सोनिकेशन से SARS-CoV-2 कोरोनावायरस के निष्क्रियकरण का प्रोटोकॉल

Hielscher VialTweeter एक अनूठी अल्ट्रासोनिक बहु-नमूना तैयारी इकाई है, जिसका उपयोग कोरोनावायरस SARS-COV-2 को निष्क्रिय करने के लिए किया जाता है। VialTweeter से एक साथ 10 तक नमूना वायल तैयार किए जा सकते हैं और इसलिए यह बड़ी संख्या में नमूनों के प्रसंस्करण के लिए आदर्श इकाई है।

VialTweeter से SARS-CoV-2 कोरोनावायरस का निष्क्रियकरण

स्थिरीकारक हटाने के बाद, कोशिकाओं को खुरचकर 1mL MEM/5% FBS में एकत्र करने से पहले एकल परतों को फॉस्फेट-बफरयुक्त लवणीय विलयन (PBS) से तीन बार धोया गया और (100% शक्ति और आयाम पर 3 × 10 सेकंड चालू, 10 सेकंड बंद) Hielscher के अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर UP200St के साथ VialTweeter अटैचमेंट का उपयोग करके सोनिकेट किया गया। अधिप्लवों को 3000 × g पर 10 मिनट तक अपकेंद्रित करके साफ किया गया। SARS-CoV-2 कोरोनावायरस के निष्क्रियकरण के लिए Welch et al. (2020) का पूरा प्रोटोकॉल नीचे पढ़ें:

कोशिकाएँ और वायरस

Vero E6 कोशिकाओं (Vero C1008; ATCC CRL-1586) को संशोधित ईगल का न्यूनतम आवश्यक माध्यम (MEM) में, 10% (v/v) भ्रूण गोवा सीरम (FCS) मिलाकर संवर्धित किया गया। प्रयुक्त वायरस SARS-CoV-2 का स्ट्रेन hCOV-19/England/2/2020 था, जिसे PHE ने UK में रोगियों के पहले समूह से 29/01/2020 को पृथक किया था। यह वायरस पैसेज 1 पर प्राप्त किया गया था और निष्क्रियकरण अध्ययनों में पैसेज 2 या 3 पर उपयोग किया गया।
SARS-CoV-2 के निष्क्रियकरण में प्रयुक्त अभिकर्मकों और रसायनों के साथ-साथ अभिकर्मकों की कोशिकाविषाक्तता दूर करने के बारे में कृपया Welch et al. (2020) की वैज्ञानिक रिपोर्ट देखें।

डिटर्जेंट द्वारा वायरस का निष्क्रियकरण – Welch et al. 2020 का SARS-CoV-2 कोरोनावायरस निष्क्रियकरण प्रोटोकॉल

SARS-CoV-2 का निष्क्रियकरण


वाणिज्यिक उत्पादों के लिए, वायरस तैयारियों (ऊतक संवर्धन द्रव, जिनके टाइटर 1 × 10⁶ से 1 × 10⁸ PFU/ml तक थे) को अभिकर्मकों से तीन प्रतिकृतियों में उपचारित किया गया। इसके लिए, जहाँ उपलब्ध थे, निर्माता के उपयोग निर्देशों में अनुशंसित सांद्रताओं और संपर्क अवधियों का उपयोग किया गया, या परीक्षण प्रयोगशालाओं द्वारा विशेष रूप से अनुरोधित सांद्रताओं और अवधियों का उपयोग किया गया। जहाँ निर्माता ने सांद्रताओं की कोई सीमा दी थी, वहाँ उत्पाद और नमूने के सबसे कम अनुपात का परीक्षण किया गया (अर्थात परीक्षण उत्पाद की सबसे कम अनुशंसित सांद्रता)। प्रतिदर्श परिवहन ट्यूब के अभिकर्मकों का परीक्षण ऊतक संवर्धन द्रव के एक आयतन और अभिकर्मक के दस आयतनों के अनुपात में किया गया, जब तक कि निर्माता ने नमूना द्रव और अभिकर्मक का कोई आयतन अनुपात निर्दिष्ट न किया हो। अपमार्जकों, स्थिरीकारकों और विलायकों का परीक्षण निर्दिष्ट सांद्रताओं पर निर्दिष्ट अवधियों के लिए किया गया। निष्क्रियकरण के सभी चरण परिवेशीय कमरे के तापमान (18 – 25°C) पर किए गए। वैकल्पिक नमूना प्रकारों के परीक्षण के लिए, निर्दिष्ट नमूना मैट्रिक्स में 1:9 के अनुपात में वायरस मिलाया गया, फिर ऊपर बताए अनुसार परीक्षण अभिकर्मकों से उपचारित किया गया। सभी प्रयोगों में तीन प्रतिकृतियों वाले छद्म-उपचारित नियंत्रण नमूने शामिल थे, जिनमें परीक्षण अभिकर्मक की जगह PBS का समतुल्य आयतन था। आवश्यक संपर्क अवधि के तुरंत बाद, उपचारित नमूने के 1mL को उपयुक्त रूप से चुने गए निस्यंदन मैट्रिक्स से प्रसंस्कृत किया गया। निष्क्रियकरण परीक्षण के लिए अभिकर्मक हटाने का कार्य बड़े स्पिन कॉलम प्रारूप में Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) का उपयोग करके, या 10mL क्षमता वाले खाली Pierce अपकेंद्रण कॉलमों (Thermo Fisher) में SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR या Sephadex LH-20 भरकर किया गया, ताकि पैक किए गए बीड्स/रेज़िन का आयतन 4mL हो। Amicon फ़िल्टरों से शुद्धिकरण के लिए, 2 × 500μl नमूनों को पहले वर्णित विधि के अनुसार दो अपकेंद्रीय फ़िल्टरों का उपयोग करके शुद्ध किया गया, फिर एक साथ मिलाया गया। फॉर्मल्डिहाइड तथा ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ फॉर्मल्डिहाइड को हटाने के लिए, 1× 500μl नमूना आयतन के साथ एक फ़िल्टर का उपयोग किया गया; प्रसंस्करण के बाद नमूने को 500μl PBS में पुनः निलंबित किया गया और 400ul MEM/5% FBS में मिलाया गया। संक्रमित एकस्तरीय कोशिका परतों के निष्क्रियकरण के लिए, 12.5 cm² वाले फ्लास्कों में Vero E6 कोशिकाएँ (2.5 × 10⁶ कोशिकाएँ/फ्लास्क, 2.5mL MEM/5% FBS में) ली गईं और MOI 0.001 पर संक्रमित कर 37°C/5% CO₂ पर 24 घंटे तक संवर्धित रखी गईं। अधिप्लावी द्रव (supernatant) हटा दिया गया और कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 15 या 60 मिनट तक 5mL फॉर्मल्डिहाइड, या फॉर्मल्डिहाइड और ग्लूटाराल्डिहाइड से स्थिर किया गया। स्थिरीकारक हटाने के बाद एकस्तरीय कोशिका परतों को PBS से तीन बार धोया गया, फिर कोशिकाओं को खुरचकर 1mL MEM/5% FBS में लिया गया तथा VialTweeter उपस्कर के साथ UP200St (Hielscher Ultrasound Technology) का उपयोग करके सोनिकेट किया गया (100% शक्ति और आयाम पर 3 × 10 सेकंड चालू, 10 सेकंड बंद)। अधिप्लावी द्रवों को 3000 × g पर 10 मिनट अपकेंद्रित करके स्पष्ट किया गया।


Welch et al. 2020 के प्रोटोकॉल के अनुसार अल्ट्रासोनिक VialTweeter से SARS-CoV-2 कोरोनावायरस के निष्क्रियकरण के लिए उपयोग किए गए अभिकर्मक का विवरण

Hielscher VialTweeter के उपयोग सहित पूरा प्रोटोकॉल यहाँ उपलब्ध है:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

परिष्कृत अल्ट्रासोनिक डिस्मेम्ब्रेटर और कोशिका विघटक

बहु-नमूना अल्ट्रासोनिकेटर VialTweeter जैविक, जैवरासायनिक और नैदानिक प्रयोगशालाओं में नमूना तैयारी के लिए उपलब्ध अनेक अल्ट्रासोनिक समाधानों में से एक है। Hielscher Ultrasonics आपके अनुप्रयोग के लिए आदर्श अल्ट्रासोनिक डिस्मेम्ब्रेटर प्रदान करता है, जैसे कोशिका लयन, कोशिका निष्कर्षण, ऊतक समांगीकरण, लाइसेट का विलेयीकरण, घोलना, नमूनों से गैस निकालना आदि।
हमें बताएँ कि आपको प्रति घंटे और प्रतिदिन कितने नमूने प्रसंस्कृत करने हैं, आप प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष सोनिकेशन में से किसे प्राथमिकता देते हैं और नमूनों के अल्ट्रासोनिक उपचार का उद्देश्य क्या है। हम आपके दैनिक कार्य के लिए सबसे उपयुक्त अल्ट्रासोनिक इकाई की अनुशंसा करेंगे!
Hielscher Ultrasonics के डिजिटल अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर स्मार्ट सॉफ़्टवेयर, स्वचालित डेटा रिकॉर्डिंग, तापमान नियंत्रण, सोनिकेशन अवधि और चक्र/पल्स मोड के लिए आसान पूर्व-सेटिंग विकल्पों के साथ-साथ नमूना प्रकाश व्यवस्था और ब्राउज़र के माध्यम से दूरस्थ नियंत्रण से सुसज्जित हैं। हम अपने अल्ट्रासोनिक उपकरणों को यथासंभव स्मार्ट बनाने का प्रयास करते हैं, ताकि आपका अनुसंधान और दैनिक कार्य यथासंभव सुविधाजनक और सफल हो।
VialTweeter से अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी के प्रोटोकॉल सहित अन्य अनुप्रयोगों की जानकारी के लिए यहाँ क्लिक करें!