ELISA परीक्षणों के लिए अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी

ELISA जैसे परीक्षणों का व्यापक रूप से इन-विट्रो निदान, रोग-संबंधी प्रोटीन का पता लगाने और गुणवत्ता नियंत्रण (जैसे खाद्य एलर्जनों की निगरानी) के लिए उपयोग किया जाता है। अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी कोशिकाओं का लयन करने और अंतःकोशिकीय प्रोटीन, DNA, RNA तथा कोशिकांगों को पृथक करने की एक तीव्र, विश्वसनीय और पुनरुत्पादनीय तकनीक है। Hielscher Ultrasonics एकल नमूनों, कई वायलों तथा माइक्रोटाइटर प्लेटों और 96-वेल प्लेटों में नमूनों की सुविधाजनक तैयारी के लिए विभिन्न अल्ट्रासोनिक समाधान प्रदान करता है।

ELISA – एंज़ाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परीक्षण

ELISA का पूरा नाम एंज़ाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परीक्षण है और यह लिगैंड-बंधन परीक्षणों की श्रेणी की एक व्यापक रूप से प्रयुक्त जैवरासायनिक विश्लेषण तकनीक है। ELISA में, विशेष बंधन गुणों वाले एक स्थिर ठोस प्रावस्था पर तरल नमूना डाला जाता है। सामान्यतः, स्थिर ठोस प्रावस्था को वेल प्लेट या ELISA प्लेट पर लेप के रूप में लगाया जाता है। इसके बाद विभिन्न तरल अभिकर्मकों को क्रमिक रूप से मिलाया जाता है, ऊष्मायित किया जाता है और धोया जाता है, जिससे अंततः वेल में मौजूद अंतिम तरल में एक प्रकाशीय परिवर्तन (जैसे एंज़ाइमी अभिक्रिया के उत्पाद द्वारा रंग का विकास) होता है। इस प्रकाशीय परिवर्तन से तथाकथित मात्रात्मक “रीडिंग” द्वारा विश्लेष्य की मात्रा मापी जा सकती है। मात्रात्मक रीडिंग के लिए, पारगमित प्रकाश का पता लगाने और उसकी तीव्रता मापने हेतु स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, फ्लोरोमीटर या ल्यूमिनोमीटर का उपयोग किया जाता है। संसूचन की संवेदनशीलता विश्लेषणात्मक अभिक्रियाओं के दौरान संकेत के प्रवर्धन से प्रभावित होती है। चूँकि एंज़ाइमी अभिक्रियाएँ भली-भाँति अध्ययन की गई और विश्वसनीय प्रवर्धन प्रक्रियाएँ हैं, इसलिए संकेत उत्पन्न करने के लिए एंज़ाइमों का उपयोग किया जाता है। सटीक मात्रात्मक निर्धारण के लिए एंज़ाइमों को संसूचन अभिकर्मकों से निश्चित अनुपात में जोड़ा जाता है, जिससे “एंज़ाइम-लिंक्ड” इम्यूनोसॉर्बेंट परीक्षण नाम भी स्पष्ट होता है।
चूँकि ELISA परीक्षण माइक्रोटाइटर प्लेटों / 96-वेल प्लेटों में किए जाते हैं, इसलिए इसे प्लेट-आधारित परीक्षण तकनीक कहा जाता है और इसका उपयोग, उदाहरण के लिए, नैदानिक इन-विट्रो निदान, अनुसंधान, औषधि विकास आदि में एंटीबॉडी, पेप्टाइड, प्रोटीन और हार्मोन का पता लगाने और उनका मात्रात्मक निर्धारण करने के लिए किया जाता है।
ELISA तकनीक का उपयोग चिकित्सा, जैवप्रौद्योगिकी और पादप रोगविज्ञान में निदान के साधन के रूप में अक्सर किया जाता है और यह कई उद्योगों में गुणवत्ता नियंत्रण का एक महत्वपूर्ण मापन भी है।

ELISA से पहले अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी

ELISA परीक्षण करने से पहले, नमूनों की तैयारी के लिए कोशिका लयन और अंतःकोशिकीय प्रोटीन, DNA, RNA आदि के निष्कर्षण जैसे चरण आवश्यक होते हैं। अल्ट्रासोनिक कोशिका लयन और प्रोटीन पृथक्करण का लाभ इनकी उच्च दक्षता, विश्वसनीयता और पुनरुत्पादनीयता है। उच्च-गुणवत्ता वाले निदान और अनुसंधान परिणाम प्राप्त करने के लिए ये सभी कारक महत्वपूर्ण हैं

ELISA से पहले अल्ट्रासोनिक कोशिका लयन का प्रोटोकॉल

• कोशिका संवर्धनों के लिए: अल्ट्रासोनिक कोशिका लयन से पहले, कोशिकाओं को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 270 x g पर 5 mins तक अपकेंद्रित करें। ऊपरी द्रव को चूषण द्वारा हटाएँ और कोशिकाओं को 30 – 100 μL RIPA बफर में पुनः निलंबित करें। फिर कोशिका पेलेट को बर्फ पर 30 min तक ऊष्मायित करें।
• अब कोशिका नमूना अल्ट्रासोनिक लयन के लिए तैयार है:
  आपको जितने नमूने तैयार करने हैं, उनकी संख्या के अनुसार प्रोब-प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर (जैसे UP200Ht S26d2 प्रोब के साथ) या अल्ट्रासोनिक बहु-नमूना उपकरण (जैसे अधिकतम 10 वायलों के एक साथ सोनिकेशन के लिए VialTweeter या माइक्रोटाइटर प्लेटों / 96-वेल प्लेटों के लिए UIP400MPT) का उपयोग करें।
  एकल नमूने के प्रोब-प्रकार के सोनिकेशन के लिए, कोशिकाओं को 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में रखें।
• अल्ट्रासोनिकेटर के डिजिटल मेनू में अल्ट्रासोनिक उपचार की अवधि, कुल ऊर्जा इनपुट, चक्र मोड और/या तापमान सीमाएँ पहले से निर्धारित करें। इससे अत्यधिक विश्वसनीय सोनिकेशन और पुनरावर्तनीयता सुनिश्चित होती है।
• सोनोट्रोड डालें और अल्ट्रासोनिक उपकरण चालू करें। नमूने का समान रूप से सोनिकेशन करने के लिए अल्ट्रासोनिक प्रोब की माइक्रो-टिप को नमूने में धीरे-धीरे घुमाएँ।
  अधिकांश कोशिकाओं के लिए, 10 sec के सोनिकेशन के 2–4 चक्रों के बाद अल्ट्रासोनिक लयन पूरा हो जाएगा।
• सोनिकेशन के बाद, सोनोट्रोड को नमूने से निकालें। नमूनों को बर्फ पर 5 min तक इनक्यूबेट किया जाना चाहिए। फिर, मलबे का पेलेट बनाने के लिए 10,000 x g पर 20 min तक अपकेंद्रण करें। अधिप्लावी द्रवों को एक नई माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। विश्लेष्यों पर लेबल लगाएँ और -20°C पर संग्रहित करें।
• अल्ट्रासोनिक सोनोट्रोड को अल्कोहल से अच्छी तरह पोंछकर या अल्कोहल, जैसे 70% एथेनॉल, से भरे बीकर में उसका सोनिकेशन करके साफ किया जा सकता है। टाइटेनियम से बने सभी अल्ट्रासोनिक प्रोब ऑटोक्लेव किए जा सकते हैं।

• अतिरिक्त हीमोलाइज़्ड रक्त को पूरी तरह हटाने के लिए ऊतक को बर्फ जैसे ठंडे PBS (0.01M, pH=7.4) से धोएँ।
• ऊतक (गुर्दा, हृदय, फेफड़ा, प्लीहा आदि) का वजन लें और उसे मसलकर छोटे टुकड़ों में बाँटें, जिन्हें PBS में समांगीकृत किया जाता है। आवश्यक PBS की मात्रा ऊतक के वजन से संबंधित होती है। सामान्य अनुमान के अनुसार, 1g ऊतक के लिए लगभग 9mL PBS की आवश्यकता होती है। PBS में कुछ प्रोटीएज़ अवरोधक मिलाने की अनुशंसा की जाती है। (विकल्प के रूप में RIPA या प्रोटीएज़ और फॉस्फेटेज़ अवरोधक कॉकटेल युक्त हाइपोटोनिक लयन बफर का उपयोग किया जा सकता है।)
• ऊतक के आकार के आधार पर, ऊतक के पूर्व-उपचार के लिए संक्षिप्त वॉर्टेक्स उपचार (15 sec के स्पंदों में लगभग 1–2 min) सहायक हो सकता है।
• अपने अल्ट्रासोनिकेटर पर एक माइक्रो-टिप, जैसे S26d2, लगाएँ। ऊतक वाली नमूना ट्यूब को बर्फ के स्नान में रखें।
• अपने अल्ट्रासोनिकेटर, जैसे UP200St (80% आयाम), से नमूने का स्पंद मोड में 1 min तक सोनिकेशन करें (15sec चालू, 15sec विराम)। नमूने को बर्फ के स्नान में रखें।
• इसके बाद, विश्लेषण के लिए प्रोटीन को समृद्ध करने हेतु विशिष्ट अंश (साइटोसोलिक, नाभिकीय, माइटोकॉन्ड्रियल या लाइसोसोमल) प्राप्त करने के लिए होमोजेनेट का अपकेंद्रण किया जाता है। नमूने को 5000×g पर 5 मिनट तक अपकेंद्रित करके अधिप्लावी द्रव प्राप्त किया जाता है।

सोनिकेशन के दौरान विश्वसनीय तापमान नियंत्रण

तापमान प्रक्रिया को प्रभावित करने वाला एक निर्णायक कारक है, जो जैविक नमूनों के उपचार के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जैसे प्रोटीन के तापीय अपघटन को रोकने के लिए। नमूना तैयार करने की सभी यांत्रिक तकनीकों की तरह, सोनिकेशन से ऊष्मा उत्पन्न होती है। हालाँकि, Hielscher Ultrasonics के उपकरणों का उपयोग करते समय नमूनों के तापमान को अच्छी तरह नियंत्रित किया जा सकता है। हम आपके नमूनों को विश्लेषण से पहले प्रोब-प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर या VialTweeter से तैयार करते समय उनके तापमान की निगरानी और नियंत्रण के लिए विभिन्न विकल्प प्रस्तुत करते हैं।

1. नमूने के तापमान की निगरानी: सभी Hielscher डिजिटल अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर बुद्धिमान सॉफ्टवेयर और एक प्लग से जोड़े जा सकने वाले तापमान सेंसर से सुसज्जित हैं। तापमान सेंसर को अल्ट्रासोनिक उपकरण में प्लग करें (जैसे, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP) और तापमान सेंसर की नोक को किसी एक नमूना ट्यूब में डालें। डिजिटल रंगीन टच-डिस्प्ले के माध्यम से आप अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर के मेनू में अपने नमूने के सोनिकेशन के लिए एक विशिष्ट तापमान सीमा निर्धारित कर सकते हैं। अधिकतम तापमान पर पहुँचने पर अल्ट्रासोनिकेटर अपने आप रुक जाएगा और तब तक रुका रहेगा जब तक नमूने का तापमान निर्धारित तापमान ∆ के निचले मान तक नहीं आ जाता। फिर सोनिकेशन अपने आप दोबारा शुरू हो जाता है। यह बुद्धिमान सुविधा ऊष्मा के कारण होने वाले अपघटन को रोकती है।
2. अल्ट्रासोनिक बहु-नमूना इकाई VialTweeter में, नमूना ट्यूबों को थामने वाले टाइटेनियम ब्लॉक को पहले से ठंडा किया जा सकता है। टाइटेनियम ब्लॉक को पहले से ठंडा करने के लिए VialTweeter ब्लॉक (केवल सोनोट्रोड, ट्रांसड्यूसर के बिना!) को फ्रिज या फ्रीज़र में रखें; इससे नमूने के तापमान में वृद्धि को देर से होने में मदद मिलती है। यदि संभव हो, तो नमूने को भी पहले से ठंडा किया जा सकता है।
3. सोनिकेशन के दौरान ठंडा करने के लिए बर्फ के स्नान या शुष्क बर्फ का उपयोग करें। सोनिकेशन के दौरान अपनी नमूना ट्यूब(ट्यूबों) को बर्फ के स्नान में रखें। VialTweeter के लिए, शुष्क बर्फ से भरी एक उथली ट्रे का उपयोग करें और VialTweeter को शुष्क बर्फ पर रखें, ताकि ऊष्मा तेजी से निकल सके।

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