अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा BL21 कोशिकाओं का सेल Lysis
बीएल 21 कोशिकाएं ई कोलाई का एक तनाव है जो प्रोटीन को अत्यधिक कुशल व्यक्त करने की उनकी क्षमता के कारण अनुसंधान प्रयोगशालाओं, जैव प्रौद्योगिकी और औद्योगिक उत्पादन में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान, lysis और प्रोटीन निष्कर्षण BL21 कोशिकाओं के सेलुलर इंटीरियर से लक्षित प्रोटीन को अलग करने और इकट्ठा करने के लिए आम तरीका है। अल्ट्रासोनिकेशन सेल को पूरी तरह से बाधित करता है और सभी फंसे हुए प्रोटीन को छोड़ता है, जिससे 100% प्रोटीन उपलब्ध होता है।
प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए BL21 कोशिकाएं
BL21 सेल एक रासायनिक रूप से सक्षम ई कोलाई जीवाणु तनाव है जो T7 RNA पोलीमरेज़-IPTG प्रेरण प्रणाली का उपयोग करके परिवर्तन और उच्च स्तरीय प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त है। BL21 कोशिकाएं किसी भी जीन की उच्च दक्षता वाली प्रोटीन अभिव्यक्ति की अनुमति देती हैं जो T7 प्रमोटर के नियंत्रण में होती है। कोलाई तनाव BL21 (DE3) एक T7 आरएनए पोलीमरेज़-आधारित प्रोटीन उत्पादन तनाव है जो T7 प्रमोटर-आधारित अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ संयुक्त है और पुनः संयोजक प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए प्रयोगशालाओं और उद्योग में व्यापक रूप से लागू होता है। BL21 (DE3) में, पुनः संयोजक प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले जीन की अभिव्यक्ति को क्रोमोसोमली एन्कोडेड T7 RNA पोलीमरेज़ (T7 RNAP) द्वारा स्थानांतरित किया जाता है, जो पारंपरिक E. coli RNAP की तुलना में आठ गुना तेजी से ट्रांसक्राइब करता है। यह तनाव BL21 (DE3) अत्यधिक कुशल बनाता है और इसे सबसे पसंदीदा प्रोटीन अभिव्यक्ति सेल सिस्टम में से एक में बदल देता है।
अल्ट्रासोनिक Lysis और BL21 कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल
BL21 कोशिकाओं का सेल लसीका ज्यादातर सोडियम लॉरॉयल सरकोसिनेट (जिसे सरकोसिल भी कहा जाता है) के साथ संयोजन में अल्ट्रासोनिकेशन का उपयोग करके लाइसिस बफर के रूप में किया जाता है। अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान और प्रोटीन निष्कर्षण के फायदे विश्वसनीयता, प्रजनन क्षमता के साथ-साथ अल्ट्रासोनिकेटर के सरल, सुरक्षित और तेजी से संचालन में निहित हैं। नीचे दिया गया प्रोटोकॉल अल्ट्रासोनिक BL21 सेल lysis के लिए चरण-दर-चरण दिशा देता है:
- चैपरोन प्रोटीन को हटाने के लिए, BL21 जीवाणु छर्रों को 50 मिलीलीटर बर्फ ठंडा सोडियम ट्रिस-ईडीटीए (एसटीई) बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0, 1 एमएम ईडीटीए, 150 एमएम एनएसीएल 100 एमएम पीएमएसएफ के साथ पूरक) में फिर से निलंबित कर दिया गया था।
- एमएल) के 500 उल जोड़े जाते हैं और कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट किया जाता है।
- बाद में, डीटीटी के 500 उल और सरकोसिल के 7 मिलीलीटर (एसटीई बफर में बने 10% (डब्ल्यू /
- सभी शुद्धिकरण बफ़र्स को बर्फ-ठंडा रखना और हर समय बर्फ पर नमूनों को बनाए रखना आवश्यक है। यदि संभव हो तो ठंडे कमरे में सभी शुद्धिकरण कदम उठाए जाने चाहिए।
- अल्ट्रासोनिक lysis और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, नमूने में sonicated रहे हैं VialTweeter MultiSample Ultrasonicator प्रत्येक सोनीशन के बीच 2 मिनट के अंतराल के साथ 100% आयाम पर 4 x 30 सेकंड के लिए। वैकल्पिक रूप से, माइक्रो-टिप के साथ एक जांच-प्रकार अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र उदा। यूपी200एचटी S26d2 (3 x 30 सेकंड, अल्ट्रासोनिक चक्रों के बीच 2 मिनट का ठहराव, 80% आयाम) के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।
- आगे शुद्धि चरणों के लिए, नमूनों को बर्फ पर रखा जाना चाहिए या वैकल्पिक रूप से -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए जब तक कि आगे की प्रक्रिया न हो।
अल्ट्रासोनिक सेल विघटनकारी UP200St लसीका और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए माइक्रो-टिप S26d2 के साथ
अल्ट्रासोनिक Lysis Prescise तापमान नियंत्रण के तहत
जैविक नमूनों को संभालते समय सटीक और विश्वसनीय तापमान नियंत्रण महत्वपूर्ण है। उच्च तापमान नमूनों में थर्मली-प्रेरित प्रोटीन गिरावट शुरू करते हैं।
सभी यांत्रिक नमूना तैयार करने की तकनीकों के रूप में, सोनिकेशन गर्मी पैदा करता है। हालांकि, VialTweeter का उपयोग करते समय नमूनों का तापमान अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है। हम आपको विश्लेषण के लिए VialTweeter और VialPress के साथ तैयार करते समय अपने नमूनों के तापमान की निगरानी और नियंत्रण करने के लिए विभिन्न विकल्प प्रस्तुत करते हैं।
- नमूना तापमान की निगरानी: अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर UP200St, जो वायलट्वीटर चलाता है, एक बुद्धिमान सॉफ्टवेयर और एक प्लग करने योग्य तापमान सेंसर से लैस है। तापमान संवेदक को UP200St में प्लग करें और नमूना ट्यूबों में से एक में तापमान संवेदक की नोक डालें। डिजिटल रंगीन टच प्रदर्शन के माध्यम से, आप अपने नमूना sonication के लिए एक विशिष्ट तापमान रेंज UP200St के मेनू में सेट कर सकते हैं. अधिकतम तापमान तक पहुंचने पर अल्ट्रासोनिकेटर स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा और तब तक रुकेगा जब तक कि नमूना तापमान निर्धारित तापमान ∆ के निचले मूल्य तक नीचे न हो जाए। फिर सोनिकेशन स्वचालित रूप से फिर से शुरू होता है। यह स्मार्ट फीचर गर्मी से प्रेरित गिरावट को रोकता है।
- VialTweeter ब्लॉक को प्री-कूल्ड किया जा सकता है। टाइटेनियम ब्लॉक को पूर्व-ठंडा करने के लिए फ्रिज या फ्रीजर में वायलट्वीटर ब्लॉक (ट्रांसड्यूसर के बिना केवल सोनोट्रोड!) डालें, नमूने में तापमान वृद्धि को स्थगित करने में मदद करता है। यदि संभव हो तो, नमूना स्वयं भी पूर्व-ठंडा किया जा सकता है।
- सोनिकेशन के दौरान ठंडा करने के लिए सूखी बर्फ का उपयोग करें। सूखी बर्फ से भरी उथली ट्रे का उपयोग करें और शीशियलट्वीटर को बर्फ पर रखें ताकि गर्मी तेजी से फैल सके।
दुनिया भर में ग्राहक जैविक, जैव रासायनिक, चिकित्सा और नैदानिक प्रयोगशालाओं में अपने दैनिक नमूना तैयार करने के काम के लिए वायलट्वीटर और वायलप्रेस का उपयोग करते हैं। बुद्धिमान सॉफ्टवेयर और UP200St प्रोसेसर के तापमान नियंत्रण, तापमान मज़बूती से नियंत्रित किया जाता है और गर्मी प्रेरित नमूना गिरावट से बचा जाता है। VialTweeter और VialPress के साथ अल्ट्रासोनिक नमूना तैयार करना अत्यधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करता है!
अपने Lysis अनुप्रयोग के लिए इष्टतम अल्ट्रासोनिक विघटनकर्ता खोजें
Hielscher Ultrasonics प्रयोगशालाओं, बेंच-टॉप और औद्योगिक पैमाने प्रणालियों के लिए उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक सेल विघटनकर्ताओं और homogenizers के लंबे समय से अनुभवी निर्माता है। आपके जीवाणु कोशिका संस्कृति का आकार, आपका शोध या उत्पादन लक्ष्य और प्रति घंटे या दिन प्रक्रिया करने के लिए सेल की मात्रा आपके आवेदन के लिए सही अल्ट्रासोनिक सेल विघटनकर्ता खोजने के लिए आवश्यक कारक हैं।
Hielscher Ultrasonics बहु-नमूनों (VialTweeter के साथ 10 शीशियों तक) और बड़े पैमाने पर नमूनों (यानी, UIP400MTP के साथ माइक्रोटिटर प्लेट्स / एलिसा प्लेट्स) के साथ-साथ क्लासिक जांच-प्रकार प्रयोगशाला अल्ट्रासोनिकेटर के साथ विभिन्न शक्ति स्तरों के साथ विभिन्न समाधान प्रदान करता है 50 से 400 वाट वाणिज्यिक सेल व्यवधान और बड़े उत्पादन में प्रोटीन निष्कर्षण के लिए प्रति यूनिट 16,000watts तक पूरी तरह से औद्योगिक अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर के लिए। सभी Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर पूर्ण भार के तहत 24/7/365 ऑपरेशन के लिए बनाए गए हैं। मजबूती और विश्वसनीयता हमारे अल्ट्रासोनिक उपकरणों की मुख्य विशेषताएं हैं।
सभी डिजिटल अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र स्मार्ट सॉफ्टवेयर, रंगीन टच डिस्प्ले और स्वचालित डेटा प्रोटोकॉल से लैस हैं, जो अल्ट्रासोनिक डिवाइस को प्रयोगशाला और उत्पादन सुविधाओं में एक सुविधाजनक कार्य उपकरण बनाते हैं।
हमें बताएं, किस तरह की कोशिकाएं, किस मात्रा, किस आवृत्ति के साथ और किस लक्ष्य के साथ आपको अपने जैविक नमूनों को संसाधित करना है। हम आपको आपकी प्रक्रिया आवश्यकताओं के लिए सबसे उपयुक्त अल्ट्रासोनिक सेल विघटनकर्ता की सिफारिश करेंगे।
नीचे दी गई तालिका आपको वाणिज्यिक अनुप्रयोगों के लिए औद्योगिक अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर के लिए कॉम्पैक्ट हाथ से आयोजित होमोजेनाइज़र और मल्टीसैम्पल अल्ट्रासोनिकेटर से हमारे अल्ट्रासोनिक सिस्टम की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:
| बैच वॉल्यूम | प्रवाह दर | अनुशंसित उपकरण |
|---|---|---|
| 96-अच्छी तरह से / माइक्रोटिटर प्लेट्स | एन.ए. | UIP400MTP |
| 10 शीशियों à 0.5 करने के लिए 1.5mL | एन.ए. | UP200St पर VialTweeter |
| 0.01 से 250mL | 5 से 100mL/मिनट | यूपी50एच |
| 0.01 से 500mL | 10 से 200mL/मिनट | यूपी100एच |
| 10 से 2000mL | 20 से 400mL/मिनट | यूपी200एचटी, UP400St |
| 0.1 से 20L | 0.2 से 4L/मिनट | यूआईपी2000एचडीटी |
| 10 से 100L | 2 से 10 लीटर/मिनट | यूआईपी4000एचडीटी |
| एन.ए. | 10 से 100 लीटर/मिनट | UIP16000 |
| एन.ए. | बड़ा | का क्लस्टर UIP16000 |
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UIP400MTP प्लेट सोनिकेटर 96-अच्छी प्लेटों में उच्च-थ्रूपुट सेल व्यवधान के लिए
अल्ट्रासोनिकेटर यूपी200एचटी छोटे नमूनों के sonication के लिए 2mm microtip S26d2 के साथ
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जानने के योग्य तथ्य
एस्चेरिचिया कोलाई बैक्टीरिया
एस्चेरिचिया कोलाई एक बैक्टीरिया प्रकार है, जो गैर-बीजाणु-गठन, ग्राम-नकारात्मक है और इसकी सीधी छड़ के रूप की विशेषता है। ई.कोलाई बैक्टीरिया मनुष्यों और जानवरों के पर्यावरण, खाद्य पदार्थों और आंतों में मौजूद होते हैं। कोलाई आमतौर पर पेरिट्रिचस फ्लैगेला का उपयोग करके मोटाइल होता है, लेकिन नॉनमोटाइल प्रकार भी होते हैं। कोलाई तथाकथित संकाय एनारोबिक केमोरोगोरोनोट्रोफ जीव हैं, जिसका अर्थ है कि वे श्वसन और किण्वन चयापचय दोनों में सक्षम हैं। अधिकांश ई.कोलाई प्रकार सौम्य होते हैं और शरीर में उपयोगी कार्यों को पूरा करते हैं, उदाहरण के लिए हानिकारक जीवाणु प्रजातियों के विकास को दबाना, विटामिन को संश्लेषित करना आदि।
तथाकथित बी प्रकार के एस्चेरिचिया कोलाई बैक्टीरिया सेल ई.कोलाई उपभेदों की एक विशेष श्रेणी है, जो बैक्टीरियोफेज संवेदनशीलता या प्रतिबंध-संशोधन प्रणाली जैसे तंत्र की जांच के लिए अनुसंधान में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, ई.कोलाई बैक्टीरिया जैव प्रौद्योगिकी और जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए विश्वसनीय वर्कहॉर्स के रूप में मूल्यवान हैं। उदाहरण के लिए, E.coli का उपयोग औद्योगिक पैमाने पर प्रोटीन और ऑलिगोसेकेराइड जैसे यौगिकों को संश्लेषित करने के लिए किया जाता है। प्रोटीज की कमी, ग्लूकोज के उच्च स्तर पर कम एसीटेट उत्पादन और बढ़ी हुई पारगम्यता जैसी विशिष्ट विशेषताओं के कारण, ई कोलाई बी कोशिकाएं आनुवंशिक रूप से इंजीनियर प्रोटीन के उत्पादन के लिए सबसे अधिक बार उपयोग की जाने वाली मेजबान कोशिकाएं हैं।
पुनः संयोजक प्रोटीन
पुनः संयोजक प्रोटीन (rProt) कई गुना शाखाओं में महत्वपूर्ण महत्व प्राप्त कर रहे हैं, रासायनिक उत्पादन, दवा, कॉस्मेटिक, मानव और पशु चिकित्सा, कृषि, खाद्य के साथ-साथ अपशिष्ट उपचार उद्योगों सहित।
पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक अभिव्यक्ति प्रणाली के उपयोग की आवश्यकता होती है। पुनः संयोजक डीएनए के उत्पादन के लिए सेल सिस्टम को व्यक्त करने के रूप में, प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक कोशिकाओं दोनों का उपयोग किया जा सकता है। जबकि बैक्टीरिया कोशिका का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सबसे व्यापक रूप से किया जाता है, जैसे कि कम लागत, आसान मापनीयता और सरल मीडिया की स्थिति, स्तनधारी, खमीर, शैवाल, कीट और सेल-मुक्त सिस्टम स्थापित विकल्प हैं। प्रोटीन प्रकार, कार्यात्मक गतिविधि, साथ ही व्यक्त प्रोटीन की आवश्यक उपज प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिका प्रणाली के चयन को प्रभावित करती है।
पुनः संयोजक प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए, एक विशेष कोशिका को पुनः संयोजक डीएनए के टेम्पलेट वाले डीएनए वेक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जाना चाहिए। टेम्पलेट के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को तब सुसंस्कृत किया जाता है। सेलुलर तंत्र के परिणामस्वरूप, कोशिकाएं ब्याज की प्रोटीन को स्थानांतरित और अनुवाद करती हैं, जिससे लक्षित प्रोटीन का उत्पादन होता है।
चूंकि व्यक्त प्रोटीन सेलुलर मैट्रिक्स में फंस जाते हैं, इसलिए प्रोटीन को छोड़ने के लिए सेल को lysed (बाधित और टूटा हुआ) होना चाहिए। बाद के शुद्धिकरण चरण में, प्रोटीन को अलग और शुद्ध किया जाता है।
उपचार में इस्तेमाल किया जाने वाला पहला पुनः संयोजक प्रोटीन 1982 में पुनः संयोजक मानव इंसुलिन था। आज, चिकित्सा उपचार के लिए दुनिया भर में 170 से अधिक प्रकार के पुनः संयोजक प्रोटीन का उत्पादन किया जाता है। आमतौर पर दवा में उपयोग किए जाने वाले पुनः संयोजक प्रोटीन उदाहरण के लिए पुनः संयोजक हार्मोन, इंटरफेरॉन, इंटरल्यूकिन, विकास कारक, ट्यूमर नेक्रोसिस कारक, रक्त के थक्के कारक, थ्रोम्बोलाइटिक दवाएं, और मधुमेह, बौनापन, रोधगलन, कंजेस्टिव दिल की विफलता, सेरेब्रल एपोप्लेक्सी, मल्टीपल स्केलेरोसिस, न्यूट्रोपेनिया, थ्रोम्बोसाइटोपेनिया, एनीमिया, हेपेटाइटिस, संधिशोथ, अस्थमा, क्रोहन रोग और कैंसर उपचार जैसी प्रमुख बीमारियों के इलाज के लिए एंजाइम हैं। (सीएफ. फुक वी. फाम, ओमिक्स टेक्नोलॉजीज एंड बायो-इंजीनियरिंग, 2018 में)
साहित्य/सन्दर्भ
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonicator 10 नमूनों के एक साथ sonication के लिए, उदाहरण के लिए BL21 कोशिकाओं को बाधित करने के लिए
उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक्स! Hielscher की उत्पाद श्रृंखला पूर्ण औद्योगिक अल्ट्रासोनिक सिस्टम के लिए बेंच-टॉप इकाइयों पर कॉम्पैक्ट लैब अल्ट्रासोनिकेटर से पूर्ण स्पेक्ट्रम को कवर करती है।