और RNA की शीयरिंग के दौरान, लंबे DNA अणुओं को छोटे टुकड़ों में खंडित किया जाता है, जो अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) के लिए लाइब्रेरी निर्माण हेतु नमूने तैयार करने का एक महत्वपूर्ण चरण है। अल्ट्रासोनिक DNA शीयरिंग में ध्वनिक कैविटेशन बलों का उपयोग करके DNA या RNA को 100 bp से 5 kb तक के खंडों में तोड़ा जाता है। यह विधि खंडों के आकार पर सटीक नियंत्रण संभव बनाती है, जिससे सर्वोत्तम अनुक्रमण परिणामों के लिए DNA की वांछित लंबाई के अनुसार समायोजन करना आसान होता है।

अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा DNA शीयरिंग

Hielscher Ultrasonics DNA, RNA और क्रोमैटिन की शीयरिंग के लिए अल्ट्रासाउंड पर आधारित विभिन्न समाधान प्रदान करता है। माइक्रोटिप का उपयोग करके प्रत्यक्ष सोनिकेशन के लिए प्रोब प्रकार का अल्ट्रासोनिकेटर (जैसे UP100H) चुनें, या एक साथ विभिन्न नमूनों से अप्रत्यक्ष रूप से DNA तैयार करने के लिए VialTweeeter या अल्ट्रासोनिक cuphorn का उपयोग करें। Hielscher आपकी आवश्यकताओं को ध्यान में रखते हुए आदर्श उपकरण प्रदान करता है: चाहे आपके पास 1 नमूना हो या 10 तक नमूने हों, और आयतन माइक्रोलीटर से लेकर लीटर तक हों – Hielscher सोनिकेटर DNA, RNA और क्रोमैटिन के खंडों को सही लंबाई में तैयार करने की आपकी आवश्यकताओं को पूरा करेंगे। पुनरुत्पादकता, आसान संचालन और सटीक नियंत्रण अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए एक विश्वसनीय लाइब्रेरी तैयार करना संभव बनाते हैं।
एंज़ाइमी DNA खंडन के विपरीत, अल्ट्रासोनिक शीयरिंग में कोई रसायन मिलाए बिना केवल यांत्रिक अपरूपण बल लगाए जाते हैं। प्रक्रिया मापदंडों का सटीक समायोजन करके, अल्ट्रासोनिक शीयरिंग उच्च आणविक भार वाले DNA खंड (प्लाज़्मिड और जीनोमिक DNA) उत्पन्न करती है।
शुद्ध किए गए न्यूक्लिक अम्लों का प्रवर्धन खंडन चरण से पहले या बाद में किया जा सकता है।
सोनिकेशन के मापदंडों (शक्ति, पल्स चक्र / बर्स्ट, समय और तापमान) को सॉफ़्टवेयर सेटिंग्स के माध्यम से सुरक्षित रूप से नियंत्रित किया जा सकता है।

अल्ट्रासोनिक DNA शीयरिंग के प्रोटोकॉल

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन परीक्षण के लिए

संक्षेप में, कोशिकाओं को 60mm व्यास वाली डिशों (प्रति डिश 4,00,000) में प्लेट किया गया और RhoA siRNA से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया (जैसा वर्णित है); 72 h के बाद, प्रोटीनों को DNA से क्रॉस-लिंक करने के लिए उन्हें फ़ॉर्मल्डिहाइड (अंतिम सांद्रता, 1%) के साथ 37°C पर 10 min तक इन्क्यूबेट किया गया। 1.25 mol/L ग्लाइसिन के एक-दसवें आयतन को मिलाकर क्रॉस-लिंकिंग अभिक्रिया रोक दी गई, जिससे अंतिम सांद्रता 125 mmol/L हुई। कोशिकाओं को बर्फ जैसे ठंडे PBS से दो बार धोया गया, 1 mmol/L फ़ेनिलमेथिलसल्फ़ोनिल फ़्लोराइड, 1 Ag/mL एप्रोटिनिन और 1 Ag/mL पेपस्टैटिन A युक्त रेडियोइम्यूनोप्रेसिपिटेशन परीक्षण बफ़र [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.5% डीऑक्सीकोलेट, 0.1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)] में फिर से निलंबित किया गया और 30 min तक बर्फ पर रखा गया। इसके बाद, कोशिका लाइसेट का बर्फ पर एक Hielscher UP200S अल्ट्रासाउंड सोनिकेटर (3 x 40 s, आयाम 40%, चक्र 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) से सोनिकेशन किया गया, जब तक कि क्रॉस-लिंक किए गए क्रोमैटिन की शीयरिंग से 200 और 1,000 bp के बीच के DNA खंड प्राप्त नहीं हो गए। विभिन्न नमूनों में उपस्थित DNA की मात्रा निर्धारित करने के लिए संपूर्ण लाइसेट के दसवें भाग का उपयोग किया गया और इसे “कुल इनपुट DNA” माना गया। गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि को कम करने के लिए अधिप्लवकों को सैल्मन शुक्राणु DNA/प्रोटीन एगारोज़ की 50% स्लरी के साथ इन्क्यूबेट किया गया। इसके बाद 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) के साथ या एंटीबॉडी के बिना (ऋणात्मक नियंत्रण) 4°C पर रात भर इम्यूनोप्रेसिपिटेशन किया गया। इन अधिप्लवकों में 5 mol/L NaCl मिलाया गया और प्रोटीन-DNA क्रॉस-लिंक को उलटने के लिए उन्हें 65°C पर रात भर गर्म किया गया। इम्यूनोकॉम्प्लेक्सों को आगे DNase और RNase से मुक्त प्रोटीनेज़ K से उपचारित किया गया, और फ़ीनॉल/क्लोरोफ़ॉर्म निष्कर्षण तथा एथेनॉल अवक्षेपण द्वारा DNA को शुद्ध किया गया। मानव iNOS जीन के प्रमोटर क्षेत्र के भीतर स्थित एक अनुक्रम के अनुरूप विशिष्ट प्राइमरों के साथ PCR किया गया (p1 प्राइमर: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 प्राइमर: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶)। (Doublier et al., 2008)

EGFP अभिव्यक्ति अध्ययन

अभिव्यक्ति अध्ययनों के लिए, पुनःसंयोजक प्रभेद L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Germany), जिसमें EGFP (संवर्धित हरित प्रतिदीप्त प्रोटीन) का जीन क्रोमोसोमीय ssu में समेकित था, को पहले वर्णित विधि के अनुसार विभिन्न संवर्धन माध्यमों में उगाया गया और अतिरिक्त रूप से 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Germany) मिलाया गया। संवर्धन के दौरान, 1 ml नमूने लिए गए, अपकेंद्रित किए गए (2000 × g, 20°C, 10 min) और 0.9% NaCl विलयन से धोए गए। अवसाद को बफर (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) में पुनः निलंबित किया गया और सोनिकेशन द्वारा विघटित करने के लिए अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर UP400S का उपयोग किया गया (प्रयुक्त ऊर्जा ∼ 400 Ws)। कोशिकीय मलबे को अपकेंद्रीकरण (6000 × g, 4°C, 5 min) द्वारा हटाया गया और Laemmli (1970) की विधि के अनुसार अपचायक परिस्थितियों में 12.5% पॉलीएक्रिलामाइड जेल के साथ सोडियम डोडेसिल सल्फेट – पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (SDS-PAGE) द्वारा विश्लेषित किया गया। हिलाए जा रहे संवर्धन में EGFP की अभिव्यक्ति की जाँच की गई। (Fritsche et al. 2007)

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन परीक्षण के लिए ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) का उपयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार कुछ संशोधनों के साथ किया गया। संक्षेप में, विभेदित मानव पोडोसाइट्स को कमरे के तापमान पर 10 min के लिए 1% फॉर्मेल्डिहाइड से क्रॉस-लिंक किया गया। कोशिकाओं को बर्फ जैसे ठंडे PBS से धोया गया और कमरे के तापमान पर 5 min के लिए 0.125 M ग्लाइसिन मिलाकर स्थिरीकरण अभिक्रिया रोकी गई। कोशिकाओं को दोबारा बर्फ जैसे ठंडे PBS से धोया गया और डिश से खुरचकर निकाला गया। अपकेंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं का अवसाद बनाया गया और उन्हें लयन बफर में पुनः निलंबित किया गया। अपकेंद्रीकरण के बाद, अवसादित नाभिकों को अपरूपण बफर में पुनः निलंबित किया गया, बर्फ पर 30 min तक ऊष्मायित किया गया और सोनिकेशन द्वारा क्रोमैटिन का अपरूपण किया गया, उदाहरण के लिए UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germany) का उपयोग करके बर्फ पर 25% शक्ति पर, प्रत्येक 20 sec की 5 पल्स देकर लगभग 200–600 bp के खंड बनाए गए। इसके बाद अपरूपित क्रोमैटिन को अपकेंद्रित किया गया और अधिप्लावी एकत्र किया गया। इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के लिए, 60 μl क्रोमैटिन को 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) या NF-κB p50 (Abcam) एंटीबॉडी के साथ, अथवा ऋणात्मक नियंत्रण के रूप में खरगोश के IgG (Zymed Laboratories) के साथ, हल्के घूर्णन के तहत 4°C पर रात भर ऊष्मायित किया गया। चुंबकीय बीड्स से बँधे इम्यूनोकॉम्प्लेक्सों को चुंबकीय स्टैंड का उपयोग करके एकत्र किया गया, अच्छी तरह धोया गया, और प्रोटीन/DNA क्रॉस-लिंक उलट दिए गए तथा रियल-टाइम PCR विश्लेषण के लिए DNA को निक्षालित किया गया। (Ristola et al. 2009)

चिप ऐरे विश्लेषण के लिए EHEC DNA की तैयारी

कोशिका लयनों और निष्कर्षित DNA की व्यवस्था
वांछित अंतिम सांद्रता तक PBS में निलंबित जीवाणु अवसादों को अल्ट्रासाउंड विघटक UP100H (Hielscher GmbH, जर्मनी) से उपचारित किया गया, जो माइक्रोटिप MS1 (व्यास 1mm) से सुसज्जित था। संचालन आवृत्ति 30 kHz थी और प्रभावी आउटपुट शक्ति 100 W थी। संचालन के दौरान, नमूनों को बर्फ-पानी के स्नान में ठंडा किया गया, मिलाया गया और अपकेंद्रित किया गया। नमूनों का उपयोग फ्लो साइटोमेट्री अध्ययनों के लिए किया गया, जबकि बाद के कार्यों के लिए नमूनों को ऊष्मा उपचार (95°C, 5 min) दिया गया। अपरिष्कृत कोशिका लाइसेटों को फीनॉल:क्लोरोफॉर्म:आइसोएमाइल अल्कोहल (25:24:1) के मिश्रण से संसाधित किया गया। इस मिश्रण की समान मात्रा लाइसेट नमूने में मिलाई गई, विलयन को 15 s तक तीव्रता से वॉर्टेक्स किया गया और लगभग 22°C के कमरे के तापमान (RT) पर 15,000 x g पर 2 min तक अपकेंद्रित किया गया। जीनोमिक DNA युक्त ऊपरी जलीय परत को सावधानीपूर्वक अलग करके एक नई निर्जीवाणु Eppendorf ट्यूब में एकत्र किया गया।
इसके बाद, DNA को खंडित करने के लिए नमूनों का सोनिकेशन किया गया। सोनिकेशन चरण ऊपर वर्णित समान परिस्थितियों में किया गया। जीनोमिक DNA पर खंडन के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए, एगारोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण किया गया।
(…) जिन नमूनों का पहले 2.5 min तक सोनिकेशन किया गया था, उन्हें ऊष्मा उपचार और अपकेंद्रण के बाद निष्कर्षण चरण से गुज़ारा गया। मुक्त हुए DNA का फीनॉल:क्लोरोफॉर्म:आइसोएमाइल अल्कोहल मिश्रण से दो बार निष्कर्षण किया गया और उसके बाद 0 – 15 min तक दूसरी बार सोनिकेशन किया गया। निष्कर्षण के बाद अल्ट्रासोनिक खंडन किए गए DNA के आकार वितरण को निर्धारित करने के लिए एगारोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग किया गया (ऊपर दाईं ओर का चित्र)। उच्च आणविक भार वाले बैंडों के बजाय DNA स्मीयर की उपस्थिति से अत्यधिक खंडित DNA स्पष्ट था; ये बैंड 2.5 min या उससे अधिक समय तक सोनिकेशन किए गए नमूनों से समाप्त हो गए थे। अधिक समय तक सोनिकेशन करने से खंडों की लंबाई धीरे-धीरे घटकर लगभग 150 – 600 bp रह गई, और 15 min तक सोनिकेशन करने से ये खंड और अधिक विघटित हुए, जैसा कि मुख्यतः स्मीयर के ऊपरी भाग से देखा जा सकता है। इस प्रकार, अल्ट्रासोनिकेशन की अवधि बढ़ने के साथ DNA खंडों का औसत आकार धीरे-धीरे घटता गया और 5 min के उपचार से चिप ऐरे परीक्षणों के लिए सर्वाधिक उपयुक्त आकार के DNA खंड प्राप्त करना संभव हुआ। अंततः, DNA विश्लेष्य तैयार करने की प्रक्रिया स्थापित की गई, जिसमें पहले 2 min का अल्ट्रासोनिक उपचार, DNA निष्कर्षण (2×) और उसके बाद 5 min का सोनिकेशन शामिल था। (Basselet et al. 2008)

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (ChIP)

HEK293 कोशिकाओं को ऊपर वर्णित विधि से संवर्धित किया गया और कमरे के तापमान पर 45 min तक 2 mM डाइसक्सिनिमिडाइल-ग्लूटारेट से स्थिर किया गया। इसके बाद, कोशिकाओं को PBS से दो बार धोया गया। क्रोमैटिन को कमरे के तापमान पर 10 min तक 1% (v/v) फॉर्मेल्डिहाइड का उपयोग करके क्रॉस-लिंक किया गया और बर्फ जैसे ठंडे PBS से दो बार धोया गया। क्रॉस-लिंकिंग अभिक्रिया को रोकने के लिए कमरे के तापमान पर 5 min तक 0.125 M की अंतिम सांद्रता वाले ग्लाइसिन के साथ इनक्यूबेट किया गया। ट्रिप्सिन के साथ इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को कोशिका संवर्धन डिश से खुरचकर निकाला गया और PBS से दो बार धोया गया। कोशिका पेलेट को लयन बफर (5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl, और 0.5% (v/v) Nonidet P-40) में पुनः निलंबित किया गया, बर्फ पर 10 min तक इनक्यूबेट किया गया और Dounce होमोजेनाइज़र से समांगीकृत किया गया। इसके बाद, अपकेंद्रण (3500 x g, 5 min, 4 °C) द्वारा केंद्रकों का पेलेट बनाया गया और उन्हें केंद्रक बफर (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA, और 1% (w/v) SDS) में पुनः निलंबित किया गया। केंद्रकों को तीन 20-s पल्सों के साथ सोनिकेशन द्वारा विघटित किया गया; इसके लिए एक UP50H सोनिकेटर (Hielscher Ultraschall Technologie) का उपयोग चक्र 0.5 और आयाम 30% की सेटिंग पर किया गया, जिससे जीनोमिक DNA खंड प्राप्त हुए, जिनमें अधिकांश का आकार 200 – 1000 bp था। ChIP के लिए, 50g DNA को इम्यूनोप्रेसिपिटेशन बफर (16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% (v/v) Triton X-100, और 0.01% (w/v) SDS) में 4 गुना तनु किया गया। (Weiske et al. 2006)

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (ChIP) द्वारा हिस्टोन संशोधन का विश्लेषण

संक्षेप में, 6 x 10⁶ कोशिकाओं को PBS से दो बार धोया गया और 0.5% फ़ॉर्मल्डिहाइड की उपस्थिति में कमरे के तापमान पर 15 min तक कल्चर प्लेट पर क्रॉस-लिंक किया गया। 0.125 M ग्लाइसिन मिलाकर क्रॉस-लिंकिंग अभिक्रिया रोक दी गई। इसके बाद के सभी चरण 48°C पर किए गए। सभी बफ़र पहले से ठंडे किए गए थे और उनमें प्रोटीएज़ अवरोधक (Complete Mini, Roche) मौजूद थे। कोशिकाओं को PBS से दो बार धोया गया और फिर खुरचकर एकत्र किया गया। एकत्रित पेलेट को 1 ml लिसिस बफ़र (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) में घोला गया और ठंडे एथेनॉल बाथ में 100% आयाम पर 10 चक्रों तक उनका सोनिकेशन करने के लिए एक UP50H सोनिकेटर (Hielscher, Teltow, जर्मनी) का उपयोग किया गया। क्रोमैटिन के खंडन को 1% एगारोज़ जेल में देखा गया। प्राप्त खंडों का आकार 200–500pb की सीमा में था। सोनिकेशन किए गए नमूनों को 48°C पर 10 min तक 14,000g पर अपकेंद्रित करके घुलनशील क्रोमैटिन प्राप्त किया गया। घुलनशील अंश को तनुकरण बफ़र (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) में 1/10 तक तनु किया गया, फिर छोटे भागों में बाँटकर उपयोग तक 80°C पर संग्रहित किया गया। (Rodriguez et al. 2008)