एलिसा परख के लिए अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी

एलिसा जैसे परख का व्यापक रूप से इन-विट्रो डायग्नोस्टिक्स, रोग से संबंधित प्रोटीन का पता लगाने और गुणवत्ता नियंत्रण (जैसे खाद्य एलर्जी की निगरानी) के लिए उपयोग किया जाता है। अल्ट्रासोनिक नमूना तैयार करना एक तेज़, विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक है जो सेल को लाइज़ करती है और इंट्रासेल्युलर प्रोटीन, डीएनए, आरएनए और ऑर्गेनेल को अलग करती है। Hielscher Ultrasonics एकल नमूने, कई शीशियों के साथ-साथ माइक्रोटिटर प्लेटों और 96-अच्छी प्लेटों की सुविधाजनक तैयारी के लिए विभिन्न अल्ट्रासोनिक समाधान प्रदान करता है।

एलिसा – एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख

एलिसा एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख के लिए खड़ा है और लिगैंड-बाइंडिंग परख की श्रेणी की व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली जैव रासायनिक विश्लेषण तकनीक है। एलिसा में, एक तरल नमूना विशेष बाध्यकारी गुणों के साथ एक स्थिर ठोस चरण पर जोड़ा जाता है। आम तौर पर, स्थिर ठोस चरण को एक अच्छी प्लेट या एलिसा प्लेट पर कोटिंग के रूप में लागू किया जाता है। फिर, विभिन्न तरल अभिकर्मकों को क्रमिक रूप से जोड़ा जाता है, ऊष्मायन किया जाता है, और धोया जाता है, ताकि अंत में एक ऑप्टिकल परिवर्तन (जैसे, एक एंजाइमी प्रतिक्रिया के उत्पाद द्वारा रंग विकास) कुएं में अंतिम तरल में होता है। ऑप्टिकल परिवर्तन एक तथाकथित मात्रात्मक द्वारा विश्लेषण की मात्रा को मापने की अनुमति देता है “पढ़ना"। मात्रात्मक पढ़ने के लिए, प्रेषित प्रकाश की तीव्रता का पता लगाने और मापने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, फ्लोरोमीटर या ल्यूमिनोमीटर का उपयोग किया जाता है। पता लगाने की संवेदनशीलता विश्लेषणात्मक प्रतिक्रियाओं के दौरान संकेत के प्रवर्धन से प्रभावित होती है। चूंकि एंजाइम प्रतिक्रियाओं की अच्छी तरह से जांच की जाती है और विश्वसनीय प्रवर्धन प्रक्रियाएं होती हैं, इसलिए संकेत बनाने के लिए एंजाइमों का उपयोग किया जाता है। एंजाइमों को सटीक मात्रा का ठहराव की अनुमति देने के लिए निश्चित अनुपात में पता लगाने वाले अभिकर्मकों से जोड़ा जाता है, जो "एंजाइम-लिंक्ड" इम्युनोसॉरबेंट परख नाम भी बताता है।
चूंकि एलिसा परख माइक्रोटिटर प्लेट्स/96-वेल प्लेटों में की जाती है, इसलिए इसे प्लेट-आधारित परख तकनीक के रूप में जाना जाता है और इसका उपयोग क्लिनिकल इन-विट्रो डायग्नोस्टिक, अनुसंधान, दवा विकास आदि में एंटीबॉडी, पेप्टाइड्स, प्रोटीन और हार्मोन का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
एलिसा तकनीक का उपयोग अक्सर चिकित्सा, बायोटेक, प्लांट पैथोलॉजी में नैदानिक उपकरण के रूप में किया जाता है और यह कई उद्योगों में एक महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण माप भी है।

एलिसा से पहले अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी

एलिसा परख का प्रदर्शन करने से पहले, नमूनों को सेल लसीका और इंट्रासेल्युलर प्रोटीन, डीएनए, आरएनए आदि के निष्कर्षण जैसे तैयारी के चरणों की आवश्यकता होती है। अल्ट्रासोनिक सेल लसीका और प्रोटीन अलगाव का लाभ इसकी उच्च दक्षता, विश्वसनीयता और प्रजनन क्षमता है। उच्च गुणवत्ता वाले निदान और शोध परिणाम प्राप्त करने के लिए ये सभी कारक महत्वपूर्ण हैं

प्री-एलिसा अल्ट्रासोनिक सेल लसीका के लिए प्रोटोकॉल

• सेल संस्कृतियों के लिए: अल्ट्रासोनिक सेल lysis से पहले, एक microcentrifuge में 270 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। आकांक्षा द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें और आरआईपीए बफर के 30 - 100 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। फिर, 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेल गोली सेते हैं.
• अब, सेल नमूना अल्ट्रासोनिक lysis के लिए तैयार है:
  एक जांच-प्रकार अल्ट्रासोनिकेटर का उपयोग करें (उदा। यूपी200एचटी S26d2 जांच के साथ) या एक अल्ट्रासोनिक बहु-नमूना डिवाइस (जैसे 10 शीशियों तक के एक साथ sonication के लिए VialTweeter या microtiter प्लेटों / 96-अच्छी प्लेटों के लिए UIP400MPT) आपको तैयार करने के लिए आवश्यक नमूनों की मात्रा के आधार पर।
  एक एकल नमूने की जांच-प्रकार sonication के लिए, कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में रखें।
• अल्ट्रासोनिकेटर के डिजिटल मेनू में अपनी अल्ट्रासोनिक अवधि, कुल ऊर्जा इनपुट, चक्र मोड और/या तापमान सीमा को पूर्व-निर्धारित करें। यह अत्यधिक विश्वसनीय sonication और repeatability सुनिश्चित करता है।
• सोनोट्रोड को इनसेट करें और अल्ट्रासोनिक डिवाइस को चालू करें। नमूना को समान रूप से sonicate करने के लिए नमूने के माध्यम से अल्ट्रासोनिक जांच के माइक्रो-टिप को धीरे से स्थानांतरित करें।
  अधिकांश कोशिकाओं के लिए, अल्ट्रासोनिक lysis 10 सेकंड sonication के 2 -4 चक्र के बाद पूरा हो जाएगा.
• सोनिकेशन के बाद, नमूने से सोनोट्रोड को हटा दें। नमूने 5 मिनट के लिए बर्फ पर ऊष्मायन किया जाना चाहिए. फिर, मलबे को गोली देने के लिए 20 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सुपरनेटेंट को एक नई माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। विश्लेषणों को लेबल करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
• अल्ट्रासोनिक सोनोट्रोड को शराब के साथ ठीक से पोंछकर या शराब से भरे बीकर में सोनीकेट करके साफ किया जा सकता है, जैसे 70% इथेनॉल। टाइटेनियम से बने सभी अल्ट्रासोनिक जांच आटोक्लेवबल हैं।

• अतिरिक्त हेमोलिसिस रक्त को अच्छी तरह से हटाने के लिए बर्फ-ठंडे पीबीएस (0.01 एम, पीएच = 7.4) के साथ ऊतक को कुल्ला।
• ऊतक (गुर्दे, हृदय, फेफड़े, प्लीहा आदि) का वजन करें और इसे छोटे टुकड़ों में मैक्रट करें, जो पीबीएस में समरूप हैं। आवश्यक पीबीएस की मात्रा ऊतक के वजन से संबंधित है। अंगूठे के एक नियम के रूप में, ऊतक के 1g को लगभग 9mL PBS की आवश्यकता होती है। पीबीएस में कुछ प्रोटीज अवरोधक जोड़ने की सिफारिश की जाती है। (आरआईपीए या हाइपोटोनिक लाइसिस बफर जिसमें प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल होता है, वैकल्पिक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है।
• ऊतक के आकार के आधार पर, एक छोटा भंवर उपचार (लगभग 1-2 मिनट 15 सेकंड दालों में) ऊतक के पूर्व-उपचार के लिए सहायक हो सकता है।
• एक माइक्रो-टिप माउंट करें, जैसे S26d2, अपने अल्ट्रासोनिकेटर पर। एक बर्फ स्नान में ऊतक के साथ नमूना ट्यूब रखें.
• अपने अल्ट्रासोनिकेटर के साथ नमूना सोनिकेट करें, उदाहरण के लिए UP200St (80% आयाम) पल्स मोड में 1 मिनट के लिए (15sec पर, 15sec रोकें)। बर्फ स्नान में नमूना रखें।
• होमोजेनेट्स को विश्लेषण के लिए प्रोटीन को समृद्ध करने के लिए विशिष्ट पूल (साइटोसोलिक, परमाणु, माइटोकॉन्ड्रियल या लाइसोसोमल) प्राप्त करने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। 5000×ग्राम पर 5 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र करके, सतह पर तैरनेवाला पुनः प्राप्त किया जाता है।

Sonication के दौरान विश्वसनीय तापमान नियंत्रण

तापमान एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया-प्रभावित कारक है जो जैविक नमूनों के उपचार के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए प्रोटीन के थर्मल क्षरण को रोकने के लिए। सभी यांत्रिक नमूना तैयार करने की तकनीकों के रूप में, सोनिकेशन गर्मी पैदा करता है। हालांकि, नमूने के तापमान अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है जब Hielscher Ultrasonics उपकरणों का उपयोग कर. हम आपको अपने नमूनों के तापमान की निगरानी और नियंत्रण के लिए विभिन्न विकल्प प्रस्तुत करते हैं, जबकि उन्हें जांच-प्रकार अल्ट्रासोनिकेटर या वायलट्वीटर के साथ पूर्व-विश्लेषणात्मक रूप से तैयार करते हैं।

1. नमूना तापमान की निगरानी: सभी Hielscher डिजिटल अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर एक बुद्धिमान सॉफ्टवेयर और एक प्लग करने योग्य तापमान सेंसर से लैस हैं। तापमान संवेदक को अल्ट्रासोनिक डिवाइस में प्लग करें (जैसे, यूपी200एचटी, यूपी200सेंट, वायलट्वीटर, मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP) और नमूना ट्यूबों में से एक में तापमान संवेदक की नोक डालें। डिजिटल रंगीन टच-डिस्प्ले के माध्यम से, आप अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर के मेनू में अपने नमूना सोनीशन के लिए एक विशिष्ट तापमान रेंज सेट कर सकते हैं। अधिकतम तापमान तक पहुंचने पर अल्ट्रासोनिकेटर स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा और तब तक रुकेगा जब तक कि नमूना तापमान निर्धारित तापमान ∆ के निचले मूल्य तक नीचे न हो जाए। फिर सोनिकेशन स्वचालित रूप से फिर से शुरू होता है। यह स्मार्ट फीचर गर्मी से प्रेरित गिरावट को रोकता है।
2. अल्ट्रासोनिक बहु-नमूना इकाई वायलट्वीटर के बारे में, टाइटेनियम ब्लॉक, जो नमूना ट्यूबों को पकड़ता है, को पूर्व-ठंडा किया जा सकता है। टाइटेनियम ब्लॉक को पूर्व-ठंडा करने के लिए फ्रिज या फ्रीजर में वायलट्वीटर ब्लॉक (ट्रांसड्यूसर के बिना केवल सोनोट्रोड!) डालें, नमूने में तापमान वृद्धि को स्थगित करने में मदद करता है। यदि संभव हो तो, नमूना स्वयं भी पूर्व-ठंडा किया जा सकता है।
3. सोनिकेशन के दौरान ठंडा करने के लिए बर्फ स्नान या सूखी बर्फ का उपयोग करें। एक बर्फ स्नान में sonication के दौरान अपने नमूना ट्यूब (ओं) रखें. वायलट्वीटर के लिए, सूखी बर्फ से भरी उथली ट्रे का उपयोग करें और वायलट्वीटर को सूखी बर्फ पर रखें ताकि गर्मी तेजी से फैल सके।

दुनिया भर में ग्राहक जैविक, जैव रासायनिक, चिकित्सा और नैदानिक प्रयोगशालाओं में अपने दैनिक नमूना तैयार करने के काम के लिए Hielscher जांच-प्रकार अल्ट्रासोनिकेटर के साथ-साथ बहु-नमूना सोनीशन इकाइयों VialTweeter और UIP400MTP का उपयोग करते हैं। बुद्धिमान सॉफ्टवेयर और Hielscher प्रोसेसर के तापमान नियंत्रण, तापमान मज़बूती से नियंत्रित किया जाता है और गर्मी प्रेरित नमूना गिरावट से बचा जाता है। Hielscher अल्ट्रासोनिक समाधान के साथ अल्ट्रासोनिक नमूना तैयार करना अत्यधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करता है!
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