अल्ट्रासोनिक डीएनए बाल काटना

• डीएनए और आरएनए कतरनी के दौरान, डीएनए अणु छोटे टुकड़ों में टूट जाते हैं। डीएनए / आरएनए विखंडन अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) के लिए पुस्तकालय बनाने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण नमूना प्रस्तुत करने के चरणों में से एक है।
• अल्ट्रासोनिक डीएनए कतरनी डीएनए या आरएनए को 100 के टुकड़ों में तोड़ने के लिए ध्वनिक गुहिकायन की ताकतों का उपयोग करता है – 5 केबी बीपी।
• अल्ट्रासोनिक बाल काटना सटीक डीएनए विखंडन और वांछित डीएनए लंबाई के अनुकूलन के लिए अनुमति देता है।

डीएनए बाल काटना अल्ट्रासोनिकेशन का उपयोग कर

Hielscher Ultrasonics डीएनए, आरएनए और क्रोमैटिन बाल काटना के लिए विभिन्न अल्ट्रासाउंड आधारित समाधान प्रदान करता है। एक माइक्रोटिप का उपयोग करके प्रत्यक्ष सोनीशन के लिए एक जांच-प्रकार अल्ट्रासोनिकेटर (जैसे UP100H) के बीच चुनें, या एक साथ विभिन्न नमूनों की अप्रत्यक्ष डीएनए तैयारी के लिए VialTweeeter या अल्ट्रासोनिक कपहॉर्न का उपयोग करें। Hielscher आपकी आवश्यकताओं पर विचार करते हुए आदर्श उपकरण प्रदान करता है: यदि आपके पास 1 या 10 नमूने हैं, तो माइक्रोलीटर से लीटर वॉल्यूम तक वॉल्यूम – Hielscher अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर सही लंबाई में डीएनए, शाही सेना और क्रोमैटिन टुकड़े तैयार करने के लिए अपनी आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए उपलब्ध हैं। प्रजनन क्षमता, आसान संचालन और सटीक नियंत्रण अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए एक विश्वसनीय पुस्तकालय की अनुमति देता है।
एंजाइमी डीएनए विखंडन के विपरीत, अल्ट्रासोनिक कतरनी किसी भी रसायन को जोड़ने के बिना शुद्ध यांत्रिक कतरनी बलों को लागू करती है। प्रक्रिया मापदंडों की सटीक सेटिंग से, अल्ट्रासोनिक बाल काटना उच्च आणविक भार डीएनए टुकड़े (प्लास्मिड और जीनोमिक डीएनए) पैदा करता है।
शुद्ध न्यूक्लिक एसिड को विखंडन चरण से पहले या बाद में प्रवर्धित किया जा सकता है।
सोनिकेशन पैरामीटर (पावर, पल्स चक्र / फटने, समय और तापमान) को सॉफ्टवेयर सेटिंग्स के माध्यम से सुरक्षित रूप से नियंत्रित किया जा सकता है।

अल्ट्रासोनिक डीएनए बाल काटना के लिए प्रोटोकॉल

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन परख के लिए

संक्षेप में, कोशिकाओं को 60 मिमी-व्यास व्यंजन (400,000 प्रति डिश) में चढ़ाया गया था और RhoA siRNA (जैसा कि वर्णित है) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था; 72 घंटे के बाद, उन्हें डीएनए में प्रोटीन को क्रॉस-लिंक करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए फॉर्मलाडेहाइड (अंतिम एकाग्रता, 1%) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया को 1.25 mol/L ग्लाइसिन की दसवें आयतन के अतिरिक्त बुझाया गया, जिससे 125 mmol / L अंतिम एकाग्रता मिली। कोशिकाओं को बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ दो बार धोया गया, रेडियोइम्यूनोप्रिपिटेशन परख बफर [150 मिमीलो / एल एनएसीएल, 1% एनपी 40, 0.5% डीऑक्सीकोलेट, 0.1% एसडीएस, 5 मिमीलो / एल ईडीटीए, 50 मिमीलो / एल ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0)] में पुन: निलंबित कर दिया गया जिसमें 1 मिमीलो / एल फेनिलमिथाइलसल्फोनील फ्लोराइड, 1 एजी / एमएल एप्रोटिनिन, और 1 एजी / एमएल पेप्स्टैटिन ए शामिल थे, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखा गया था। फिर, सेल lysates एक के साथ बर्फ पर sonicated थे Hielscher UP200S अल्ट्रासाउंड सोनिकेटर (3 x 40 एस, आयाम 40%, चक्र 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) जब तक क्रॉस-लिंक्ड क्रोमैटिन को 200 और 1,000 बीपी के बीच डीएनए टुकड़े उत्पन्न करने के लिए कतरनी नहीं दी गई थी। पूरे लाइसेट का दसवां हिस्सा विभिन्न नमूनों में मौजूद डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और माना जाता था “कुल इनपुट डीएनए”. सुपरनेटेंट को गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि को कम करने के लिए सैल्मन शुक्राणु डीएनए / प्रोटीन एगरोज़ -50% घोल के साथ इनक्यूबेट किया गया था। इम्यूनोप्रिपिटेशन तब रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 एजी एंटी-एनएफ-एनबी पी 65 (अपस्टेट) या एंटीबॉडी (नकारात्मक नियंत्रण) के बिना किया गया था। इन सतह पर तैरनेवाला 5 mol/L NaCl के साथ पूरक थे और प्रोटीन-डीएनए पार लिंक वापस करने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गरम किया गया. इम्यूनोकॉम्प्लेक्स को आगे डीनेज- और आरनेज-मुक्त प्रोटीनेज के साथ इलाज किया गया था, और डीएनए को फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और इथेनॉल वर्षा द्वारा शुद्ध किया गया था। पीसीआर मानव iNOS जीन के प्रमोटर क्षेत्र के भीतर एक अनुक्रम के अनुरूप विशिष्ट प्राइमरों के साथ किया गया था (p1 प्राइमर: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 प्राइमर: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶)। (डबलियर एट अल।

ईजीएफपी-अभिव्यक्ति अध्ययन

अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए, पुनः संयोजक तनाव L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (जेना बायोसाइंस, जर्मनी) EGFP (एन्हांस्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के लिए जीन के साथ, क्रोमोसोमल एसएसयू एकीकृत, विभिन्न मीडिया में खेती की गई थी जैसा कि पहले वर्णित है और इसके अतिरिक्त 100 मिलीग्राम एल के साथ पूरक है^-1 नोर्सोथ्रिसिन (जेना बायोसाइंस, जर्मनी)। खेती के दौरान, 1 मिलीलीटर नमूने लिए गए, अपकेंद्रित्र (2000 × ग्राम, 20 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) और 0.9% एनसीएल समाधान के साथ धोया गया। गोली बफर (20 मिमी HEPES, 5 मिमी EDTA, 2 मिमी DTT) में resuspended और अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर के साथ sonification द्वारा विघटित किया गया था यूपी400एस (ऊर्जा का अनुप्रयोग ∼ 400 Ws)। सेल मलबे centrifugation (6000 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट) द्वारा हटा दिया गया और सोडियम डोडेसिल सल्फेट द्वारा विश्लेषण - polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पृष्ठ) Laemmli की विधि के अनुसार शर्तों को कम करने के तहत (1970) 12.5% polyacralamide जैल के साथ. उत्तेजित संस्कृति में ईजीएफपी-अभिव्यक्ति की जांच की गई। (फ्रित्शे एट अल 2007)

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन परख चिप-आईटी का उपयोग करके किया गया था^टीएम एक्सप्रेस (सक्रिय मोटिफ, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) कुछ संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार। संक्षेप में, विभेदित मानव पोडोसाइट्स कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1% फॉर्मलाडेहाइड के साथ क्रॉस-लिंक किए गए थे। कोशिकाओं को बर्फ-ठंडा पीबीएस के साथ धोया गया था और कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 0.125 एम ग्लाइसिन जोड़कर निर्धारण प्रतिक्रिया को रोक दिया गया था। कोशिकाओं को फिर से बर्फ-ठंडे पीबीएस से धोया गया और डिश से स्क्रैप किया गया। कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गोली मार दी गई और लाइसिस बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, पेलेट नाभिक को कतरनी बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया, 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट किया गया और क्रोमैटिन को सोनिकेशन द्वारा कतरनी किया गया, उदा। यूपी100एच (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, जर्मनी) 25% शक्ति पर लगभग 200-600 बीपी के टुकड़ों में बर्फ पर प्रत्येक 20 सेकंड के 5 दालें। कतरनी क्रोमैटिन को तब सेंट्रीफ्यूज किया गया था और सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था। इम्यूनोप्रिपिटेशन के लिए, क्रोमैटिन के 60 माइक्रोन को एसपी 1 (सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, सांता क्रूज़, सीए, यूएसए), एनएफ-बी पी 65 (एबकैम, कैम्ब्रिज, यूके) या एनएफ-बी पी 50 (एबकैम) एंटीबॉडी के 1 माइक्रोग्राम के साथ इनक्यूबेट किया गया था या खरगोश आईजीजी (ज़िमेड लेबोरेटरीज, साउथ सैन फ्रांसिस्को, सीए, यूएसए) के साथ, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, कोमल रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात। चुंबकीय मोतियों से बंधे इम्यूनोकॉम्प्लेक्स को चुंबकीय स्टैंड का उपयोग करके एकत्र किया गया था, बड़े पैमाने पर धोया गया था, और प्रोटीन/डीएनए क्रॉसलिंक्स को उलट दिया गया था और वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के लिए डीएनए को हटा दिया गया था। (रिस्टोला एट अल 2009)

चिप सरणी विश्लेषण के लिए EHEC डीएनए तैयारी

सेल lysates और निकाले डीएनए की व्यवस्था
वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में निलंबित बैक्टीरियल छर्रों के साथ इलाज किया गया अल्ट्रासाउंड विघटनकारी UP100H (Hielscher GmbH, जर्मनी) एक माइक्रोटिप MS1 (व्यास में 1 मिमी) से लैस। ऑपरेटिंग आवृत्ति 30 kHz थी और प्रभावी आउटपुट पावर 100 W थी। ऑपरेशन के दौरान, नमूनों को बर्फ-पानी के स्नान में ठंडा किया गया, मिश्रित और अपकेंद्रित्र किया गया। नमूनों का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री अध्ययन के लिए किया गया था, जबकि बाद में हैंडलिंग के लिए, नमूनों को गर्मी उपचार (95 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट) के अधीन किया गया था। क्रूड सेल लाइसेट्स को फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोमिल अल्कोहल (25: 24: 1) के मिश्रण के साथ संसाधित किया गया था। इस मिश्रण की एक समान मात्रा को लाइसेट नमूने में जोड़ा गया था, समाधान को 15 एस के लिए सख्ती से भंवर किया गया था और 22 डिग्री सेल्सियस के आसपास कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 मिन के लिए 15,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। जीनोमिक डीएनए युक्त शीर्ष जलीय चरण को सावधानीपूर्वक अलग किया गया था और एक नए बाँझ एपडॉर्फ ट्यूब में एकत्र किया गया था।
इसके बाद, डीएनए को खंडित करने के लिए नमूनों को सोनिकेट किया गया। सोनिकेशन कदम को ऊपर वर्णित समान परिस्थितियों में महसूस किया गया था। जीनोमिक डीएनए पर विखंडन प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण किया गया था।
(…) 2.5 मिनट के लिए पहले sonicated नमूने गर्मी उपचार और centrifugation के बाद एक निष्कर्षण कदम के अधीन थे. जारी डीएनए एक फिनोल के साथ दो बार निकाला गया था: क्लोरोफॉर्म: आइसोमिल अल्कोहल मिश्रण, और बाद में 0 - 15 मिनट के लिए दूसरे सोनिकेशन के अधीन किया गया। Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के बाद निष्कर्षण अल्ट्रासोनिक विखंडन (छवि शीर्ष दाईं ओर) के अधीन डीएनए के आकार वितरण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. अत्यधिक खंडित डीएनए उच्च आणविक भार बैंड के बजाय डीएनए धब्बा की उपस्थिति से स्पष्ट था जो 2.5 मिनट या उससे अधिक समय तक सोनिकेट किए गए नमूनों से समाप्त हो गए थे। लंबे समय तक सोनिकेशन ने धीरे-धीरे टुकड़े की लंबाई को लगभग 150 - 600 बीपी तक कम कर दिया, और 15 मिनट के लिए सोनिकेशन ने इन टुकड़ों को और नीचा दिखाया, जैसा कि ज्यादातर स्मीयर के ऊपरी हिस्से द्वारा देखा जा सकता है। इस प्रकार, औसत डीएनए टुकड़ा आकार धीरे-धीरे अल्ट्रासोनिकेशन समय के साथ गिरावट आई और 5 मिनट के उपचार ने चिप सरणी परख के लिए सबसे उपयुक्त डीएनए टुकड़े के आकार प्राप्त करने की अनुमति दी। अंत में, डीएनए विश्लेषण तैयारी प्रक्रिया जिसमें अल्ट्रासोनिक उपचार के पहले 2 मिनट, डीएनए निष्कर्षण (2×), और बाद में 5 मिनट सोनिकेशन शामिल थे, स्थापित किया गया था। (बेसलेट एट अल 2008)

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन (ChIP)

HEK293 कोशिकाओं को ऊपर वर्णित के रूप में सुसंस्कृत किया गया था और कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए 2 एमएम डिस्यूसिनिमिडिल-ग्लूटारेट के साथ तय किया गया था। इसके बाद, कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धोया गया. क्रोमैटिन को 1% (वी / वी) फॉर्मलाडेहाइड का उपयोग करके कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए क्रॉस-लिंक किया गया था और बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ दो बार धोया गया था। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.125 एम की अंतिम एकाग्रता पर ग्लाइसिन के साथ इनक्यूबेशन द्वारा क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया को रोक दिया गया था। ट्रिप्सिन के साथ इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को सेल कल्चर डिश से स्क्रैप किया गया और पीबीएस के साथ दो बार धोया गया। सेल गोली lysis बफर (5 मिमी पाइप, पीएच 8.0, 85 मिमी KCl, और 0.5% (वी / वी) Nonidet पी -40) में resuspended किया गया था, 10 मिनट के लिए बर्फ पर incubated, और एक Dounce homogenizer के साथ homogenized. इसके बाद, नाभिक को सेंट्रीफ्यूजेशन (3500 x ग्राम, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) द्वारा गोली दी गई और नाभिक बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.1, 10 एमएम ईडीटीए, और 1% (डब्ल्यू / वी) एसडीएस) में फिर से निलंबित कर दिया गया। नाभिक को एक में तीन 20-s दालों के साथ sonication द्वारा बाधित किया गया था UP50H सोनिकेटर (Hielscher Ultraschall Technologie) चक्र 0.5 और आयाम 30% की एक सेटिंग पर, 200 - 1000 बीपी के थोक आकार के साथ जीनोमिक डीएनए टुकड़े उपज. ChIP के लिए, डीएनए के 50g immunoprecipitation बफर (16.7 मिमी Tris-HCl, पीएच 8.1, 167 मिमी NaCl, 1.2 मिमी EDTA, 1.1% (वी / v) ट्राइटन एक्स -100, और 0.01% (डब्ल्यू / वी) एसडीएस) में 4 गुना पतला था. (वीस्के एट अल 2006)

क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन (ChIP) द्वारा हिस्टोन संशोधन विश्लेषण

संक्षेप में, 6 x 10⁶ कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार धोया गया और 0.5% फॉर्मलाडेहाइड की उपस्थिति में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए संस्कृति प्लेट पर क्रॉस-लिंक किया गया। क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया 0.125 एम ग्लाइसिन जोड़कर रोक दी गई थी। बाद के सभी कदम 48 डिग्री सेल्सियस पर किए गए थे। सभी बफ़र्स पूर्व-ठंडा थे और इसमें प्रोटीज़ अवरोधक (पूर्ण मिनी, रोश) शामिल थे। कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धोया और फिर scraped थे. एकत्रित छर्रों को 1 मिलीलीटर lysis बफर (1% एसडीएस, 5 मिमी EDTA, 50 मिमी Tris पीएच 8) में भंग कर दिया गया था और एक का उपयोग कर 100% आयाम पर 10 चक्र के लिए एक ठंडा इथेनॉल स्नान में sonicated थे UP50H सोनिकेटर (Hielscher, Teltow, जर्मनी)। क्रोमैटिन विखंडन 1% agarose जेल में कल्पना की गई थी. प्राप्त टुकड़े 200-500pb रेंज में थे। घुलनशील क्रोमैटिन 48 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 14,000 ग्राम पर सोनिकेटेड नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करके प्राप्त किया गया था। घुलनशील अंश कमजोर पड़ने बफर (1% ट्राइटन एक्स -100, 2 मिमी EDTA, 20 मिमी Tris पीएच 8, 150 मिमी NaCl) में 1/10 पतला था, तो alicited और उपयोग तक 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. (रोड्रिगेज एट अल 2008)