अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा BL21 कोशिकाओं की सेल लाइसिस
BL21 कोशिकाओं ई. कोलाई का एक तनाव है कि व्यापक रूप से अनुसंधान प्रयोगशालाओं, जैव प्रौद्योगिकी और औद्योगिक उत्पादन में उनकी क्षमता के कारण प्रोटीन अत्यधिक कुशल व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान, लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण BL21 कोशिकाओं के सेलुलर इंटीरियर से लक्षित प्रोटीन को अलग करने और एकत्र करने का आम तरीका है। अल्ट्रासोनिकेशन कोशिका को पूरी तरह से बाधित करता है और सभी फंसे हुए प्रोटीन को जारी करता है, जिससे प्रोटीन का 100% उपलब्ध होता है।
प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए BL21 कोशिकाएं
BL21 सेल एक रासायनिक रूप से सक्षम ई. कोलाई बैक्टीरियल तनाव है जो T7 आरएनए पॉलीमरेज-आईपीटीजी प्रेरण प्रणाली का उपयोग करके परिवर्तन और उच्च स्तरीय प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त है। BL21 कोशिकाएं किसी भी जीन की उच्च दक्षता वाले प्रोटीन अभिव्यक्ति की अनुमति देती हैं जो T7 प्रमोटर के नियंत्रण में है। ई. कोलाई तनाव BL21 (DE3) T7 प्रमोटर आधारित अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ संयुक्त एक T7 आरएनए पॉलीमरेज आधारित प्रोटीन उत्पादन तनाव है और व्यापक रूप से प्रयोगशालाओं और उद्योग में लागू करने के लिए recombinant प्रोटीन का उत्पादन है । BL21 (DE3) में, पुनर्संयोजन प्रोटीन को एन्कोडिंग जीन की अभिव्यक्ति क्रोमोसोमली इनकोडेड टी 7 आरएनए पॉलीमरेज (T7 आरएनएपी) द्वारा लिखित है, जो पारंपरिक ई. कोलाई आरएनएपी की तुलना में आठ गुना तेजी से टाइप करता है। यह तनाव BL21 (DE3) अत्यधिक कुशल बनाता है और सबसे पसंदीदा प्रोटीन अभिव्यक्ति सेल प्रणालियों में से एक में बदल जाता है ।
BL21 कोशिकाओं से अल्ट्रासोनिक लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल
BL21 कोशिकाओं की सेल लाइसिस ज्यादातर सोडियम लॉरॉयल सरकोसिनेट (जिसे सरकोसिल के रूप में भी जाना जाता है) के साथ संयोजन में अल्ट्रासोनिकेशन का उपयोग करके लाइसिस बफर के रूप में किया जाता है। अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान और प्रोटीन निष्कर्षण के फायदे विश्वसनीयता, प्रजनन क्षमता के साथ-साथ अल्ट्रासोनिकेटर के सरल, सुरक्षित और तेजी से संचालन में झूठ बोलते हैं। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल अल्ट्रासोनिक BL21 सेल लाइसिस के लिए कदम-दर-कदम दिशा देता है:
- चैपरवन प्रोटीन को हटाने के लिए, BL21 बैक्टीरियल छर्रों को 50 मिलीलीटर बर्फ ठंडे सोडियम ट्राइस-ईडीए (एसटीई) बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0, 1 एमएम ईडीटीए, 150 एमएमएल एनएसीएल 100 mm PMSF के साथ पूरक) में फिर से निलंबित कर दिया गया था।
- lysozyme (10 मिलीग्राम/मिलीलीटर) के ५०० उल जोड़ा जाता है और कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेटेड किया जाता है ।
- बाद में, डीटीटी के 500 उल और 7 मिलीलीटर सरकोसिल (एसटीई बफर में बने 10% (w/v) जोड़े जाते हैं।
- यह सभी शुद्धि बफ़र्स बर्फ ठंडा रखने के लिए और बर्फ पर हर समय नमूनों को बनाए रखने के लिए आवश्यक है । यदि संभव हो तो कोल्ड रूम में सभी शुद्धि कदम उठाए जाने चाहिए।
- अल्ट्रासोनिक लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, नमूनों में ध्वनियुक्त कर रहे हैं VialTweeter मल्टीसैंपल अल्ट्रासोनिकेटर प्रत्येक सोनीसेशन के बीच 2 मिनट के अंतराल के साथ 100% आयाम पर 4 x 30 सेकंड के लिए। वैकल्पिक रूप से, माइक्रो-टिप के साथ एक जांच-प्रकार अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइजर जैसे, UP200Ht S26d2 (3 x 30 सेकंड, 2 मिनट अल्ट्रासोनिक चक्र, 80% आयाम के बीच ठहराव) के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।
- आगे शुद्धिकरण चरणों के लिए, नमूनों को बर्फ पर रखा जाना चाहिए या वैकल्पिक रूप से आगे की प्रक्रिया तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
अल्ट्रासोनिक सेल बाधित UP200St लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए माइक्रो-टिप S26d2 के साथ
पूर्वतक तापमान नियंत्रण के तहत अल्ट्रासोनिक लाइसिस
जैविक नमूनों को संभालते समय सटीक और विश्वसनीय तापमान नियंत्रण महत्वपूर्ण है। उच्च तापमान नमूनों में थर्मल-प्रेरित प्रोटीन क्षरण शुरू करते हैं।
सभी यांत्रिक नमूना तैयारी तकनीकों के रूप में, सोनीशन गर्मी पैदा करता है। हालांकि, VialTweeter का उपयोग करते समय नमूनों के तापमान को अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है। हम आपको विश्लेषण के लिए VialTweeter और VialPress के साथ तैयार करते हुए अपने नमूनों के तापमान की निगरानी और नियंत्रण के लिए विभिन्न विकल्प प्रस्तुत करते हैं।
- नमूना तापमान की निगरानी: अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर UP200St, जो VialTweeter ड्राइव, एक बुद्धिमान सॉफ्टवेयर और एक खामियों को दूर करने योग्य तापमान सेंसर से सुसज्जित है । UP200St में तापमान सेंसर प्लग और नमूना ट्यूबों में से एक में तापमान सेंसर की नोक डालें। डिजिटल रंगीन टच-डिस्प्ले के माध्यम से, आप अपने नमूने के लिए एक विशिष्ट तापमान सीमा UP200St के मेनू में सेट कर सकते हैं। अधिकतम तापमान पहुंचने और तब तक रुकने पर अल्ट्रासोनिकेटर स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा जब तक कि नमूना तापमान ∆ सेट तापमान के कम मूल्य तक नहीं नीचे हो जाता है। इसके बाद सोनिकेशन अपने आप फिर से शुरू हो जाता है। यह स्मार्ट फीचर हीट-प्रेरित दुर्गति को रोकता है।
- VialTweeter ब्लॉक पूर्व ठंडा किया जा सकता है। वियलट्वीटर ब्लॉक (केवल ट्रांसड्यूसर के बिना सोनोट्रोड!) फ्रिज या फ्रीजर में टाइटेनियम ब्लॉक को प्री-कूल करने के लिए लें, नमूने में तापमान वृद्धि को स्थगित करने में मदद करता है। यदि संभव हो, तो नमूना खुद को प्री-कूल भी किया जा सकता है।
- सोनीशन के दौरान ठंडा करने के लिए सूखी बर्फ का प्रयोग करें। सूखी बर्फ से भरी उथली ट्रे का इस्तेमाल करें और शीशी पर बर्फ पर रखें ताकि गर्मी तेजी से नष्ट हो सके।
दुनिया भर में ग्राहक जैविक, जैव रासायनिक, चिकित्सा और नैदानिक प्रयोगशालाओं में अपने दैनिक नमूना तैयारी के काम के लिए VialTweeter और VialPress का उपयोग करते हैं। UP200St प्रोसेसर के बुद्धिमान सॉफ्टवेयर और तापमान नियंत्रण, तापमान मज़बूती से नियंत्रित है और गर्मी प्रेरित नमूना गिरावट से बचा है । VialTweeter और VialPress के साथ अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी अत्यधिक विश्वसनीय और प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करता है!
अपने Lysis आवेदन के लिए इष्टतम अल्ट्रासोनिक बाधित का पता लगाएं
Hielscher Ultrasonics प्रयोगशालाओं, बेंच-टॉप और औद्योगिक पैमाने पर प्रणालियों के लिए उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक सेल बाधित और समरूपता के लंबे समय से अनुभवी निर्माता है। आपका बैक्टीरियल सेल संस्कृति का आकार, आपका शोध या उत्पादन लक्ष्य और प्रति घंटे या दिन प्रक्रिया करने के लिए सेल की मात्रा आपके आवेदन के लिए सही अल्ट्रासोनिक सेल बाधित खोजने के लिए आवश्यक कारक हैं।
Hielscher Ultrasonics बहु नमूनों के एक साथ सोनीफिकेशन के लिए विभिन्न समाधान प्रदान करता है (VialTweeter के साथ 10 शीशियों तक) और बड़े पैमाने पर नमूने (यानी, UIP400MTP के साथ माइक्रोटिटर प्लेटें/एलिसा प्लेटें), साथ ही क्लासिक जांच प्रकार प्रयोगशाला अल्ट्रासोनिकेटर ५० से ४०० वाट के लिए विभिन्न शक्ति के स्तर के साथ पूरी तरह से औद्योगिक अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर के साथ वाणिज्यिक सेल व्यवधान और बड़े उत्पादन में प्रोटीन निष्कर्षण के लिए 16,000वाट प्रति इकाई तक । सभी Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर पूर्ण भार के तहत 24/7/365 आपरेशन के लिए बनाया गया है । मजबूती और विश्वसनीयता हमारे अल्ट्रासोनिक उपकरणों की मुख्य विशेषताएं हैं।
सभी डिजिटल अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइजर स्मार्ट सॉफ्टवेयर, रंगीन टच डिस्प्ले और ऑटोमैटिक डेटा प्रोटोकॉललिंग से लैस हैं, जो अल्ट्रासोनिक डिवाइस को लैब और उत्पादन सुविधाओं में एक सुविधाजनक काम उपकरण बनाते हैं ।
आइए जानते हैं, किस तरह की कोशिकाएं, किस मात्रा में, किस आवृत्ति के साथ और किस लक्ष्य के साथ आपको अपने जैविक नमूनों को संसाधित करना है। हम आपको अपनी प्रक्रिया आवश्यकताओं के लिए सबसे उपयुक्त अल्ट्रासोनिक सेल बाधित करने की सलाह देंगे।
नीचे दी गई तालिका आपको वाणिज्यिक अनुप्रयोगों के लिए औद्योगिक अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर के लिए कॉम्पैक्ट हैंड-हेल्ड होमोजेनाइजर्स और मल्टीसैंपल अल्ट्रासोनिकेटर से हमारे अल्ट्रासोनिक सिस्टम की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:
| बैच वॉल्यूम | प्रवाह की दर | अनुशंसित उपकरणों |
|---|---|---|
| 96-अच्छी तरह से/ | एन.ए. | यूआईपी400एमटीपी |
| 10 शीशियां à 0.5 से 1.5mL | एन.ए. | UP200St पर VialTweeter |
| 0.01 से 250mL | 5 से 100mL/मिनट | UP50H |
| 0.01 से 500mL | 10 से 200 मील / मिनट | UP100H |
| 10 से 2000 मील | 20 से 400 एमएल / मिनट | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 से 20 एल | 0.2 से 4 एल / मिनट | UIP2000hdT |
| 10 से 100 एल | 2 से 10 एल / मिनट | UIP4000hdT |
| एन.ए. | 10 से 100 एल / मिनट | UIP16000 |
| एन.ए. | बड़ा | के समूह UIP16000 |
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ultrasonicator UP200Ht छोटे नमूनों के सोनीशन के लिए 2 मिमी माइक्रोटिप S26d2 के साथ
जानने के योग्य तथ्य
एस्चेरिचिया कोलाई बैक्टीरिया
एस्चेरिचिया कोलाई एक बैक्टीरिया प्रकार है, जो गैर-बीजाणु-बनाने वाला, ग्राम-नकारात्मक है और इसके रूप में सीधे रॉड की विशेषता है। ई. कोलाई बैक्टीरिया पर्यावरण, खाद्य पदार्थों, और मनुष्यों और जानवरों की आंतों में मौजूद हैं । ई. कोलाई आमतौर पर पेरिट्रिचस फ्लैगेला का उपयोग करके मोटिवल होता है, लेकिन गैर-आरामदायक प्रकार भी होते हैं। ई. कोलाई तथाकथित एनालायबिक केमोर्गानोट्रोफ जीव हैं, जिसका अर्थ है कि वे श्वसन और किण्वित चयापचय दोनों में सक्षम हैं। अधिकांश ई कोलाई प्रकार सौम्य होते हैं और शरीर में उपयोगी कार्यों को पूरा करते हैं, जैसे हानिकारक जीवाणु प्रजातियों के विकास को दबाना, विटामिन आदि का संश्लेषण करना।
तथाकथित बी प्रकार के एस्चेरिचिया कोलाई बैक्टीरिया सेल ई.कोलाई उपभेदों की एक विशेष श्रेणी है, जो व्यापक रूप से अनुसंधान में बैक्टीरियोफेज संवेदनशीलता या प्रतिबंध संशोधन प्रणाली जैसे तंत्र की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, ई. कोलाई बैक्टीरिया जैव प्रौद्योगिकी और जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए विश्वसनीय workhorse के रूप में मूल्यवान हैं । उदाहरण के लिए, ई कोलाई का उपयोग औद्योगिक पैमाने पर प्रोटीन और ओलिगोसैकराइड जैसे यौगिकों को संश्लेषित करने के लिए किया जाता है। प्रोटीज की कमी, ग्लूकोज के उच्च स्तर पर कम एसीटेट उत्पादन, और बढ़ी हुई पारगम्यता जैसी विशिष्ट विशेषताओं के कारण, ई. कोलाई बी कोशिकाएं हैं जो आनुवंशिक रूप से इंजीनियर प्रोटीन के उत्पादन के लिए सबसे अधिक बार मेजबान कोशिकाओं का उपयोग करती हैं।
रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन
रासायनिक उत्पादन, फार्मास्यूटिकल, कॉस्मेटिक, मानव और पशु चिकित्सा, कृषि, खाद्य के साथ-साथ अपशिष्ट उपचार उद्योगों सहित कई गुना शाखाओं में पुनर्संयोजन प्रोटीन (आरप्रोटी) महत्वपूर्ण महत्व प्राप्त कर रहे हैं।
रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन के उत्पादन के लिए अभिव्यक्ति प्रणाली के उपयोग की आवश्यकता होती है। पुनर्संयोजन डीएनए के उत्पादन के लिए सेल सिस्टम व्यक्त करने के रूप में, प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक कोशिकाओं दोनों का उपयोग किया जा सकता है। जबकि बैक्टीरियल सेल का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सबसे व्यापक रूप से किया जाता है जैसे कि कम लागत, आसान स्केलेबिलिटी और सरल मीडिया की स्थिति, स्तनधारी, खमीर, शैवाल, कीट और सेल-मुक्त सिस्टम विकल्प स्थापित किए जाते हैं। प्रोटीन प्रकार, कार्यात्मक गतिविधि, साथ ही व्यक्त प्रोटीन की आवश्यक उपज प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिका प्रणाली के चयन को प्रभावित करती है।
रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए, एक विशेष कोशिका को डीएनए वेक्टर से संक्रमित किया जाना चाहिए जिसमें पुनः संयोजन डीएनए का टेम्पलेट होता है। टेम्पलेट से संक्रमित कोशिकाओं को फिर सुसंस्कृत किया जाता है। सेलुलर तंत्र के परिणामस्वरूप, कोशिकाएं रुचि के प्रोटीन को टाइप और अनुवाद करती हैं, जिससे लक्षित प्रोटीन का उत्पादन होता है।
चूंकि व्यक्त प्रोटीन सेलुलर मैट्रिक्स में फंस जाते हैं, इसलिए प्रोटीन को छोड़ने के लिए कोशिका को lysed (बाधित और टूटा हुआ) होना चाहिए। बाद के शुद्धिकरण चरण में, प्रोटीन को अलग और शुद्ध किया जाता है।
उपचार में उपयोग किया जाने वाला पहला रीकॉम्बिनेंट प्रोटीन 1 9 82 में मानव इंसुलिन को फिर से मिलाया गया था। आज, चिकित्सा उपचार के लिए दुनिया भर में 170 से अधिक प्रकार के पुनर्संयोजन प्रोटीन का उत्पादन किया जाता है। आमतौर पर दवा में उपयोग किए जाने वाले पुनः संयोजन प्रोटीन उदाहरण के लिए पुनः संयोजन हार्मोन, इंटरफेरॉन हैं, इंटरल्यूकिंस, विकास कारक, ट्यूमर परक्रोसिस कारक, रक्त का थक्का कारक, थ्रोम्बोलिटिक दवाएं, और मधुमेह, बौनापन, मायोकार्डियल इंफार्क्शन, कंजेस्टेटिव हार्ट फेलियर, सेरेब्रल एपोपेक्सी, मल्टीपल स्क्लेरोसिस, न्यूट्रोपेनिया, थ्रोम्बोसाइटोपेनिया, एनीमिया, हेपेटाइटिस, रूमाल गठिया, दमा, क्रोहन रोग, और कैंसर जैसे प्रमुख रोगों के इलाज के लिए एंजाइम। (सीएफ फुक वी फाम, ओमिक्स टेक्नोलॉजीज एंड बायो-इंजीनियरिंग, 2018 में)
साहित्य/संदर्भ
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
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